Raccolta di dati microscopici di illuminazione criostruzionata da cellule conservate criogenicamente

NOTA: Questo protocollo riguarda campioni contenenti cellule coltivate o depositate su griglie d’oro piatto da 3 mm al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un film di supporto al carbonio bucato che sono state vetrificate mediante congelamento a immersione o congelamento ad alta pressione. Questo protocollo presuppone che i campioni siano già stati ripresi utilizzando un microscopio convenzionale a epifluorescenza e a campo luminoso per mappare le posizioni di interesse per l’imaging in crioSIM. Vedere la Figura 1 per una panoramica dell’intero protocollo. 1. Preparazione della fase crio- Preparare l’azoto liquido senza ghiaccio (LN2) facendo passare LN2 attraverso un imbuto rivestito con qualsiasi salvietta di carta secca scientifica standard.NOTA: Poiché LN2 provoca ustioni, indossare dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti e occhiali crioprotettivi, durante la manipolazione. Tali liquidi possono spostare l’ossigeno e causare un rapido soffocamento e devono essere maneggiati in un’area adeguatamente ventilata. Rimuovere la polvere superficiale dal criostadio con aria pressurizzata. Espellere il liquido dal contenitore dell’aria pressurizzata prima di utilizzarlo. Assicurarsi che la cartuccia di caricamento del campione sia in posizione con il portase campioni a camera appropriato (verificare che non sia rimasta alcuna griglia nel portase campioni di un esperimento precedente) (Figura 2). Rimuovere il coperchio dal dewar esterno dello stadio crio e versare LN2 filtrato fino a circa 1/4del pieno. Attendere che l’ebollizione iniziale si plachi prima di versarne di più; riempire la nave a circa 2/3° pieno. Sostituire accuratamente il coperchio, puntando l’ugello lontano dal conduttore e dallo stadio/ottica mentre LN2 bolle fuori dall’uscita. Una volta che LN2 ha smesso di uscire dall’uscita, posizionare il tubo di uscita sopra il dewar del palco sul criostadio. Collegare la fonte di alimentazione del palco e collegare il cavo USB al criostadio. Assicurarsi che il coperchio della camera del campione riscaldato sia collegato. Collega il dewar esterno al palco.NOTA: non collegare il dewar esterno fino a quando il tubo di uscita non è stato posizionato sopra il dewar dello stadio sul criostadio. Se LN2 trabocca (o per evitare che trabocchi), estrarre il cavo USB per ~ 10 s, consentirgli di equilibrarsi e ricollegare il cavo USB per riattivare il sensore. Dopo che LN2 è stato consegnato nello stadio dewar, premere il pulsante di rilascio sullo stadio crio per consentire a LN2 di entrare nella camera del campione.NOTA: non lasciare il sistema incustodito mentre LN2 sta riempiendo la camera. Attendere ~ 30-45 minuti per consentire al sistema di raffreddarsi e stabilizzarsi prima di iniziare l’acquisizione dell’immagine. Controllare periodicamente il dewar esterno e ricaricare con LN2 filtrato se è pieno meno di un quarto (circa ogni ora). 2. Trasferimento della scatola di stoccaggio del campione nella fase crio-crio NOTA: Immergere la scatola di stoccaggio del campione, il supporto e le punte di qualsiasi strumento (ad esempio, pinna) all’interno di LN 2 filtrato per raffreddarli prima ditoccare qualsiasi superficie fredda come il campione o qualsiasi oggetto all’interno della camera del campione. Indossare un cappotto da laboratorio e guanti quando si maneggiano campioni biologici. Assicurarsi che i campioni vetrificati siano in un contenitore criocompatibile e portarli al microscopio. Premere il pulsante corrispondente sul criostadio per accendere la luce nella camera del campione. Utilizzare la chiave esadecimale sullo strumento cassetta per aprire le due piastre della cassetta di trasferimento del campione. Aprire le piastre abbastanza larghe da cadere nella griglia tra le due piastre, ma evitare di aprirsi nella posizione massima aperta per evitare che la griglia cada attraverso l’altro lato. Utilizzare una pinza lunga per sollevare la scatola della griglia del campione dalla LN2, girarla dove la tacca si allinea con la posizione della posizione di stoccaggio all’interno del palco e posizionarla sul palco. Utilizzare il dispositivo appropriato (ad esempio, un cacciavite) per aprire il coperchio della scatola di stoccaggio nella posizione corretta del campione. Utilizzando una pinna invertita (o qualsiasi pinna chirurgica a punta fine), rimuovere la griglia TEM dal porta campioni, immergerla all’interno della LN2e lasciarla cadere in posizione nella cassetta di trasferimento del campione, mantenendosi vicino alla LN2 durante il processo di trasferimento. Assicurarsi che il lato del film di carbonio sia posizionato in modo che alla fine sia rivolto verso l’obiettivo sul ponte campione. Chiudere la cartuccia campione utilizzando il tasto esadecimale sullo strumento cassetta. Chiudere e rimuovere la scatola di stoccaggio insieme a tutti i campioni rimanenti. Utilizzare il punto magnetico sullo strumento cassetta per sollevare e montare la cartuccia contenente la griglia sul ponte campione. Tenerlo immerso/vicino alla LN2 durante il processo di trasferimento. Assicurarsi che l’orientamento sia appropriato per il ponte (i due magneti verranno a contatto con i magneti sul ponte). Posizionare la cassetta piatta all’interno dei perni di posizionamento del ponte e spingere delicatamente per assicurarsi che sia fissa.NOTA: Una cassetta campione per griglie ritagliate che sono state preparate per la successiva fresatura a fascio iogonale focalizzato è disponibile anche presso lo stabilimento CryoSIM presso la beamline B24. 3. Aggancio e messa a fuoco dello stadio Spostare il coperchio del criostadio aprendosi nella posizione di imaging e spegnere la luce della camera del campione. Far scorrere il palco verso l’ottica per allinearlo sotto la lente dell’obiettivo. Far cadere delicatamente l’obiettivo in posizione utilizzando la leva, assicurandosi che riposi all’interno del coperchio del criostadio, ma non lo tocchi.NOTA: Assicurarsi che il tubo di uscita esterno di Dewar non tocchi il dewar dello stadio sul crio-stadio in nessun punto durante la raccolta dei dati. Coprire il palcoscenico e l’ottica con una tenda nera opaca. Avviare il software di controllo Cockpit sul PC cryoSIM (Figura 3 e Figura 4). Fare clic sul pulsante della modalità di lettura per ogni telecamera e impostarlo su CONV 3 MHz. Verificare che la temperatura di ciascuna telecamera sia -80 °C e che la ventola della fotocamera sia spenta. Accendere la fotocamera riflessa. Sotto Luci, scegli ambiente (esposizione 20 ms), e sotto linkam, fai clic su condensatore. Fare clic sul pulsante Modalità video. Nella finestra Visualizzazione mosaico, eseguire lo zoom indietro (scorrimento del mouse) per visualizzare il contorno della griglia. Fare clic su Trova fase se non può essere visto. Centrare la griglia facendo doppio clic con il pulsante sinistro del mouse al centro del cerchio. Focalizzare il campione fino a quando la pellicola di supporto della griglia (o qualsiasi altra caratteristica di campionamento pertinente) è a fuoco, utilizzando i tasti su e giù per spostare il criostadio su e giù e utilizzando i tasti 9 e 3 sul tastierino numerico per modificare il passo z (impostarlo su 20 μm per la messa a fuoco iniziale).NOTA: se l’utente esaurisce la corsa in z, il palco può essere spostato manualmente verso l’alto o verso il basso utilizzando la ruota sotto lo stadio crio. Ruotalo di una tacca alla volta e controlla se il campione rientra nell’intervallo di visualizzazione. Modificare nuovamente la direzione se la messa a fuoco peggiora. 4. Acquisizione del mosaico Brightfield Una volta centrato il palco, disattiva la modalità videoe raccogli un mosaico a luce visibile (fai clic su Esegui mosaico nella vista Mosaico per produrre tessere di immagini in luce visibile che si disgregano a spirale verso l’esterno dal centro). Se la griglia è piegata, prova diverse posizioni sulla griglia (doppio clic sinistro all’interno della vista Mosaico),rimode quantoidati e fai di nuovo clic su Esegui mosaico per raccogliere mosaici parziali. In alternativa, inserire un’immagine focalizzata sulla parte superiore del mosaico (Figura 3). Salva la vista cliccando su Salva mosaico. Assegnagli un nome file breve contenente informazioni sulla casella di archiviazione e il rispettivo numero di griglia (un timestamp verrà aggiunto automaticamente al nome del file). 5. Individuazione delle aree di interesse Ispeziona il mosaico a campo luminoso insieme a qualsiasi precedente immagine “mappa” di fluorescenza per dove sono state precedentemente localizzate cellule o caratteristiche biologiche di interesse. Controlla se quelle aree producono una fluorescenza adeguata. Spegnere la luce ambientale e il condensatore, nonché la modalità video, se attiva. Accendere il laser di eccitazione richiesto (405, 488, 561 o 647) e scegliere la fotocamera e il filtrocorrispondenti, inizialmente a 50 mW, per un tempo di esposizione di 50 ms.NOTA: aumentare/diminuire le impostazioni della fotocamera e del filtro in base al segnale di fluorescenza. Premere 0 per scattare un’immagine e * per il contrasto automatico. In alternativa, regola manualmente il contrasto utilizzando il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dell’immagine.NOTA: Accendere il segno Laser on per la stanza. Una volta trovate cellule biologicamente interessanti con fluorescenza adatta, contrassegnare le loro posizioni utilizzando il pulsante Segna sito nella vista Mosaico.NOTA: questi siti contrassegnati appariranno nell’elenco allegato e sono accessibili facendo doppio clic sulle coordinate. Quando torni a un sito contrassegnato, ingrandisci l’area prima di fare doppio clic. Continua a contrassegnare tutti i potenziali siti prima di iniziare l’acquisizione delle immagini. Ri-salvare il mosaico con i siti contrassegnati; clicca su Salva siti su file. Per cucire insieme le immagini del mosaico utilizzando il software StitchM (sviluppato internamente alla beamline B24), trascinare e rilasciare il file di mosaico .txt nel file StitchM con estensione .bat e salvare l’immagine tiff combinata delle tessere di mosaico nella stessa cartella. Per salvare un’immagine con i siti contrassegnati, trascinare e rilasciare contemporaneamente il file mosaico.txt e il file .txt marcatori nell’icona.NOTA: bilanciare la raccolta dei dati con le esigenze del progetto (ad esempio, se verrà eseguita l’imaging correlativo, verificare quante immagini possono essere scattate con la modalità di imaging del partner e scegliere il numero appropriato di siti per l’imaging crioSIM). Inoltre, se il dewar esterno richiede il riempimento con LN2 , il sistema criostadio cambierà posizione e i siti contrassegnati probabilmente non torneranno nelle stesse posizioni; quindi considera questo quando scegli il numero di siti da immaginare. 6. Strategia di raccolta dei dati Impostare il tempo di esposizione laser in base ai conteggi nella gamma dinamica nell’immagine a fluorescenza (nella parte inferiore della finestra di ripresa della fotocamera). Scegli quale filtro applicare e ottimizza queste impostazioni per ogni lunghezza d’onda della luce di eccitazione da utilizzare, accendendo ciascun laser separatamente.NOTA: sebbene 10.000-20.000 conteggi siano ottimali, i conteggi inferiori sono accettabili se c’è un buon contrasto. Idealmente, controllare le impostazioni del filtro prima che ogni pila di immagini venga acquisita perché le celle in aree diverse della griglia potrebbero avere livelli di fluorescenza variabili. 7. Raccolta dei dati Fare clic su entrambe le fotocamere per accenderle. Tornare a uno dei siti contrassegnati e concentrarsi nuovamente sulla profondità desiderata. Una volta a fuoco in un’area di interesse, spostati verso l’alto (tasto ↑ ) nella finestra XY nella fase macro per scegliere l’altezza dello stack z da acquisire e fai clic su Salva in alto. Spostati fuori fuoco verso il basso (↓ tasto), clicca su Salva in basso e poi su Vai al centro,e controlla che l’immagine sia ancora a fuoco.NOTA: l’altezza del campione verrà visualizzata nella finestra. Fare clic con il pulsante destro del mouse su slm (modulatore della luce spaziale) nella finestra Cockpit e assicurarsi che l’angolo sia impostato su 0,41. Nella finestra Cockpit, seleziona Esperimento a sito singolo.NOTA: non fare clic su slm on; Cockpit lo accenderà automaticamente durante l’acquisizione delle immagini. Dall’elenco a discesa, selezionare Illuminazione strutturata. Modificate l’altezza della pila in modo che sia uguale all’altezza z + 1 μm.NOTA: L’aggiunta di 1 μm garantisce la cattura dell’intero campione in z e riduce al minimo i manufatti di ricostruzione. Immettere i tempi di esposizione (ms) per i laser a 405 nm e 488 nm nella riga superiore (per la fotocamera riflessa) e i tempi di esposizione per i laser a 561 nm e 647 nm nella riga inferiore (per la fotocamera trasmessa).NOTA: i valori per il tempo di esposizione devono corrispondere ai valori decisi in precedenza e mostrati nella finestra principale del Cockpit. Immettere un nome di file (convenzione di denominazione: box number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescenza) o BF (campo luminoso) a seconda del tipo di imaging in corso). Fare clic su Aggiorna per produrre un nuovo file contenente la data e l’ora senza sovrascrivere i file precedenti. Quindi, fai clic su Start. Controllare la visualizzazione Fotocamera durante la raccolta dei dati. Riprendere le immagini se c’è uno spostamento xy. Se il dewar LN2 ricarica il criostadio durante l’acquisizione dell’immagine, interrompere il processo facendo clic sul pulsante Abort nel software Cockpit. Una volta che il dewar esterno ha finito di riempire lo stage dewar, ripeti l’esperimento perché la ricarica sposta il campione verticalmente. Rimettere a fuoco l’immagine per centrarla nuovamente in z e ripetere l’esperimento a sito singolo. Ripeti l’esperimento a sito singolo per tutte le combinazioni di laser e filtri necessari.NOTA: ci vogliono circa 30 s-1 min per completare la ricarica. Durante l’imaging di una griglia, il riempimento avverrà ~ 4-8x. In ogni posizione, raccogli una pila z usando la luce visibile. Spegnere i laser e accendere la luce ambientale e il condensatore. In Esperimentoa sito singolo , selezionare Z-stack, impostare la luce ambientale su 20 ms di esposizione e mantenere l’altezza z come sopra. Ripetere i passaggi da 7.2 a 7.4 per tutti i siti contrassegnati sulla griglia. Prima di passare a un altro campione, eliminare il mosaico facendo clic su Elimina tessere. Disegna un quadrato attorno a tutte le tessere per eliminarle. Elimina anche i marcatori selezionandoli tutti nell’elenco e quindi facendo clic su Elimina siti selezionati. Spegnere la luce ambientale e il condensatore prima di procedere alla modifica della griglia. Seguire i passaggi nella sezione 4 in ordine inverso per sganciare la fase da sotto l’obiettivo e modificare la griglia. 8. Dopo l’imaging Al termine dell’imaging, sganciare lo stadio e rimuovere tutti i campioni. Spegnere la spia della camera campione. Scollegare il dewar esterno e decantare l’LN2 rimanente in un altro contenitore criocompatibili, consentendo al dewar di tornare in sicurezza a una temperatura normale. Metti il tappo del coperchio sul criostadio. Attendere fino a quando l’opzione per cuocere il display crio-stadio diventa disponibile dopo che non rimane più LN2 nel dewar dello stadio. Premere il pulsante bake-out per accedere alla modalità di riscaldamento e rimuovere l’umidità dallo stadio crio per evitare la formazione di ghiaccio. 9. Ricostruzione Trasferire i file di dati SIM grezzi alla workstation appropriata per la ricostruzione. Esegui l’elaborazione in batch attraverso la finestra del generatore di attività di elaborazione utilizzando le funzioni di trasferimento ottico specifiche del canale (OTFS) (calcolate dalle funzioni di diffusione del punto di perline multifluorescenza) e gli angoli K0 (0,29278, -1,8028, 2,3786) con un filtro Wiener costante per tutti i canali di 0,004 e un offset di polarizzazione di 200. Nel pannello Opzioni aggiuntive, assicuratevi che le intensità negative vengano eliminate mantenendo deselezionate altre opzioni. Salvare le immagini SIR in una cartella denominata “elaborata”.NOTA: il software di ricostruzione SIM commerciale di solito produce dati SIM ricostruiti e conserva il nome del file, ma aggiunge SIR.dv alla fine. Viene inoltre creato un file di registro che contiene il protocollo di elaborazione, i passaggi e le informazioni statistiche sul successo della ricostruzione. 10. Correzione cromatica del cambiamento Scarica il software Chromagnon7 per correggere il cambio cromatico. Utilizzare la matrice di riferimento dello spostamento cromatico che corrisponde alle lunghezze d’onda di fluorescenza dei dati raccolti (forniti dalla beamline).NOTA: Il file di riferimento è un file ‘chromagnon.csv’, che contiene i parametri di allineamento ed è stato ottenuto da immagini di calibrazione utilizzando nanoparticelle multi-fluorescenti. Può essere utilizzato per elaborare in batch più set di dati contemporaneamente. Scegliete il file di riferimento appropriato che corrisponda alla lunghezza d’onda del laser e al filtro utilizzato per l’imaging del campione e aggiungetelo al campo di riferimento. Aggiungere i dati SIR ricostruiti da allineare nel campo di origine e fare clic su Esegui. Verificare che il segnale di fluorescenza sia ora allineato nelle immagini. Per l’elaborazione batch, posizionare tutte le immagini SIR da allineare nel campo di origine e il file di riferimento nel campo di riferimento, quindi premere Esegui tutto.