جمع البيانات المجهرية للإضاءة المهيكلة بالتبريد من الخلايا المحفوظة بالتبريد
Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية تصوير العينات البيولوجية المحفوظة بالتبريد باستخدام المجهر الإضاءة منظم التبريد. نحن نثبت المنهجية من خلال تصوير الهيكل الخلوي لخلايا U2OS.
Abstract
يسمح المجهر ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) المجسم للإضاءة (SIM) بتصوير الهياكل الخلوية ذات العلامات الفلورية بدقة أعلى من المجهر الفلوري التقليدي. هذه التقنية فائقة الدقة (SR) تمكن من تصور العمليات الجزيئية في خلايا كاملة ولديها القدرة على استخدامها جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني والتصوير المقطعي بالأشعة السينية لربط المعلومات الهيكلية والوظيفية. تم مؤخرا تشغيل مجهر SIM للعينات المحفوظة بالتبريد (cryoSIM) في خط الحزمة المترابط للتصوير بالتبريد B24 في السنكروترون في المملكة المتحدة.
وقد صمم خصيصا للتصوير ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية في درجات حرارة المبردة بطريقة تتوافق مع التصوير اللاحق لنفس العينات عن طريق طرق الفحص المجهري بالأشعة السينية مثل التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة. توفر هذه المقالة الفيديو أساليب مفصلة وبروتوكولات التصوير الناجح باستخدام cryoSIM. بالإضافة إلى التعليمات المتعلقة بتشغيل مجهر cryoSIM ، تم تضمين توصيات بشأن اختيار العينات والفلوروفوريس وإعدادات المعلمة. يتم عرض البروتوكول في عينات خلايا U2OS التي تم وضع علامة فلورية على الميتوكوندريا والتوبيولين.
Introduction
أصبحت تقنيات التصوير ريال على نطاق واسع في متناول علماء الأحياء على مدى العقد الماضي1. وهي تسمح بتصوير عالي الدقة للعينات الموسومة بالفلورسنت بما يتجاوز حد الحيود. ومع ذلك ، فقد كان من الصعب تكييف طرق الفحص المجهري SR للعمل مع العينات في درجات الحرارة المبردة2. وهذا سيكون مفيدا للتصوير المترابط بالاشتراك مع التصوير المقطعي للإلكترون أو الأشعة السينية. في الآونة الأخيرة ، تم تكييف SIM للاستخدام مع عينات التبريد ، وقد ثبت بنجاح لتمكين الدراسات المترابطة للخلايا البيولوجية بالتزامن مع التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة (SXT)3 في خط الحزمة المترابط للتصوير بالتبريد B24 في مصدر الضوء الماسي Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). يمكن لبطاقة SIM مضاعفة دقة المجهر التقليدي واسع المجال من خلال إضاءة العينة بأنماط مخططة للضوء (هامش Moiré) في ثلاث زوايا وعلى خمس مراحل. التداخل بين هذه الأنماط الخفيفة وفلورسينس عينة يمكن استخدامها لكشف حسابيا معلومات إضافية حول هياكل تحت الحيود4،5.
هناك العديد من مزايا SIM على تقنيات SR الأخرى للتطبيقات المبردة. أولا، يمكن أن تعمل دون الفلوروفورات وامض مصممة خصيصا. يمكن استخدام الفلوروفوريس التقليدية، مما يتيح الوصول إلى مجموعة واسعة من عوامل وضع العلامات الفلورية المحتملة6. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتطلب فقط 15 صورة لكل شريحة z (في 3D ؛ 9 صور ل2D) ، في حين أن أساليب SR الأخرى تأخذ ما يقرب من 1000 صورة لكل شريحة ، مما يزيد من فرصة تسخين العينة وبالتالي يزيد من خطر تكوين بلورة الجليد ، والتي يمكن أن تسبب القطع الأثرية. وأخيرا، يمكن لهذه التقنية صورة عينات بيولوجية أكثر سمكا من أكثر من 10 ميكرومتر، مما يسمح للخلايا بأكملها أن تكون مصورة في حالتها شبه الأصلية6. وقد تم بناء cryoSIM باستخدام المكونات البصرية القياسية ومع برنامج مفتوح الوصول للتصوير، مما يجعل من السهل توثيق وتكرار إذا رغبتفي 6. و cryoSIM لديه 100x/0.9 هدف الفتحة العددية (انظر جدول المواد)؛ مزيد من المعلومات حول مكوناته البصرية، معلمات التصميم، والأداء وقد وصفت فيليبس وآخرون6 هنا، هذا البروتوكول يوضح كيفية استخدام المجهر cryoSIM بما في ذلك كيفية تحميل وتفريغ العينات على مرحلة التبريد، وكيفية جمع البيانات على المجهر، وكيفية إعادة بناء الصور SIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D SIM في درجات الحرارة المبردة لديها العديد من المزايا على تقنيات التصوير ريال أخرى لتصوير المواد البيولوجية المهزوسة. فإنه يتطلب صورا أقل بكثير لكل شريحة ض مقارنة مع غيرها من أساليب ريال، مما أدى إلى تشعيع أقل وفرصة أقل لتشكيل الكريستال الجليدي للعينات تهتز. كما أنها قادرة على تصوير خلايا كاملة ويمكن ربطها بالتصوير المقطعي بالأشعة السينية لمطابقة الهيكل مع الوظيفة. ومن المثير للاهتمام، أن معظم الفلوروفوريس المتاحة تجاريا وعلامات الفلورسينس تبيض أقل في ظل ظروف التبريد مما كانت عليه في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع غلة الكم من الفلوروفوريس الأكثر شيوعا في درجة حرارة الغرفة (أكثر من 80 ٪ في بعض الحالات) ، فإن الكسب المطلق الذي تم اكتشافه في الفوتونات لا يرجع إلى التغيرات في غلة الكم ، ولكن بسبب انخفاض في عمليات التبييض المعقدة. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول غلة الفلوروفوريس في درجات الحرارة المبردة في 8.
ومن الأهمية بمكان أن العينات التي تصل إلى cryoSIM قد تم premapped باستخدام المجهر التبريد التقليدية مع قدرة brightfield لإنتاج شبكة “خريطة” التي تشمل تسليط الضوء على جميع AOIs المحتملة لمزيد من التصوير (الشكل 5). يتم تخصيص وقت الوصول في cryoSIM من خلال عملية تنافسية تنطوي على تقديم اقتراح ، والذي يتم تقييمه لاحقا لجدوى التقنية والتأثير الطبي الحيوي. الوقت في المعدات، لذلك، هو دائما “في قسط”، والشبكات premapped تسمح باستخدام الأكثر كفاءة من التخصيص. ومن الضروري أيضا أن تبقى العينة مهززة، لا سيما أثناء نقل العينة من حامل العينة إلى منصة التصوير، لتقليل تكوين بلورات الجليد والأضرار اللاحقة للعينة. يجب أن تكون العينة ذات نوعية جيدة لإنتاج أفضل صور SIM. وتتميز عينة معدة إعدادا جيدا بالسمات التالية: (أ) لن يكون لها تلوث بلوري جليدي، (ب) الشبكة المستخدمة ستكون شبكة مكتشف، (ج) الناقل سيكون مسطحا، (د) شبكة الشبكة وسطح الركيزة لن يكونا فلوريين تلقائيا، و(ه) لن تكون هناك فواصل في غشاء الدعم. ويمكن تحقيق هذه الشروط المسبقة عن طريق المعالجة الدقيقة للعينات وضمان بقاء العينات دائما في حيرة من العمر.
من المهم التحقق مسبقا مما إذا كانت عينات الفلوروفور المقترحة ستعطي إشارة كافية في مجهر cryoSIM. أدوات مثل SPEKCheck9 يمكن أن تساعد مع اختيار الفلوروفور الأمثل وتركيبات التصفية. إذا كانت هناك مشاكل في جمع البيانات الخام أو عملية إعادة الإعمار، يمكن أن تظهر القطع الأثرية في الصور بعد إعادة الإعمار. تم توثيق أمثلة من القطع الأثرية المختلفة من قبل Demmerle et al.10 يمكن مراجعة معلمات إعادة بناء الصورة في ملف سجل SoftWoRx إذا لم يكن إعادة الإعمار الأمثل عن طريق فتح ملف ملخص إعادة الإعمار. يجب أن يكون هناك تباعد أسطر متناسق عبر زوايا في قناة معينة واتساع متناسق نسبيا. يجب إجراء تحقيق أكثر وثيقة في التباين الذي يزيد عن 30٪ والقيم التي تزيد بشكل كبير عن 1 (إذا تم تطبيق تعويض حجم الخرز) ومن المرجح أن يشير إلى فشل عمليات إعادة الإعمار. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام برنامج SIMcheck2 في فيجي لإجراء فحوصات مختلفة على البيانات الخام وإعادة بنائها لتشخيص سبب الأخطاء في إعدادات معلمة التصوير أو إعادة البناء. يمكن أن يساعد فحص SIM وخريطة تباين التشكيل الخاصة به أيضا في تقييم جودة البيانات المعاد بناؤها من خلال تفسير المناطق التي من المرجح أن تكون هياكل حقيقية مقابل قطع أثرية.
انخفاض تباين التشكيل (يظهر بالألوان الداكنة، في الشكل 5E)داخل المنطقة النووية يعني أن هذه المنطقة ستكون أكثر عرضة للقطع الأثرية إعادة الإعمار، مما يعني أن أنماط التجزئة المبينة في النواة يمكن تصنيفها(الشكل 5D)كمصنوع فني. ومن الأرجح أن تعكس مناطق الإشارات الفلورية القوية بدقة الهياكل الأصلية في البيانات المجهزة. وفي المناطق ذات الإشارات الضعيفة التي توزع فيها الفلوروفوريس على مناطق أوسع، مثل السطح الكلي للحوزة، من المرجح أن تتعايش الإشارة الحقيقية مع تجهيز القطع الأثرية، وينبغي توخي الحذر في تفسير تلك البيانات. بعد فحص البيانات المعاد بناؤها كاملة المدى للتأكد من عدم وجود قطع أثرية غريبة ، وأن الخلفية هي غاوسية بشكل عام وتتركز بالقرب من الصفر ، يتم قص البيانات بشكل عام عند الصفر ، أو يجب أن تكون القيمة مشروطة – ذروة إشارة الخلفية – قريبة جدا من الصفر. وهذا يضمن أن النطاق الديناميكي للصورة المعروضة لا تهيمن عليه القطع الأثرية الخلفية السلبية. عندما يتوقع إشارة أضعف، ينبغي توخي المزيد من الحذر في تحليل الميزات وضمان أنها هياكل حقيقية بدلا من التحف إعادة الإعمار.
هناك بعض القيود على نظام التصوير. لأن مرحلة العينة مسطحة، فإن العينات ذات السماكة المتغيرة أو الشبكات غير المسطحة ليست مواضيع مثالية للتصوير. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان سيتم التصوير المترابط باستخدام التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة، لا ينبغي تصوير الخلايا القريبة من حدود الشبكة لأن هذه لن تكون مرئية في مجهر الأشعة السينية أثناء اكتساب سلسلة الميل. وأخيرا، فإن كمية النشاف للعينة قبل الهبوط في التجميد لها تأثير كبير على جودة التصوير؛ نتائج النشاف القليل جدا في العينات التي هي سميكة جدا، وإعطاء صور SIM دون المستوى الأمثل مع الضوضاء الخلفية العالية، في حين أن الكثير من النشاف يمكن أن يسبب الخلايا لتصبح مشوهة، وبالتالي أكثر عرضة للتلف الحرارة من شعاع الليزر الحادث. وباختصار، فإن cryoSIM هي أداة مجهرية مضانة قوية لتصوير العينات البيولوجية في مرحلة شبه أصلية ولها تطبيقات واسعة النطاق في العديد من المناطق.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تلقى هذا المشروع تمويلا من مشروع أفق المفوضية الأوروبية 2020 iNEXT-Discovery. ويعترف .M دوبي بتمويل صندوق ويلكوم الاستئماني (107457/Z/15/Z). وقد نفذ هذا العمل بدعم من مصدر ضوء الماس، الصك B24 (الاقتراح BI25512). شكرنا لموظفي Micron وجميع مستخدمينا ومتعاونينا الممتازين لمساعدتنا في إنشاء cryoSIM وإمكاناته المترابطة.
Materials
| Auto grids | FEI | ||
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
| BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
| Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
| cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
| Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
| cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
| Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
| Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
| Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
| SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
| StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
| TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |
References
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Kounatidis, I., et al. 3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182 (2), 515-530 (2020).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. Practical structured illumination microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).
- Phillips, M. A., et al. CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging. Optica. 7 (7), 802 (2020).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8, 7583 (2018).
- Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).
- Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource. Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
