Эффективный по времени анализ на основе флуоресцентной спектроскопии для оценки статуса полимеризации актина в тканях мозга грызунов и человека

Актин цитоскелетного белка участвует в нескольких клеточных функциях, включая структурную поддержку, клеточный транспорт, подвижность и деление клеток. Актин встречается в равновесии в двух формах: мономерный глобулярный актин (G-актин) и полимеризованный нитевидный актин (F-актин). Быстрые изменения в статусе полимеризации актина (взаимоконверсия между его G- и F-формами) приводят к быстрой сборке и разборке нитей и лежат в основе его регуляторных ролей в клеточной физиологии. Актин образует основной компонент нейрональной цитоскелетной структуры и влияет на широкий спектр нейронных функций^1,2. Следует отметить, что актин цитоскелет является неотъемлемой частью структурной платформы синаптических терминалей. Таким образом, он является основным детерминантом синаптического морфогенеза и физиологии и играет фундаментальную роль в контроле размера, количества и морфологии синапсов^3,4,5. В частности, динамическая полимеризация-деполимеризация актина является ключевым фактором, определяющим синаптическое ремоделирование, связанное с синаптической пластичностью, лежащей в основе процессов памяти и обучения. Действительно, как пресинаптические (такие как высвобождение нейромедиаторов^6,7,8,9,10),так и постсинаптические функции (пластичность, связанная с динамическим ремоделированием^11,12,13,14)критически полагаются на динамические изменения статуса полимеризации актинового цитоскелета.

В физиологических условиях уровни F-актина динамически и жестко регулируются через мультимодальный путь, включающий посттрансляционную модификацию^4,15,16, а также актин-связывающие белки (ABP)^4,17. ABP могут влиять на динамику актина на нескольких уровнях (таких как инициирование или ингибирование полимеризации, индуцирование ветвления нити, разрыв нитей на более мелкие кусочки, содействие деполимеризации и защита от деполимеризации) и, в свою очередь, находятся под строгим модулирующим контролем, чувствительным к различным вне- и внутриклеточным сигналам^18,19,20. Такие регуляторные проверки на нескольких уровнях диктуют строгую регуляцию динамики актина в синаптическом цитоскелете, тонкую настройку пред- и постсинаптических аспектов физиологии нейронов как в базальном, так и в индуцированном активностью состояниях.

Учитывая важную роль актина в физиологии нейронов, неудивительно, что несколько исследований предоставили доказательства изменений в динамике актина как критических патогенных событий, связанных с широким спектром неврологических расстройств, включая нейродегенерацию, психологические заболевания, а также заболевания нервного развития^{3,21,22,23,24,25,26,27.} Однако, несмотря на богатство исследовательских данных, указывающих на ключевую роль актина в физиологии нейронов и патофизиологии, в понимании динамики актина, особенно в синаптическом цитоскелете, все еще остаются значительные пробелы. Необходимы дополнительные исследования, чтобы лучше постить нейрональный актин и его изменения в патологических условиях. Одним из основных направлений деятельности в этом контексте является оценка статуса полимеризации актина. Существуют коммерческие наборы на основе вестерн-блоттинга (биохимический набор для анализа G-Actin/F-Actin in vivo; Цитоскелет SKU BK037^28,29) и самодельные анализы для оценки уровня F-актина^6. Однако, поскольку они требуют биохимической изоляции F-актина и G-актина и поскольку их последующая количественная оценка основана на протоколах иммуноблоттинга, они могут занять много времени. Здесь мы сообщаем об анализе на основе флуоресцентной спектроскопии, адаптированном из предыдущего исследования³⁰ с модификациями, которые могут быть использованы для оценки как базальных уровней F-актина, так и динамических изменений в его сборке-разборке. Примечательно, что мы эффективно модифицировали оригинальный протокол, который требует образцов, подходящих для кюветы 1 мл, в текущем формате пластины с 96 скважинами. Таким образом, модифицированный протокол значительно уменьшил количество ткани/ образца, необходимое для анализа. Кроме того, мы предоставляем доказательства того, что протокол подходит не только для гомогенатов мозговой ткани, но и для субклеточных фракций, таких как изолированные синаптические терминали (синаптосомы и синаптоневросомы). Наконец, анализ может быть использован для свежепропарированных тканей мозга грызунов и длительно хранящихся посмертных образцов человеческого мозга. Следует отметить, что, хотя анализ представлен в нейронном контексте, он может быть соответствующим образом распространен на другие типы клеток и физиологические процессы, связанные с ними.