Collecte de données microscopiques d’éclairage cryostructuré à partir de cellules cryogéniquement préservées

REMARQUE: Ce protocole concerne les échantillons contenant des cellules cultivées ou déposées sur des grilles d’or plates de 3 mm en microscopie électronique à transmission (TEM) avec un film de support de carbone troué qui ont été vitrifiées par congélation par plongeon ou congélation à haute pression. Ce protocole suppose que les échantillons ont déjà été imagés à l’aide d’un microscope conventionnel à épifluorescence et à champ clair pour cartographier les emplacements d’intérêt pour l’imagerie dans cryoSIM. Reportez-vous à la figure 1 pour une vue d’ensemble de l’ensemble du protocole. 1. Préparation de l’étape cryogénique Préparez de l’azote liquide libre de glace (LN2)en faisant passer LN2 à travers un entonnoir tapissé de n’importe quelle lingette scientifique à papier sec standard.REMARQUE: Comme LN2 provoque des brûlures, portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et des lunettes de cryo-protection, lorsque vous le manipulez. Ces liquides peuvent déplacer l’oxygène et provoquer une suffocation rapide et doivent être manipulés dans un endroit correctement ventilé. Enlevez la poussière de surface de l’étage cryogénique avec de l’air sous pression. Expulser le liquide du récipient d’air sous pression avant de l’utiliser. Assurez-vous que la cartouche de chargement de l’échantillon est en place avec le porte-échantillon chambré approprié (vérifiez qu’il ne reste pas de grille dans le porte-échantillon d’une expérience précédente) (Figure 2). Retirez le couvercle du dewar externe de l’étage cryogénique et versez le LN2 filtré jusqu’à environ 1/4 de lacyème. Attendez que l’ébullition initiale disparaisse avant d’en verser plus; remplir le récipient à environ 2/3de remplissage. Remplacez soigneusement le couvercle en pointant la buse loin du manipulateur et de la scène/optique pendant que LN2 bout à partir de la sortie. Une fois que LN2 a cessé de sortir de la sortie, placez le tuyau de sortie au-dessus de l’étage dewar sur l’étage cryogénique. Branchez la source d’alimentation de la scène et connectez le câble USB à la cryo-scène. Assurez-vous que le couvercle de la chambre d’échantillonnage chauffée est branché. Branchez le dewar externe à la scène.REMARQUE: Ne branchez pas le dewar externe tant que le tuyau de sortie n’a pas été positionné sur le dewar de l’étage sur le cryo-étage. Si LN2 déborde (ou pour l’empêcher de déborder), retirez le câble USB pendant environ 10 s, laissez-le s’équilibrer et reconnectez le câble USB pour réactiver le capteur. Une fois que LN2 a été livré dans le dewar de scène, appuyez sur le bouton de déverrouillage de l’étage cryogénique pour permettre à LN2 d’entrer dans la chambre d’échantillonnage.REMARQUE: Ne laissez pas le système sans surveillance pendant que LN2 remplit la chambre. Attendez environ 30-45 minutes pour permettre au système de refroidir et de se stabiliser avant de commencer l’acquisition d’image. Vérifiez périodiquement le dewar externe et rechargez-le avec du LN2 filtré s’il est rempli de moins d’un quart (environ toutes les heures). 2. Transfert de la boîte de stockage de l’échantillon dans la cryo-étape REMARQUE: Immergez la boîte de stockage de l’échantillon, le support et les extrémités de tout instrument (par exemple, les pinces) à l’intérieur du LN2 filtré pour les refroidir avant de toucher des surfaces froides telles que l’échantillon ou tout objet à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage. Portez un manteau de laboratoire et des gants lorsque vous manipulez des échantillons biologiques. Assurez-vous que les échantillons vitrifiés sont dans un récipient cryocompatible et apportez-les au microscope. Appuyez sur le bouton correspondant de l’étage cryogénique pour allumer la lumière dans la chambre d’échantillonnage. Utilisez la touche hexadétienne de l’outil cassette pour ouvrir les deux plaques de la cassette de transfert d’échantillons. Ouvrez les plaques assez largement pour tomber dans la grille entre les deux plaques, mais évitez de les ouvrir à la position ouverte maximale pour éviter que la grille ne tombe de l’autre côté. Utilisez de longues pinces pour soulever la boîte de grille d’échantillon hors du LN2,tournez-la à l’endroit où l’encoche s’aligne sur la position de la position de stockage à l’intérieur de la scène et placez-la sur la scène. Utilisez l’appareil approprié (p. ex., un tournevis) pour ouvrir le couvercle de la boîte de rangement à la bonne position de l’échantillon. À l’aide d’une pince inversée (ou de toute pince chirurgicale à pointe fine), retirez la grille TEM du porte-échantillon, immergez-la à l’intérieur du LN2et près de la cassette de transfert d’échantillon, en restant proche du LN2 pendant le processus de transfert. Assurez-vous que le côté du film de carbone est placé de manière à ce qu’il soit finalement orienté vers l’objectif sur le pont d’échantillonnage. Fermez la cartouche d’échantillon à l’aide de la touche hexadétiste de l’outil cassette. Fermez et retirez la boîte de stockage ainsi que les échantillons restants. Utilisez le point magnétique de l’outil de cassette pour soulever et monter la cartouche contenant la grille sur le pont d’échantillonnage. Gardez-le immergé / proche du LN2 pendant le processus de transfert. Assurez-vous que l’orientation est appropriée pour le pont (les deux aimants entreront en contact avec les aimants sur le pont). Placez la cassette à plat dans les broches de positionnement du pont et poussez doucement pour vous assurer qu’elle est fixée.REMARQUE: Une cassette d’échantillon pour les grilles clipsées qui ont été préparées pour le fraisage ultérieur par faisceau d’ions focalisé est également disponible à l’installation CryoSIM à la ligne de faisceau B24. 3. Amarrage et mise au point de la scène Déplacez l’ouverture du couvercle de l’étage cryogénique vers la position d’imagerie et éteignez la lumière de la chambre d’échantillonnage. Faites glisser la scène vers l’optique pour l’aligner sous l’objectif. Laissez doucement tomber l’objectif en position à l’aide du levier, en vous assurant qu’il repose dans le couvercle du cryo-étage, mais ne le touche pas.REMARQUE: Assurez-vous que le tuyau de sortie externe de Dewar ne touche pas le dewar de scène sur le cryo-étage à aucun moment pendant la collecte de données. Couvrez la scène et l’optique avec un rideau noir opaque. Démarrez le logiciel de contrôle Cockpit sur le PC cryoSIM (Figure 3 et Figure 4). Cliquez sur le bouton du mode de lecture pour chaque caméra et réglez-le sur CONV 3 MHz. Vérifiez que la température de chaque caméra est de -80 °C et que le ventilateur de la caméra est éteint. Allumez la caméra réfléchie. Sous Lumières,choisissez ambiant (exposition 20 ms), et sous linkam,cliquez sur condenseur. Cliquez sur le bouton Mode vidéo. Dans la fenêtre mosaïque, effectuez un zoom arrière (défilement de la souris) pour afficher le contour de la grille. Cliquez sur Localiser l’étape si elle ne peut pas être vue. Centrez la grille en double-cliquant avec le bouton gauche au milieu du cercle. Focalisation de l’échantillon jusqu’à ce que le film de support de grille (ou toute autre caractéristique pertinente de l’échantillon) soit mise au point, en utilisant les touches haut et bas pour déplacer l’étage cryogénique vers le haut et vers le bas, et en utilisant les touches 9 et 3 du pavé numérique pour changer le z-step (réglez-le sur 20 μm pour la mise au point initiale).REMARQUE: Si l’utilisateur manque de déplacement en z, la scène peut être déplacée manuellement vers le haut ou vers le bas à l’aide de la roue sous la cryo-étape. Tournez-le d’un cran à la fois et vérifiez si l’échantillon se trouve dans la plage de vue. Modifiez à nouveau la direction si la mise au point s’aggrave. 4. Acquisition de mosaïques en champ clair Une fois la scène centrée, désactivez le mode vidéoet collectez une mosaïque de lumière visible (cliquez sur Exécuter la mosaïque dans la vue Mosaïque pour produire des tuiles d’images de lumière visible qui s’enroulent vers l’extérieur à partir du centre). Si la grille est pliée, essayez différentes positions sur la grille (double-cliquez avec le bouton gauche dans la vue Mosaïque), recentrez-vous et cliquez à nouveau sur Exécuter la mosaïque pour collecter des mosaïques partielles. Vous pouvez également déposer une image focale au-dessus de la mosaïque(Figure 3). Enregistrez la vue en cliquant sur Enregistrer la mosaïque. Donnez-lui un nom de fichier court contenant des informations sur la boîte de stockage et le numéro de grille respectif (un horodatage sera automatiquement ajouté au nom du fichier). 5. Identification des domaines d’intérêt Inspectez la mosaïque de champ lumineux à côté de toutes les images de « carte » de fluorescence précédentes pour savoir où les cellules ou les caractéristiques biologiques d’intérêt ont déjà été localisées. Vérifiez si ces zones produisent une fluorescence appropriée. Éteignez la lumière ambiante et le condenseur ainsi que le mode vidéo s’il est actif. Allumez le laser d’excitation requis (405, 488, 561 ou 647) et choisissez la caméra et le filtrecorrespondants, initialement à 50 mW, pour un temps d’exposition de 50 ms.REMARQUE: Augmentez / diminuez ces paramètres de caméra et de filtre en fonction du signal de fluorescence. Appuyez sur 0 pour prendre une image et sur * pour contraster automatiquement. Vous pouvez également ajuster manuellement le contraste à l’aide du curseur en bas de l’image.REMARQUE: Allumez le panneau Laser on pour la pièce. Une fois que des cellules biologiquement intéressantes avec une fluorescence appropriée ont été trouvées, marquez leurs positions à l’aide du bouton Marquer le site dans la vue Mosaïque.REMARQUE: Ces sites marqués apparaîtront dans la liste ci-jointe et sont accessibles en double-cliquant sur les coordonnées. Lorsque vous revenez à un site marqué, effectuez un zoom sur la zone avant de double-cliquer. Continuez à marquer tous les sites potentiels avant de commencer l’acquisition d’images. Sauvez à nouveau la mosaïque avec les sites marqués; cliquez sur Enregistrer les sites dans le fichier. Pour assembler les images de mosaïque à l’aide du logiciel StitchM (développé en interne à la ligne de faisceau B24), faites glisser et déposez le fichier de mosaïque .txt dans le fichier StitchM avec l’extension .bat et enregistrez l’image tiff combinée des carreaux de mosaïque dans le même dossier. Pour enregistrer une image avec les sites marqués, faites glisser et déposez la mosaïque.txt fichier et les marqueurs.txt fichier dans l’icône en même temps.REMARQUE : Équilibrer la collecte de données par rapport aux besoins du projet (p. ex., si l’imagerie corrélative doit être effectuée, vérifier combien d’images peuvent être prises avec la modalité d’imagerie du partenaire et choisir le nombre approprié de sites pour l’imagerie cryoSIM). De plus, si le dewar externe nécessite un remplissage avec LN2 , le système cryo-étage changera de position et les sites marqués ne reviendront probablement pas aux mêmes endroits; tenez donc compte de cela lors du choix du nombre de sites à imager. 6. Stratégie de collecte de données Réglez le temps d’exposition laser en fonction des nombres dans la plage dynamique de l’image de fluorescence (en bas de la fenêtre des vues de la caméra). Choisissez le filtre à appliquer et optimisez ces paramètres pour chaque longueur d’onde de lumière d’excitation à utiliser, en allumant chaque laser séparément.REMARQUE: Bien que 10 000 à 20 000 comptes soient optimaux, des comptes plus faibles sont acceptables s’il y a un bon contraste. Idéalement, vérifiez les paramètres de filtre avant que chaque pile d’images ne soit acquise, car les cellules situées à différentes zones de la grille peuvent avoir des niveaux de fluorescence variables. 7. Collecte de données Cliquez sur les deux caméras pour les allumer. Revenez à l’un des sites marqués et concentrez-vous à nouveau sur la profondeur souhaitée. Une fois au point dans une zone d’intérêt, déplacez-vous vers le haut (touche ↑) dans la fenêtre XY de la macro-étape pour choisir la hauteur de la pile z à acquérir, puis cliquez sur Enregistrer en haut. Déplacez-vous vers le bas ( touche↓), cliquez sur Enregistrer en bas, puis sur Aller au centre, et vérifiez que l’image est toujours au point.REMARQUE: La hauteur de l’échantillon sera affichée dans la fenêtre. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur slm (modulateur de lumière spatial) dans la fenêtre Cockpit et assurez-vous que l’angle est réglé à 0,41. Dans la fenêtre Cockpit, sélectionnez Expérience sur un seul site.REMARQUE: Ne cliquez pas sur le slm; Cockpit l’allumera automatiquement lors de l’acquisition d’images. Dans la liste déroulante, sélectionnez Éclairage structuré. Modifiez la hauteur de la pile pour qu’elle soit égale à la hauteur z + 1 μm.REMARQUE: L’ajout de 1 μm assure la capture de l’échantillon entier en z et minimise les artefacts de reconstruction. Entrez les temps d’exposition (ms) pour les lasers 405 nm et 488 nm dans la rangée supérieure (pour la caméra réfléchie) et les temps d’exposition pour les lasers 561 nm et 647 nm dans la rangée inférieure (pour la caméra transmise).REMARQUE: Les valeurs du temps d’exposition doivent correspondre aux valeurs décidées précédemment et affichées dans la fenêtre principale du cockpit. Entrez un nom de fichier (convention de nommage : boîte number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescence) ou BF (champ lumineux) selon le type d’imagerie en cours). Cliquez sur Mettre à jour pour produire un nouveau fichier contenant la date et l’heure sans écraser les fichiers précédents. Ensuite, cliquez sur Démarrer. Vérifiez la vue Caméra pendant la collecte des données. Repaitez les images s’il y a un déplacement xy. Si le dewar LN2 remplit l’étage cryogénique lors de l’acquisition de l’image, abandonnez le processus en cliquant sur le bouton Abandonner du logiciel Cockpit. Une fois que le dewar externe a fini de remplir le dewar d’étage, répétez l’expérience car la recharge déplace l’échantillon verticalement. Recentrez l’image pour la recentrer en z et répétez l’expérience Sur un seul site. Répétez l’expérience sur un seul site pour toutes les combinaisons de lasers et de filtres nécessaires.REMARQUE: Il faut environ 30 s-1 min pour terminer le remplissage. Lors de l’imagerie d’une grille, le remplissage aura lieu ~ 4-8x. À chaque position, collectez une pile z à l’aide de la lumière visible. Éteignez les lasers et allumez la lumière ambiante et le condenseur. Sous Expérience sur un seul site,sélectionnez Z-stack, réglez la lumière ambiante sur une exposition de 20 ms et conservez la hauteur z comme ci-dessus. Répétez les étapes 7.2 à 7.4 pour tous les sites marqués sur la grille. Avant de passer à un autre exemple, supprimez la mosaïque en cliquant sur Supprimer les vignettes. Dessinez un carré autour de toutes les tuiles pour les supprimer. Supprimez également les marqueurs en les sélectionnant tous dans la liste, puis en cliquant sur Supprimer les sites sélectionnés. Éteignez la lumière ambiante et le condenseur avant de procéder au changement de grille. Suivez les étapes de la section 4 dans l’ordre inverse pour détacher l’étape de l’objectif et modifier la grille. 8. Après imagerie Une fois l’imagerie terminée, désamarrer la scène et retirer tous les échantillons. Éteignez le voyant de la chambre d’échantillonnage. Débranchez le dewar externe et décantez tout LN2 restant dans un autre récipient cryo-compatible, ce qui permet au dewar de revenir en toute sécurité à une température normale. Placez le bouchon du couvercle sur la cryo-scène. Attendez que l’option de cuisson de l’écran cryo-étage soit disponible après qu’il ne reste plus de LN2 dans le dewar de scène. Appuyez sur le bouton de cuisson pour entrer en mode chauffage et retirez toute humidité de la cryo-étape pour éviter la formation de glace. 9. Reconstruction Transférez les fichiers de données SIM brutes vers le poste de travail approprié pour la reconstruction. Exécutez le traitement par lots via la fenêtre Du générateur de tâches de traitement à l’aide de fonctions de transfert optique spécifiques au canal (OTFS) (calculées à partir de fonctions d’étalement de points de billes multifluorées) et d’angles K0 (0,29278, -1,8028, 2,3786) avec un filtre Wiener constant pour tous les canaux de 0,004 et un décalage de biais de 200. Dans le panneau Options supplémentaires, assurez-vous que les intensités négatives sont ignorées en ne cochant pas les autres options. Enregistrez les images SIR dans un dossier nommé “traité« .REMARQUE: Les logiciels de reconstruction SIM commerciaux produisent généralement des données SIM reconstruites et conservent le nom du fichier, mais ajoutent SIR.dv à la fin. Un fichier journal contenant le protocole de traitement, les étapes et les informations statistiques sur la réussite de la reconstruction est également créé. 10. Correction chromatique du décalage Téléchargez le logiciel Chromagnon7 pour corriger le décalage chromatique. Utilisez la matrice de référence du décalage chromatique qui correspond aux longueurs d’onde de fluorescence des données collectées (fournies par la ligne de faisceau).REMARQUE: Le fichier de référence est un fichier « chromagnon.csv », qui contient les paramètres d’alignement et a été obtenu à partir d’images d’étalonnage à l’aide de nanoparticules multifluorées. Il peut être utilisé pour traiter par lots plusieurs ensembles de données à la fois. Choisissez le fichier de référence approprié qui correspond à la longueur d’onde laser et au filtre utilisés pour l’imagerie de l’échantillon, puis ajoutez-le au champ de référence. Ajoutez les données SIR reconstruites à aligner dans le champ source, puis cliquez sur Exécuter. Vérifiez que le signal de fluorescence est maintenant aligné dans les images. Pour le traitement par lots, placez toutes les images SIR à aligner dans le champ source et le fichier de référence dans le champ de référence, puis appuyezsur Exécuter tout .