Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

OPMERKING: Dit protocol heeft betrekking op monsters die cellen bevatten die zijn gekweekt of afgezet op transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) 3 mm platte gouden roosters met een gatachtige koolstofondersteuningsfilm die zijn verglaasd door ondervriezen of hoge druk bevriezen. Dit protocol gaat ervan uit dat monsters al in beeld zijn gebracht met behulp van een conventionele epifluorescentie- en brightfieldmicroscoop om locaties in kaart te brengen die van belang zijn voor beeldvorming in cryoSIM. Zie figuur 1 voor een overzicht van het gehele protocol. 1. Voorbereiding van de cryofase Bereid ijsvrije vloeibare stikstof (LN2) door LN2 door een trechter te laten gaan die is bekleed met standaard wetenschappelijke droogpapierdoekjes.OPMERKING: Aangezien LN2 brandwonden veroorzaakt, moet u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen dragen, inclusief cryo-beschermende handschoenen en brillen, wanneer u deze hanteert. Dergelijke vloeistoffen kunnen zuurstof verdringen en snelle verstikking veroorzaken en moeten in een goed geventileerde ruimte worden behandeld. Verwijder oppervlaktestof uit de cryo-fase met lucht onder druk. Verdrijft vloeistof uit de luchtcontainer onder druk voordat u deze gebruikt. Zorg ervoor dat de patroon voor het laden van het monster op zijn plaats is met de juiste monsterhouder met kamer (controleer of er geen raster meer is in de monsterhouder van een eerder experiment) (figuur 2). Verwijder het deksel van de uitwendige dewar van de cryotrap en giet gefilterd LN2 tot ongeveer 1/4e vol. Wacht tot het eerste koken afneemt voordat je meer giet; vul het vat tot ongeveer 2/3rd vol. Plaats het deksel voorzichtig terug en wijs het mondstuk weg van de handler en het podium/de optiek terwijl LN2 uit de uitlaat kookt. Zodra LN2 niet meer uit de uitlaat komt, plaatst u de uitlaatpijp over het podium dewar op de cryo-trap. Sluit de voedingsbron van het podium aan en sluit de USB-kabel aan op de cryotrap. Zorg ervoor dat het deksel van de verwarmde monsterkamer is aangesloten. Sluit de externe dewar aan op het podium.OPMERKING: Sluit de externe dewar niet aan totdat de uitlaatpijp over het podium dewar op de cryotrap is geplaatst. Als LN2 overloopt (of om te voorkomen dat deze overloopt), trekt u de USB-kabel voor ~ 10 s uit, laat u deze in evenwicht brengen en sluit u de USB-kabel opnieuw aan om de sensor opnieuw te activeren. Nadat LN2 in de fase dewar is afgeleverd, drukt u op de ontspanknop op de cryotrap om LN2 in de monsterkamer te laten komen.OPMERKING: Laat het systeem niet onbeheerd achter terwijl LN2 de kamer vult. Wacht tot ~ 30-45 minuten om het systeem te laten afkoelen en stabiliseren voordat u met de beeldacquisitie wordt beginnen. Controleer regelmatig de externe dewar en vul bij met gefilterd LN2 als deze minder dan een kwart vol is (ongeveer elk uur). 2. Breng de monsteropslagbox over naar de cryofase OPMERKING: Dompel de monsteropslagdoos, houder en de uiteinden van instrumenten (bijv. Een tang) onder in gefilterd LN2 om ze te koelen voordat u koude oppervlakken zoals het monster of objecten in de monsterkamer aanraakt. Draag een laboratoriumjas en handschoenen bij het hanteren van biologische monsters. Zorg ervoor dat verglaasde monsters zich in een cryo-compatibele container bevinden en breng ze naar de microscoop. Druk op de overeenkomstige knop op de cryotrap om het licht in de monsterkamer aan te doen. Gebruik de in-in-in-toets op het cassettegereedschap om de twee platen van de sample transfer cassette te openen. Open de platen breed genoeg om in het rooster tussen de twee platen te vallen, maar vermijd opening naar de maximale open positie om te voorkomen dat het rooster door de andere kant valt. Gebruik een lange tang om de monsterrasterdoos uit de LN2te tillen, draai deze waar de inkeping is uitgelijnd met de positie van de opslagpositie in het werkgebied en plaats deze op het werkveld. Gebruik het juiste apparaat (bijvoorbeeld een schroevendraaier) om het deksel van de opbergdoos in de juiste monsterpositie te openen. Gebruik een omgekeerde tang (of een chirurgische tang met fijne punt), verwijder het TEM-raster uit de monsterhouder, dompel het onder in de LN2en laat het op zijn plaats vallen in de monsteroverdrachtscassette, dicht bij de LN2 tijdens het overdrachtsproces. Zorg ervoor dat de koolstoffilmzijde zo is geplaatst dat deze uiteindelijk naar het doel op de monsterbrug wordt gericht. Sluit de monstercartridge met de in-in-toets op het cassettegereedschap. Sluit en verwijder de opbergdoos samen met eventuele resterende monsters. Gebruik het magneetpunt op het cassettegereedschap om de cartridge met het rooster op de monsterbrug te tillen en te monteren. Houd het ondergedompeld / dicht bij de LN2 tijdens het overdrachtsproces. Zorg ervoor dat de oriëntatie geschikt is voor de brug (de twee magneten maken contact met de magneten op de brug). Plaats de cassette plat in de positioneringspennen van de brug en duw voorzichtig om ervoor te zorgen dat deze is bevestigd.OPMERKING: Een monstercassette voor geknipte roosters die zijn voorbereid voor het daaropvolgende gerichte ionenbundelfrezen is ook verkrijgbaar bij de CryoSIM-faciliteit op beamline B24. 3. Podium docking en scherpstellen Verplaats de opening van het cryotrapdeksel naar de beeldvormingspositie en schakel het lampje van de monsterkamer uit. Schuif het podium naar de optiek om het onder de objectieflens uit te lijnen. Laat het objectief voorzichtig in positie vallen met behulp van de hendel en zorg ervoor dat het in het deksel van de cryo-trap rust, maar het niet raakt.OPMERKING: Zorg ervoor dat de externe uitlaatpijp van Dewar op geen enkel moment tijdens het verzamelen van gegevens het podium dewar op de cryo-fase raakt. Bedek het podium en de optiek met een ondoorzichtig zwart gordijn. Start de besturingssoftware Cockpit op de cryoSIM PC(Figuur 3 en Figuur 4). Klik op de uitleesmodusknop voor elke camera en stel deze in op CONV 3 MHz. Controleer of de temperatuur van elke camera -80 °C is en of de ventilator van de camera is uitgeschakeld. Schakel de gereflecteerde camera in. Kies onder Lichtende omgeving (belichting 20 ms) en klik onder linkamop condensor. Klik op de knop Videomodus. Zoom in het venster Mozaïekweergave uit (muisschuiven) om de rasteromtrek te zien. Klik op Het stadium zoeken als het niet kan worden gezien. Centreer het raster door met de linkermukslag in het midden van de cirkel te dubbelklikken. Stel het monster scherp totdat de rasterondersteuningsfilm (of een andere relevante voorbeeldfunctie) scherp is, gebruik de toetsen omhoog en omlaag om de cryotrap op en neer te bewegen en gebruik de toetsen 9 en 3 op het numerieke pad om de z-stap te wijzigen (stel deze in op 20 μm voor de eerste scherpstelling).OPMERKING: Als de gebruiker geen verplaatsingen meer in z heeft, kan het podium handmatig omhoog of omlaag worden verplaatst met behulp van het wiel onder de cryotrap. Draai het met één inkeping tegelijk en controleer of het monster zich binnen het weergavebereik bevindt. Verander de richting opnieuw als het scherpstellen verslechtert. 4. Brightfield mozaïek acquisitie Zodra het podium is gecentreerd, schakelt u de videomodusuit en verzamelt u een zichtbaar lichtmozaïek (klik op Mozaïek uitvoeren in de weergave Mozaïek om tegels met zichtbare lichtafbeeldingen te produceren die vanuit het midden naar buiten spiralen). Als het raster is gebogen, probeert u verschillende posities in het raster (dubbelklik met de linkermuk in de mozaïekweergave),stelt u opnieuw scherp en klikt u nogmaals op Mozaïek uitvoeren om gedeeltelijke mozaïeken te verzamelen. U kunt ook een scherpgefocust beeld bovenop het mozaïek laten vallen (figuur 3). Sla de weergave op door op Mozaïek opslaante klikken . Geef het een korte bestandsnaam met informatie over de opslagdoos en het respectieve rasternummer (een tijdstempel wordt automatisch aan de bestandsnaam toegevoegd). 5. Identificatie van interessegebieden Inspecteer het brightfield-mozaïek naast eerdere fluorescentie “kaart” -afbeeldingen voor waar cellen of biologische kenmerken van belang zich eerder hebben gevestigd. Controleer of die gebieden geschikte fluorescentie produceren. Schakel het omgevingslicht en de condensor uit, evenals de videomodus indien actief. Schakel de vereiste excitatielaser in (405, 488, 561 of 647) en kies de bijbehorende camera en filter, in eerste instantie bij 50 mW, gedurende een belichtingstijd van 50 ms.OPMERKING: Verhoog/verlaag deze camera- en filterinstellingen afhankelijk van het fluorescentiesignaal. Druk op 0 om een afbeelding vast te maken en op * om automatisch te contrasteren. U kunt het contrast ook handmatig aanpassen met de schuifregelaar onder aan de afbeelding.OPMERKING: Schakel het laser-aan-teken in voor de kamer. Zodra biologisch interessante cellen met geschikte fluorescentie zijn gevonden, markeert u hun posities met behulp van de knop Site markeren in de mozaïekweergave.OPMERKING: Deze gemarkeerde sites verschijnen in de bijgevoegde lijst en zijn toegankelijk door te dubbelklikken op de coördinaten. Wanneer u terugkeert naar een gemarkeerde site, zoomt u in op het gebied voordat u dubbelklikt. Ga door met het markeren van alle potentiële sites voordat u met het verwerven van afbeeldingen wordt. Bewaar het mozaïek opnieuw met de gemarkeerde sites; klik op Sites opslaan om te archiveren. Om de mozaïekafbeeldingen aan elkaar te naaien met behulp van de StitchM-software (in eigen huis ontwikkeld bij beamline B24), sleept u het .txt mozaïekbestand naar het StitchM-bestand met de extensie .bat en slaat u de gecombineerde tiff-afbeelding van de mozaïektegels op in dezelfde map. Als u een afbeelding met de gemarkeerde sites wilt opslaan, sleept u het mozaïek.txt bestand en het markeringsbestand.txt tegelijkertijd naar het pictogram.OPMERKING: Weeg de gegevensverzameling af tegen de behoeften van het project (bijvoorbeeld, als correlatieve beeldvorming zal worden uitgevoerd, controleer dan hoeveel beelden kunnen worden gemaakt met de partner-imaging modaliteit en kies het juiste aantal locaties voor cryoSIM-beeldvorming). Bovendien, als de externe dewar moet worden bijgevuld met LN2, zal het cryotrapsysteem van positie veranderen en zullen de gemarkeerde locaties waarschijnlijk niet terugkeren naar dezelfde locaties; houd hier daarom rekening mee bij het kiezen van het aantal sites dat moet worden afgebeeld. 6. Strategie voor gegevensverzameling Stel de laserbelichtingstijd in op basis van de tellingen in het dynamische bereik in het fluorescentiebeeld (onder aan het cameraweergavevenster). Kies welk filter u wilt toepassen en optimaliseer deze instellingen voor elke golflengte van het te gebruiken excitatielicht, waarbij elke laser afzonderlijk wordt ingeschakeld.OPMERKING: Hoewel 10.000-20.000 tellingen optimaal zijn, zijn lagere tellingen acceptabel als er een goed contrast is. Idealiter controleert u de filterinstellingen voordat elke afbeeldingsstapel wordt verkregen, omdat cellen op verschillende delen van het raster variabele fluorescentieniveaus kunnen hebben. 7. Gegevensverzameling Klik op beide camera’s om ze in te schakelen. Keer terug naar een van de gemarkeerde locaties en concentreer u opnieuw op de gewenste diepte. Eenmaal scherpgesteld in een interessegebied, beweegt u onscherp naar boven (↑ toets) in het XY-venster in de macrofase om de hoogte van de z-stapel te kiezen die u wilt verkrijgen en klikt u op Bovenaan opslaan. Ga onscherp naar beneden (↓ toets), klik op Opslaan onderaan en vervolgens op Ga naar het middenen controleer of de afbeelding nog steeds scherp is.OPMERKING: De hoogte van het monster wordt weergegeven in het venster. Klik met de rechtermuisknop op slm (spatial light modulator) in het Cockpit-venster en zorg ervoor dat de hoek is ingesteld op 0,41. Selecteer in het cockpitvenster de optie Experiment met één site.OPMERKING: Klik niet op de slm op; Cockpit schakelt het automatisch in tijdens het verzamelen van afbeeldingen. Selecteer gestructureerde verlichtingin de vervolgkeuzelijst . Wijzig de stapelhoogte zodat deze gelijk is aan de z-hoogte + 1 μm.OPMERKING: De toevoeging van 1 μm zorgt voor de vangst van het volledige monster in z en minimaliseert reconstructieartefacten. Voer de belichtingstijden (ms) in voor de lasers van 405 nm en 488 nm in de bovenste rij (voor de gereflecteerde camera) en de belichtingstijden voor de lasers van 561 nm en 647 nm in de onderste rij (voor de verzonden camera).OPMERKING: De waarden voor de belichtingstijd moeten overeenkomen met de waarden die eerder zijn vastgesteld en in het hoofdvenster van de cockpit worden weergegeven. Voer een bestandsnaam in (naamgevingsconventie: vak number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescentie) of BF (brightfield), afhankelijk van het type beeldvorming dat wordt uitgevoerd). Klik op Bijwerken om een nieuw bestand met de datum en tijd te maken zonder eerdere bestanden te overschrijven. Klik vervolgens op Start. Controleer de cameraweergave terwijl gegevens worden verzameld. Maak de afbeeldingen opnieuw als er sprake is van xy-verplaatsing. Als de LN2 dewar de cryo-fase tijdens de beeldacquisitie bijvult, onderbreekt u het proces door op de knop Afbreken in de Cockpit-software te klikken. Zodra de externe dewar klaar is met het bijvullen van de stage dewar, herhaalt u het experiment omdat de navulling het monster verticaal verplaatst. Stel de afbeelding opnieuw scherp om deze opnieuw te centreren in z en herhaal het experiment met één site. Herhaal het single-site experiment voor alle combinaties van lasers en filters die nodig zijn.OPMERKING: Het duurt ongeveer 30 s-1 minuut om het bijvullen te voltooien. Tijdens het afbeelden van één raster gebeurt het bijvullen ~ 4-8x. Verzamel op elke positie een z-stapel met zichtbaar licht. Schakel de lasers uit en schakel omgevingslicht en condensor in. Selecteer onder Experiment met één locatiede optie Z-stack, stel het omgevingslicht in op 20 ms belichting en houd de z-hoogte zoals hierboven. Herhaal stap 7.2 tot en met 7.4 voor alle sites die in het raster zijn gemarkeerd. Voordat u naar een ander voorbeeld gaat, verwijdert u het mozaïek door op Tegels verwijderente klikken . Teken een vierkant rond alle tegels om ze te verwijderen. Verwijder de markeringen ook door ze allemaal in de lijst te selecteren en vervolgens op Geselecteerde sites verwijderente klikken . Schakel het omgevingslicht en de condensor uit voordat u doorgaat met het wijzigen van het raster. Volg de stappen in sectie 4 in omgekeerde volgorde om de fase los te koppelen van onder het doel en het rooster te wijzigen. 8. Na beeldvorming Nadat de beeldvorming is voltooid, koppelt u het podium los en verwijdert u alle monsters. Schakel het lampje van de monsterkamer uit. Koppel de externe dewar los en decanteer de resterende LN2 in een andere cryocompatibele container, zodat de dewar veilig kan terugkeren naar een normale temperatuur. Plaats de dekselplug op de cryo-trap. Wacht tot de optie om het cryo-stage display uit te bakken beschikbaar komt nadat er geen LN2 meer in het stadium dewar is achtergebleven. Druk op de bake-out-knop om de verwarmingsmodus te openen en verwijder vocht uit de cryo-fase om ijsvorming te voorkomen. 9. Wederopbouw Breng onbewerkte SIM-gegevensbestanden over naar het juiste werkstation voor reconstructie. Voer de verwerking in batches uit via het venster Verwerkingstaakbouwer met behulp van kanaalspecifieke optische overdrachtsfuncties (OTFS) (berekend op basis van multi-fluorescerende kralenpuntspreidingsfuncties) en K0-hoeken (0,29278, -1,8028, 2,3786) met een constant Wiener-filter voor alle kanalen van 0,004 en een vertekeningsverschuiving van 200. Zorg er in het deelvenster Extra opties voor dat negatieve intensiteiten worden weggegooid door andere opties niet aan te vinken. Sla de SIR-afbeeldingen op in een map met de naam “verwerkt”.OPMERKING: Commerciële SIM-reconstructiesoftware produceert meestal gereconstrueerde SIM-gegevens en behoudt de bestandsnaam, maar voegt SIR.dv aan het einde toe. Er wordt ook een logboekbestand gemaakt dat het verwerkingsprotocol, de stappen en statistische informatie over het succes van de reconstructie bevat. 10. Chromatische verschuivingscorrectie Download de software Chromagnon7 om te corrigeren voor de chromatische verschuiving. Gebruik de chromatische verschuivingsreferentiematrix die overeenkomt met de fluorescentiegolflengten van de verzamelde gegevens (geleverd door de bundellijn).OPMERKING: Het referentiebestand is een ‘chromagnon.csv’-bestand, dat de uitlijningsparameters bevat en is verkregen uit kalibratiebeelden met behulp van multi-fluorescerende nanodeeltjes. Het kan worden gebruikt om meerdere datasets tegelijk batchgewijs te verwerken. Kies het juiste referentiebestand dat overeenkomt met de lasergolflengte en het filter dat wordt gebruikt voor het afbeelden van het monster en voeg het toe aan het referentieveld. Voeg de gereconstrueerde SIR-gegevens toe die moeten worden uitgelijnd in het bronveld en klik op Uitvoeren. Controleer of het fluorescentiesignaal nu is uitgelijnd in de beelden. Voor batchverwerking plaatst u alle SIR-afbeeldingen die moeten worden uitgelijnd in het bronveld en het referentiebestand in het referentieveld en drukt u op Alles uitvoeren.