איסוף נתונים מיקרוסקופי תאורה מובנה קריו מתאים שהשתמרו בהקפאה

הערה: פרוטוקול זה נוגע לדגימות המכילות תאים הגדלים או מופקדים על שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM) 3 מ”מ רשתות זהב שטוחות עם סרט תמיכה בפחמן חורי כי כבר vitrifiedו על ידי הקפאת צלילה או הקפאה בלחץ גבוה. פרוטוקול זה מניח כי דגימות כבר התמונה באמצעות אפיפלואורסצנטיות קונבנציונלית ומיקרוסקופ Brightfield כדי למפות מיקומים של עניין עבור הדמיה cryoSIM. ראה איור 1 לקבלת מבט כולל על הפרוטוקול כולו. 1. הכנת שלב ההקפאה הכן חנקן נוזלי ללא קרח (LN2) על ידי העברת LN2 דרך משפך מרופד בכל מגבוני נייר יבשים מדעיים סטנדרטיים.הערה: כמו LN2 גורם לכוויות, ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות מגן קריו ומשקפי מגן, בעת טיפול בו. נוזלים כאלה עלולים לעקור חמצן ולגרום לחנק מהיר ויש לטפל בהם באזור מאוורר כראוי. הסר אבק פני השטח משלב ההקפאה עם אוויר בלחץ. יש לגרש נוזל ממיכל האוויר בלחץ לפני השימוש בו. ודאו שמחסנית הטעינה לדוגמה נמצאת במקום עם מחזיק הדגימה התאית המתאים (בדקו שלא נותרה רשת במחזיק המדגם מניסוי קודם)(איור 2). הסר את המכסה מן dewar החיצוני של שלב ההקפאה, ויוצקים LN מסונן2 עד כ 1/4th מלא. המתן עד שהרתיחה הראשונית תשכך לפני ההשפכה נוספת; מלאו את כלי השיט לכ-2/3. החליפו את המכסה בזהירות, והצביעו על הזרבובית הרחק מהמפעיל ועל הבמה/אופטיקה בעוד LN2 רותח מהשקע. לאחר LN2 הפסיק לצאת מהשקע, מניחים את צינור השקע מעל הבמה dewar על הבמה cryo. חבר-התוסף למקור החשמל של הבמה וחבר את כבל ה-USB לשלב ההקפאה. ודא שמכסה תא הדגימה המחומם מחובר לחשמל. חבר את ההמתה החיצונית לשלב.הערה: אין לחבר את dewar החיצוני עד צינור השקע כבר ממוקם מעל dewar הבמה על הבמה cryo. אם LN2 גולש (או כדי למנוע ממנו לעלות על גדותיו), שלף את כבל ה- USB למשך כ- ~ 10 s, אפשר לו להתיישב וחבר מחדש את כבל ה- USB כדי להפעיל מחדש את החיישן. לאחר LN2 נמסר לתוך dewar הבמה, לחץ על כפתור השחרור על שלב ההקפאה כדי לאפשר LN2 להיכנס לתא המדגם.הערה: אין להשאיר את המערכת ללא השגחה בזמן ש- LN2 ממלא את החדר. המתן ~ 30-45 דקות כדי לאפשר למערכת להתקרר ולייצב לפני תחילת רכישת התמונה. בדוק מעת לעת את dewar החיצוני, ולמעלה עם LN2 מסונן אם הוא פחות מרבע מלא (בערך בכל שעה). 2. העברת תיבת האחסון לדוגמה לשלב ההקפאה הערה: לטבול את תיבת האחסון לדוגמה, המחזיק ואת קצות כל המכשירים (למשל, מלקחיים) בתוך LNמסונן 2 כדי לקרר אותם לפני נגיעה כל משטחים קרים כגון המדגם או כל אובייקטים בתוך תא המדגם. ללבוש מעיל מעבדה וכפפות בעת טיפול בדגימות ביולוגיות. ודא שדגימות מנוססות נמצאות במיכל תואם קריו, והבא אותן למיקרוסקופ. לחץ על הכפתור המתאים בשלב ההקפאה כדי להדליק את האור בתא הדגימה. השתמש במקש ההקס בכלי הקלטת כדי לפתוח את שתי הלוחות של קלטת ההעברה לדוגמה. פתח את הלוחות רחבים מספיק כדי להפיל את הרשת בין שני הלוחות, אבל להימנע מפתיחה למיקום הפתוח המרבי כדי למנוע את הרשת נופלת דרך הצד השני. השתמש במלקחיים ארוכים כדי להרים את תיבת הרשת לדוגמה מתוך LN 2 ,להפוךאותו שבו החרץ מיישר עם המיקום של מיקום האחסון בתוך הבמה, ומניח אותו על הבמה. השתמש בהתקן המתאים (לדוגמה, מברג) כדי לפתוח את מכסה תיבת האחסון למיקום המדגם הנכון. באמצעות מלקחיים הפוכים (או כל מלקחיים כירורגיים עדינים), הסר את רשת TEM ממחזיק המדגם, טבול אותה בתוך LN2, ושחרר אותה למיקום בקלטת ההעברה לדוגמה, תוך שמירה קרובה ל- LN 2 במהלךתהליך ההעברה. ודא שהצד של סרט הפחמן ממוקם כך שבסופו של דבר הוא יעמוד מול המטרה על הגשר לדוגמה. סגור את המחסנית לדוגמה באמצעות מקש הכיוה בכלי הקלטת. סגור והסר את תיבת האחסון יחד עם כל הדוגמאות הנותרות. השתמש בנקודת המגנט בכלי הקלטת כדי להרים ולהרכיב את המחסנית המכילה את הרשת על הגשר לדוגמה. שמור אותו שקוע / קרוב LN 2 במהלךתהליך ההעברה. ודא שהכיוון מתאים לגשר (שני המגנטים ייצרו קשר עם המגנטים על הגשר). מניחים את הקלטת שטוחה בתוך סיכות המיקום של הגשר, ודחוף בעדינות כדי להבטיח שהיא קבועה.הערה: קלטת לדוגמה עבור רשתות חתוכות שהוכנו לטחינה ממוקדת של קרן יונים זמינה גם במתקן CryoSIM בקו הקרן B24. 3. עגינה ומיקוד במה הזז את פתח המכסה בשלב ההקפאה לתנוחת ההדמיה, וכבה את אור תא הדגימה. החלק את הבמה לכיוון האופטיקה כדי ליישר אותה מתחת לעדשה האובייקטיבית. שחרר בעדינות את המטרה למיקום באמצעות הידית, והבטח שהיא מונחת בתוך המכסה של שלב ההקפאה, אך אינה נוגעת בה.הערה: ודאו שצינור השקע החיצוני של דיואר לא נוגע בהפיכת הבמה בשלב ההקפאה בשום שלב במהלך איסוף הנתונים. מכסים את הבמה ואת האופטיקה עם וילון שחור אטום. הפעל את תוכנת הבקרה תא הטייס במחשב cryoSIM(איור 3 ואיור 4). לחץ על לחצן מצב הקריאה עבור כל מצלמה, והגדר אותו ל- CONV 3 MHz. בדוק כי הטמפרטורה של כל מצלמה היא -80 °C (80 °F), ומאוורר המצלמה כבויה. הפעל את המצלמה המוחקפת. תחת אורות, בחר סביבה (חשיפה 20 ms), ותחת linkam, לחץ על מחזק. לחץ על לחצן מצב וידאו. בחלון תצוגת פסיפס, הקטן את התצוגה (גלילת עכבר) כדי לראות את חלוקה לרמות של הרשת. לחץ על חפש את הבמה אם לא ניתן לראות אותה. מרכז את הרשת על-ידי לחיצה כפולה שמאלה באמצע העיגול. מקד את המדגם עד שסרט התמיכה ברשת (או כל תכונה רלוונטית אחרת) נמצא במוקד, תוך שימוש במקשים למעלה ולמטה כדי להזיז את שלב ההקפאה למעלה ולמטה, ושימוש במקשים 9 ו-3 בלוח המספרי כדי לשנות את שלב z (הגדר אותו ל- 20 מיקרומטר למיקוד ראשוני). הערה: אם למשתמש נגמרת הנסיעה ב- z, ניתן להזיז את הבמה באופן ידני למעלה או למטה באמצעות הגלגל מתחת לשלב ההקפאה. סובב אותו במכה אחת בכל פעם, ובדוק אם המדגם נמצא בטווח הראייה. לשנות את הכיוון שוב אם המיקוד מחמיר. 4. רכישת פסיפס ברייטפילד לאחר שהבמה ממורכזת, כבה את מצב הווידאוואסוף פסיפס אור נראה לעין (לחץ על פסיפס Run בתצוגת Mosaic כדי לייצר אריחים של תמונות אור גלויות המתפתלות כלפי חוץ מהמרכז). אם הרשת כפופה, נסה מיקומים שונים ברשת (לחיצה כפולה שמאלה בתצוגת Mosaic), התמקד מחדש ולחץ שוב על הפעל פסיפס כדי לאסוף פסיפסים חלקיים. לחלופין, ירידה בתמונה ממוקדת מעל הפסיפס (איור 3). שמור את התצוגה על ידי לחיצה על שמור פסיפס. תן לו שם קובץ קצר המכיל מידע על תיבת האחסון ומספר הרשת המתאים (חותמת זמן יצורף באופן אוטומטי לשם הקובץ). 5. זיהוי תחומי עניין בדוק את פסיפס brightfield לצד כל תמונות “מפה” פלואורסצנטיות קודמות עבור שבו תאים או תכונות ביולוגיות של עניין היו ממוקמים בעבר. בדוק אם אזורים אלה מייצרים פלואורסצנטיות מתאימה. כבה את נורית הסביבה ואת המחזק, כמו גם את מצב הווידאו אם הוא פעיל. הפעל את לייזר העירור הנדרש (405, 488, 561 או 647), ובחר את המצלמה והמסנןהמתאימים , בתחילה ב 50 mW, לזמן חשיפה של 50 ms.הערה: הגדל/הקטן הגדרות מצלמה וסינון אלה בהתאם לאות הפלואורסצנטיות. הקש 0 כדי להצמיד תמונה ו- * כדי ליצור ניגודיות אוטומטית. לחלופין, כווננו ידנית את הניגודיות באמצעות המחוון בתחתית התמונה.הערה: הדליקו את שלט הלייזר לחדר. לאחר שנמצאו תאים מעניינים ביולוגית עם פלואורסצנטיות מתאימה, סמנו את מיקומם באמצעות לחצן אתר מארק בתצוגת Mosaic.הערה: אתרים מסומנים אלה יופיעו ברשימה המצורפת וניתן לגשת אליהם על-ידי לחיצה כפולה על הקואורדינטות. בעת חזרה לאתר מסומן, הגדל את התצוגה לאזור לפני לחיצה כפולה. המשך לסמן את כל האתרים הפוטנציאליים לפני תחילת רכישת התמונות. שמור מחדש את הפסיפס עם האתרים המסומנים; לחץ על שמור אתרים בקובץ. כדי לתפור את תמונות הפסיפס יחד באמצעות תוכנת StitchM (שפותחה בבית ב- beamline B24), גרור ושחרר את קובץ הפסיפס .txt לקובץ StitchM עם .bat סיומת ולשמור את תמונת ה- tiff המשולבת של אריחי הפסיפס באותה תיקיה. לשמירת תמונה עם האתרים המסומנים, גרור ושחרר את קובץ הפסיפס.txt והסמנים.txt את הקובץ לסמל בו-זמנית.הערה: איזון איסוף נתונים מול צרכי הפרויקט (לדוגמה, אם ייעשה הדמיה קורלטיבית, בדוק כמה תמונות ניתן לקחת עם מודל ההדמיה של השותף ובחר את המספר המתאים של אתרים להדמיית cryoSIM). בנוסף, אם dewar החיצוני דורש מילוי מחדש עם LN2 , מערכת קריו-שלב תשנה מיקום, ואתרים מסומנים סביר להניח לא יחזור לאותם מיקומים; לכן שקול זאת בעת בחירת מספר האתרים להתמונה. 6. אסטרטגיית איסוף נתונים הגדר את זמן החשיפה ללייזר בהתבסס על הספירות בטווח הדינמי בתמונת הפלואורסצנטיות (בתחתית חלון התצוגות של המצלמה). בחר איזה מסנן להחיל, ולמטב הגדרות אלה עבור כל אורך גל של אור עירור לשמש, הפעלת כל לייזר בנפרד.הערה: למרות שספירות של 10,000-20,000 הן אופטימליות, ספירות נמוכות יותר מקובלות אם יש ניגודיות טובה. באופן אידיאלי, בדוק את הגדרות המסנן לפני שרכישת כל מחסנית תמונה מכיוון שתאים באזורים שונים של הרשת עשויים להיות בעלי רמות פלואורסצנטיות משתנות. 7. איסוף נתונים לחץ על שתי המצלמות כדי להפעיל אותן. חזור לאחד האתרים המסומנים, והתמקד שוב בעומק הרצוי. לאחר התמקדות באזור מעניין, התרחקו מהמוקד כלפי מעלה(↑ מפתח) בחלון XY בשלב המאקרו כדי לבחור את הגובה של מחסנית z לרכישה ולחצו על שמור למעלה. צא מהמוקד כלפי מטה (↓ key), לחץ על שמור למטה ולאחר מכן עבור למרכזובדוק שהתמונה עדיין במוקד.הערה: גובה הדגימה יוצג בחלון. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על slm (אפנון אור מרחבי) בחלון תא הטייס, וודא שהזווית מוגדרת על 0.41. בחלון תא הטייס, בחר ניסוי של אתר יחיד.הערה: אל תלחץ על ה- slm; תא הטייס ידליק אותו באופן אוטומטי במהלך רכישת תמונה. מהרשימה הנפתחת , בחר תאורה מובנית. שנה את גובה הערימה כך שיהיה שווה לגובה z + 1 מיקרומטר.הערה: התוספת של 1 מיקרומטר מבטיחה את לכידת המדגם כולו ב- z וממזערת את חפצי השחזור. הזן את זמני החשיפה (ms) עבור הלייזרים 405 ננומטר ו- 488 ננומטר בשורה העליונה (עבור המצלמה המשתקפת) ואת זמני החשיפה ללייזרים של 561 ננומטר ו- 647 ננומטר בשורה התחתונה (עבור המצלמה המשודרת).הערה: הערכים עבור זמן חשיפה צריכים להתאים לערכים שעליהם הוחלט קודם לכן ומוצגים בחלון הראשי של תא הטייס. הזן שם קובץ (מוסכמה למתן שמות: תיבה number_grid area_filters_FL) (FL (פלואורסצנטיות) או BF (brightfield) בהתאם לסוג ההדמיה המתבצעת). לחץ על עדכן כדי להפיק קובץ חדש המכיל את התאריך והשעה מבלי לבצע קבצים קודמים. לאחר מכן, לחץ על התחל. בדוק את תצוגת המצלמה בעת איסוף הנתונים. קח מחדש את התמונות אם יש תזוזת xy. אם דג LN2 dewar ממלא מחדש את שלב ההקפאה במהלך רכישת תמונה, בטל את התהליך על-ידי לחיצה על לחצן ביטול בתוכנת תא הטייס. לאחר שהערך החיצוני סיים למלא מחדש את פירוק הבמה, חזור על הניסוי מכיוון שהמילוי מחדש מזיז את המדגם אנכית. מקד מחדש את התמונה כדי למרכז אותה מחדש ב-z, ולחזור על הניסוי של אתר יחיד . חזור על הניסוי באתר יחיד עבור כל השילובים של לייזרים ומסננים הדרושים.הערה: לוקח בערך 30 s-1 דקות כדי לסיים מילוי מחדש. במהלך ההדמיה של רשת אחת, מילוי מחדש יקרה ~ 4-8x. בכל מיקום, אסוף מחסנית z באמצעות אור גלוי. כבה את הלייזרים, והפעל את אור הסביבה ואת המרוכז. תחת ניסוי של אתר יחיד, בחר Z-stack, הגדר את נורית הסביבה לחשיפה של 20 ms ושמור על גובה z כנ”ל. חזור על שלבים 7.2 עד 7.4 עבור כל האתרים המסומנים ברשת. לפני המעבר לדוגמה אחרת, מחק את הפסיפס על-ידי לחיצה על מחק אריחים. צייר ריבוע סביב כל האריחים כדי למחוק אותם. מחק גם את הסמנים על-ידי בחירת כולם ברשימה ולאחר מכן לחיצה על מחק אתרים נבחרים. כבה את נורית הסביבה ואת המעיבות לפני שתמשיך לשנות את הרשת. בצע את השלבים בסעיף 4 כדי לבטל את עגינה של הבמה מתחת למטרה ולשנות את הרשת. 8. לאחר הדמיה לאחר סיום ההדמיה, בטל את עגינה של הבמה והסר את כל הדגימות. כבה את האור של תא הדגימה. נתק את ההפיכת ההקלה החיצונית, וקבע כל LN2 הנותרים לתוך מיכל אחר תואם קריו, המאפשר dewar לחזור בבטחה לטמפרטורה נורמלית. שים את תקע המכסה על במת ההקפאה. המתינו עד שהאפשרות לאפות את תצוגת קריו-בימת הופכת לזמינה לאחר שלא יישאר יותר LN2 בהפוגת הבמה. לחץ על כפתור האפייה כדי להיכנס למצב החימום, והסר כל לחות משלב ההקפאה כדי למנוע היווצרות קרח. 9. שחזור העבר קבצי נתוני SIM גולמיים לתחנת העבודה המתאימה לשחזור. הפעל עיבוד בקבוצות דרך החלון בונה משימות עיבוד באמצעות פונקציות העברה אופטיות ספציפיות לערוץ (OTFS) (מחושב מפונקציות פריסה של נקודות חרוזים מרובות פלואורסצנטיות) וזוויות K0 (0.29278, -1.8028, 2.3786) עם מסנן וינר קבוע עבור כל הערוצים של 0.004 והיסט הטיה של 200. בחלונית ‘אפשרויות נוספות’, ודאו שעוצמות שליליות נמחקות על-ידי השארת אפשרויות אחרות לא מסומנות. שמור את תמונות SIR בתיקיה בשם “מעובד”.הערה: תוכנה מסחרית לשחזור SIM מייצרת בדרך כלל נתוני SIM משוחזרים ושומרת על שם הקובץ, אך מוסיפה את SIR.dv בסוף. נוצר גם קובץ יומן רישום המכיל את פרוטוקול העיבוד, השלבים והמידע הסטטיסטי אודות הצלחת השחזור. 10. תיקון משמרת כרומטית הורד את התוכנה Chromagnon 7 כדילתקן את השינוי הכרומטי. השתמש במטריצת הייחוס של המשמרת הכרומטית המתאימה לאורכי הגל הפלואורסצנטיים של הנתונים שנאספו (המסופקים על ידי קו הקרן).הערה: קובץ ההפניות הוא קובץ ‘chromagnon.csv’, המכיל את פרמטרי היישור והושגו מתמונות כיול באמצעות חלקיקים פלואורסצנטיים מרובים. ניתן להשתמש בו כדי לעבד אצווה ערכות נתונים מרובות בו-זמנית. בחר את קובץ ההפניות המתאים התואם לאורכי הגל והמסנן של הלייזר המשמשים להדמיית המדגם והוסף אותו לשדה ההפניה. הוסף את נתוני SIR המשוחזרים כדי להיות מיושרים בשדה המקור ולחץ על הפעל. בדוק שאות הפלואורסצנטיות מיושר כעת בתמונות. לעיבוד אצווה, מקם את כל תמונות SIR כך שיושדרו בשדה המקור ובקובץ ההפניה בשדה ההפניה והקש הפעל את הכל.