Kryostrukturierte Beleuchtung Mikroskopische Datenerfassung von kryogen konservierten Zellen

HINWEIS: Dieses Protokoll bezieht sich auf Proben, die Zellen enthalten, die auf Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 3 mm flachen Goldgittern mit einer löchrigen Kohlenstoffträgerfolie gezüchtet oder abgeschieden wurden, die durch Tauchgefrieren oder Hochdruckgefrieren verglast wurden. Dieses Protokoll geht davon aus, dass Proben bereits mit einem herkömmlichen Epifluoreszenz- und Hellfeldmikroskop abgebildet wurden, um Orte zu kartieren, die für die Bildgebung in KryoSIM von Interesse sind. Eine Übersicht über das gesamte Protokoll finden Sie in Abbildung 1. 1. Vorbereitung der Kryophase Bereiten Sie eisfreien flüssigen Stickstoff (LN2)vor, indem Sie LN2 durch einen Trichter führen, der mit standarden wissenschaftlichen Trockenpapiertüchern ausgekleidet ist.HINWEIS: Da LN 2 Verbrennungen verursacht, tragen Sie beim Umgang mit LN2 geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Kryoschutzhandschuhen und Schutzbrillen. Solche Flüssigkeiten können Sauerstoff verdrängen und schnelles Ersticken verursachen und sollten in einem ordnungsgemäß belüfteten Bereich gehandhabt werden. Entfernen Sie Oberflächenstaub aus der Kryostufe mit Druckluft. Spülen Sie Flüssigkeit aus dem Druckluftbehälter aus, bevor Sie ihn verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Probenbeschickungskartusche mit dem entsprechenden Kammerprobenhalter an Ort und Stelle ist (überprüfen Sie, ob im Probenhalter aus einem früheren Versuch kein Gitter mehr vorhanden ist) (Abbildung 2). Entfernen Sie den Deckel aus dem äußeren Dewar der Kryostufe und gießen Sie gefiltertes LN2, bis es etwa 1/4 vollist. Warten Sie, bis das anfängliche Kochen nachlässt, bevor Sie mehr gießen; Füllen Sie das Gefäß bis ca. 2/3voll. Ersetzen Sie den Deckel vorsichtig und richten Sie die Düse vom Handler und der Bühne/Optik weg, während LN2 aus dem Auslass herauskocht. Sobald LN2 nicht mehr aus dem Auslass kommt, legen Sie das Auslassrohr über die Bühne Dewar auf die Kryo-Bühne. Schließen Sie die Stromquelle der Bühne an und schließen Sie das USB-Kabel an die Kryostufe an. Stellen Sie sicher, dass der Deckel der beheizten Probenkammer eingesteckt ist. Stecken Sie den externen Dewar in die Bühne.HINWEIS: Schließen Sie den externen Dewar erst an, wenn das Auslassrohr über dem Stage Dewar auf der Kryostufe positioniert wurde. Wenn LN2 überläuft (oder um ein Überlaufen zu verhindern), ziehen Sie das USB-Kabel für ~ 10 s heraus, lassen Sie es ausgleichen und schließen Sie das USB-Kabel wieder an, um den Sensor wieder zu aktivieren. Nachdem LN2 in die Stufe Dewar geliefert wurde, drücken Sie den Auslöseknopf auf der Kryostufe, damit LN2 in die Probenkammer gelangen kann.HINWEIS: Lassen Sie das System nicht unbeaufsichtigt, während LN2 die Kammer füllt. Warten Sie ~30-45 Minuten, damit das System abkühlen und stabilisieren kann, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen. Überprüfen Sie regelmäßig den externen Dewar und beladen Sie ihn mit gefilterten LN2, wenn er weniger als ein Viertel voll ist (ungefähr jede Stunde). 2. Übergabe der Probenaufbewahrungsbox in die Kryostufe HINWEIS: Tauchen Sie die Probenaufbewahrungsbox, den Halter und die Spitzen aller Instrumente (z. B. Zinnen) in das gefilterte LN2 ein, um sie zu kühlen, bevor Sie kalte Oberflächen wie die Probe oder Objekte in der Probenkammer berühren. Tragen Sie einen Laborkittel und Handschuhe, wenn Sie mit biologischen Proben umgehen. Stellen Sie sicher, dass sich die verglasten Proben in einem kryokompatiblen Behälter befinden, und bringen Sie sie zum Mikroskop. Drücken Sie die entsprechende Taste auf der Kryobühne, um das Licht in der Probenkammer einzuschalten. Verwenden Sie die Sechskanttaste am Kassettenwerkzeug, um die beiden Platten der Probentransferkassette zu öffnen. Öffnen Sie die Platten weit genug, um das Gitter zwischen den beiden Platten fallen zu lassen, aber vermeiden Sie es, sich in die maximal offene Position zu öffnen, um zu verhindern, dass das Gitter durch die andere Seite fällt. Verwenden Sie eine lange Zette, um die Probengitterbox aus dem LN2zu heben, drehen Sie sie an der Stelle, an der sich die Notbe an der Position der Speicherposition innerhalb der Bühne ausrichtet, und legen Sie sie auf die Bühne. Verwenden Sie das entsprechende Gerät (z. B. einen Schraubendreher), um den Deckel der Aufbewahrungsbox in die richtige Probenposition zu öffnen. Entfernen Sie mit einer invertierten Stoßzette (oder einer chirurgischen Feinspitzenzette) das TEM-Gitter aus dem Probenhalter, tauchen Sie es in die LN2ein und lassen Sie es in der Probentransferkassette in Position, wobei Sie während des Transfervorgangs nahe am LN2 bleiben. Stellen Sie sicher, dass die Kohlenstofffilmseite so platziert ist, dass sie letztendlich dem Objektiv auf der Probenbrücke zugewandt ist. Schließen Sie die Probenkassette mit der Sechskanttaste am Kassettenwerkzeug. Schließen und entfernen Sie die Aufbewahrungsbox zusammen mit den verbleibenden Proben. Verwenden Sie den Magnetpunkt am Kassettenwerkzeug, um die Patrone mit dem Gitter auf der Probenbrücke anzuheben und zu montieren. Halten Sie es während des Übertragungsvorgangs eingetaucht / nahe am LN2. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung für die Brücke geeignet ist (die beiden Magnete nehmen Kontakt mit den Magneten auf der Brücke auf). Legen Sie die Kassette flach in die Positionierungsstifte der Brücke und stupsen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sie fixiert ist.HINWEIS: Eine Musterkassette für abgeschnittene Gitter, die für das anschließende fokussierte Ionenstrahlfräsen vorbereitet wurden, ist auch in der CryoSIM-Anlage an der beamline B24 erhältlich. 3. Stage Docking und Fokussierung Bewegen Sie die Öffnung des Kryo-Deckels in die Bildposition und schalten Sie das Probenkammerlicht aus. Schieben Sie die Bühne in Richtung Der Optik, um sie unter der Objektivlinse auszurichten. Lassen Sie das Objektiv vorsichtig mit dem Hebel in Position und stellen Sie sicher, dass es im Deckel der Kryostufe ruht, es aber nicht berührt.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das externe Dewar-Auslassrohr während der Datenerfassung zu keinem Zeitpunkt die Stage-Dewar auf der Kryostufe berührt. Bedecken Sie die Bühne und die Optik mit einem undurchsichtigen schwarzen Vorhang. Starten Sie die Steuerungssoftware Cockpit auf dem kryoSIM-PC (Bild 3 und Abbildung 4). Klicken Sie auf die Schaltfläche für den Auslesemodus für jede Kamera und stellen Sie sie auf CONV 3 MHzein. Überprüfen Sie, ob die Temperatur jeder Kamera -80 °C beträgt und der Kameralüfter ausgeschaltet ist. Schalten Sie die reflektierte Kamera ein. Wählen Sie unter Lichterdie Option Ambient (Belichtung 20 ms) und klicken Sie unter linkamauf Kondensator. Klicken Sie auf die Schaltfläche Videomodus. Verkleinern Sie im Mosaikansichtsfenster (Mausbildlauf), um die Rasterkontur anzuzeigen. Klicken Sie auf Bühne suchen, wenn sie nicht zu sehen ist. Zentrieren Sie das Raster, indem Sie mit der linken Maustaste in die Mitte des Kreises doppelklicken. Fokussieren Sie die Probe, bis der Gitterträgerfilm (oder ein anderes relevantes Probenmerkmal) im Fokus ist, indem Sie die Kehr- und Abwärtstasten verwenden, um die Kryostufe nach oben und unten zu bewegen, und die Tasten 9 und 3 auf dem numerischen Pad verwenden, um den Z-Schritt zu ändern (stellen Sie ihn für die erste Fokussierung auf 20 μm ein).HINWEIS: Wenn dem Benutzer die Fahrt in z ausgeht, kann die Bühne manuell mit dem Rad unter der Kryostufe nach oben oder unten bewegt werden. Drehen Sie es um eine Stufe nach dem anderen und überprüfen Sie, ob sich die Probe im Sichtbereich befindet. Ändern Sie die Richtung erneut, wenn sich die Fokussierung verschlechtert. 4. Erwerb von Hellfeldmosaik Sobald die Bühne zentriert ist, deaktivieren Sie den Videomodusund sammeln Sie ein Mosaik mit sichtbarem Licht (klicken Sie in der Mosaikansicht auf Mosaik ausführen, um Kacheln mit Bildern mit sichtbarem Licht zu erzeugen, die sich von der Mitte nach außen spiralförmig drehen). Wenn das Raster gebogen ist, versuchen Sie es mit verschiedenen Positionen auf dem Raster (Doppelklick mit der linken Maustaste in der Mosaikansicht),fokussieren Sie erneut und klicken Sie erneut auf Mosaik ausführen, um Teilmosaike zu sammeln. Alternativ können Sie ein fokussiertes Bild über dem Mosaik ablegen (Abbildung 3). Speichern Sie die Ansicht, indem Sie auf Mosaik speichernklicken. Geben Sie ihm einen kurzen Dateinamen mit Informationen zur Speicherbox und der entsprechenden Rasternummer (ein Zeitstempel wird automatisch an den Dateinamen angehängt). 5. Identifizierung von Interessensgebieten 6. Datenerhebungsstrategie Stellen Sie die Laserbelichtungszeit basierend auf den Zählungen im Dynamikbereich im Fluoreszenzbild ein (am unteren Rand des Kameraansichtsfensters). Wählen Sie den anzuwendenden Filter aus und optimieren Sie diese Einstellungen für jede Wellenlänge des zu verwendenden Anregungslichts, indem Sie jeden Laser separat einschalten.HINWEIS: Obwohl 10.000-20.000 Zählungen optimal sind, sind niedrigere Zählungen akzeptabel, wenn ein guter Kontrast vorhanden ist. Überprüfen Sie idealerweise die Filtereinstellungen, bevor jeder Bildstapel erfasst wird, da Zellen an verschiedenen Bereichen des Gitters variable Fluoreszenzwerte aufweisen können. 7. Datenerhebung Klicken Sie auf beide Kameras, um sie einzuschalten. Kehren Sie zu einer der markierten Stellen zurück und konzentrieren Sie sich wieder auf die gewünschte Tiefe. Sobald Sie sich in einem Interessenbereich im Fokus befinden, bewegen Sie sich im XY-Fenster in der Makrostufe nach oben(↑-Taste), um die Höhe des zu erfassenden Z-Stapels auszuwählen, und klicken Sie auf Oben speichern. Bewegen Sie sich nach unten ( ↓-Taste), klicken Sie unten auf Speichern und dann auf Zur Mitte gehen, und überprüfen Sie, ob das Bild noch im Fokus ist.HINWEIS: Die Probenhöhe wird im Fenster angezeigt. Klicken Sie im Cockpit-Fenster mit der rechten Maustaste auf slm (Spatial Light Modulator) und stellen Sie sicher, dass der Winkel auf 0,41 eingestellt ist. Wählen Sie im Fenster Cockpit die Option Einzelstandortexperimentaus.HINWEIS: Klicken Sie nicht auf slm on; Cockpit schaltet es während der Bildaufnahme automatisch ein. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Strukturierte Beleuchtungaus. Ändern Sie die Stapelhöhe so, dass sie der z-Höhe + 1 μm entspricht.HINWEIS: Die Zugabe von 1 μm gewährleistet die Erfassung der gesamten Probe in z und minimiert Rekonstruktionsartefakte. Geben Sie die Belichtungszeiten (ms) für die 405 nm und 488 nm Laser in der oberen Reihe (für die reflektierte Kamera) und die Belichtungszeiten für die 561 nm und 647 nm Laser in der unteren Reihe (für die übertragene Kamera) ein.HINWEIS: Die Werte für die Belichtungszeit sollten mit den zuvor festgelegten werten übereinstimmen, die im Cockpit-Hauptfenster angezeigt werden. Geben Sie einen Dateinamen ein (Namenskonvention: Feld number_grid area_filters_FL) (FL (Fluoreszenz) oder BF (Hellfeld), je nachdem, welche Art der Bildgebung durchgeführt wird). Klicken Sie auf Aktualisieren, um eine neue Datei mit Datum und Uhrzeit zu erstellen, ohne vorherige Dateien zu überschreiben. Klicken Sie dann auf Start. Überprüfen Sie die Kameraansicht, während Daten gesammelt werden. Nehmen Sie die Bilder erneut auf, wenn eine xy-Verschiebung vorliegt. Füllt der LN2 dewar während der Bildaufnahme die Kryostufe wieder auf, bricht der Vorgang ab, indem Sie in der Cockpit-Software auf die Schaltfläche Abbrechen klicken. Sobald der externe Dewar das Nachfüllen der Stage Dewar beendet hat, wiederholen Sie das Experiment, da das Refill die Probe vertikal verdrängt. Fokussieren Sie das Bild neu, um es in z neu zu zentrieren, und wiederholen Sie das Einzelstandortexperiment. Wiederholen Sie das Einzelstandortexperiment für alle erforderlichen Kombinationen von Lasern und Filtern.HINWEIS: Es dauert ungefähr 30 s-1 min, um das Nachfüllen abzuschließen. Während der Bildgebung eines Gitters erfolgt das Nachfüllen ~ 4-8x. Sammeln Sie an jeder Position einen Z-Stapel mit sichtbarem Licht. Schalten Sie die Laser aus und schalten Sie Umgebungslicht und Kondensator ein. Wählen Sie unter Einzelstandortexperimentdie Option Z-Stack aus, stellen Sie das Umgebungslicht auf 20 ms Einstrahlung ein, und behalten Sie die z-Höhewie oben beschrieben bei. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.4 für alle im Raster markierten Standorte. Bevor Sie zu einem anderen Beispiel wechseln, löschen Sie das Mosaik, indem Sie auf Kacheln löschenklicken. Zeichnen Sie ein Quadrat um alle Kacheln, um sie zu löschen. Löschen Sie auch die Marker, indem Sie alle in der Liste auswählen und dann auf Ausgewählte Sites löschenklicken. Schalten Sie das Umgebungslicht und den Kondensator aus, bevor Sie das Gitter wechseln. Befolgen Sie die Schritte in Abschnitt 4 in umgekehrter Reihenfolge, um die Stufe unter dem Ziel abzudocken und das Raster zu ändern. 8. Nach der Bildgebung Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, koppeln Sie die Bühne ab und entfernen Sie alle Proben. Schalten Sie die Probenkammerleuchte aus. Trennen Sie den externen Dewar und dekantieren Sie den verbleibenden LN2 in einen anderen kryokompatiblen Behälter, damit der Dewar sicher auf eine normale Temperatur zurückkehren kann. Setzen Sie den Deckelstecker auf die Kryobühne. Warten Sie, bis die Option zum Ausbacken des Kryo-Stage-Displays verfügbar wird, nachdem kein LN2 mehr in der Phase Dewar verbleibt. Drücken Sie die Bake-Out-Taste, um in den Heizmodus zu wechseln, und entfernen Sie Feuchtigkeit aus der Kryostufe, um Eisbildung zu vermeiden. 9. Wiederaufbau Übertragen Sie SIM-Rohdatendateien zur Rekonstruktion auf die entsprechende Workstation. Führen Sie die Verarbeitung in Batches über das Processing Task Builder-Fenster mit kanalspezifischen optischen Übertragungsfunktionen (OTFS) (berechnet aus mehrfluoreszierenden Perlenpunktspreizfunktionen) und K0-Winkeln (0,29278, -1,8028, 2,3786) mit einem konstanten Wiener Filter für alle Kanäle von 0,004 und einem Bias-Offset von 200 durch. Stellen Sie im Bedienfeld “Zusätzliche Optionen” sicher, dass negative Dichten verworfen werden, indem Sie andere Optionen deaktiviert halten. Speichern Sie die SIR-Bilder in einem Ordner mit dem Namen “processed”.HINWEIS: Kommerzielle SIM-Rekonstruktionssoftware erzeugt normalerweise rekonstruierte SIM-Daten und behält den Dateinamen bei, hängt jedoch SIR.dv am Ende an. Außerdem wird eine Protokolldatei erstellt, die das Verarbeitungsprotokoll, die Schritte und statistische Informationen zum Rekonstruktionserfolg enthält. 10. Chromatische Verschiebungskorrektur Laden Sie die Software Chromagnon7 herunter, um die chromatische Verschiebung zu korrigieren. Verwenden Sie die chromatische Verschiebungsreferenzmatrix, die den Fluoreszenzwellenlängen der gesammelten Daten entspricht (bereitgestellt von der Beamline).HINWEIS: Die Referenzdatei ist eine “chromagnon.csv”-Datei, die die Ausrichtungsparameter enthält und aus Kalibrierbildern mit multifluoreszierenden Nanopartikeln gewonnen wurde. Es kann verwendet werden, um mehrere Datensätze gleichzeitig zu stapeln. Wählen Sie die entsprechende Referenzdatei aus, die der Laserwellenlänge und dem Filter entspricht, die für die Abbildung der Probe verwendet werden, und fügen Sie sie dem Referenzfeld hinzu. Fügen Sie die rekonstruierten SIR-Daten, die im Quellfeld ausgerichtet werden sollen, hinzu und klicken Sie auf Ausführen. Überprüfen Sie, ob das Fluoreszenzsignal nun in den Bildern ausgerichtet ist. Legen Sie für die Stapelverarbeitung alle auszurichtenden SIR-Bilder im Quellfeld und die Referenzdatei im Referenzfeld ab, und drücken Sie Alle ausführen.