げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

細胞骨格タンパク質アクチンは、構造的なサポート、細胞輸送、細胞運動性および分裂を含む複数の細胞機能に関与している。アクチンは、単量体球状アクチン(G-アクチン)と重合糸状アクチン(F-アクチン)の2つの形態で平衡状態で発生する。アクチンの重合状態の急速な変化(G-とF-の間の相互変換)は、迅速なフィラメントアセンブリと分解をもたらし、細胞生理学におけるその調節の役割の根本となる。アクチンは神経細胞骨格構造の主要な構成要素を形成し、広範囲の神経機能^1,2に影響を及ぼす。注目すべきは、アクチン細胞骨格はシナプス末端の構造プラットフォームの不可欠な部分を形成する。このように、シナプス形態形成および生理学の主要な決定要因であり、シナプス^3、4、5のサイズ、数および形態の制御において基本的な役割を果たしている。特に、動的アクチン重合脱重は、記憶および学習プロセスの基礎となるシナプス可塑性に関連するシナプスリモデリングの重要な決定要因である。実際、シナプス前(例えば、神経伝達物質放出^{6、7、8、9、10)}およびポストナプティック機能(可塑性関連動的リモデリング11、12、13、14など)の両方が^、アクチン細胞骨格の重合状態の動的変化に大きく依存する。

生理学的条件下では、F-アクチンレベルは、翻訳後修飾^4、15、16だけでなく^、アクチン結合タンパク質(AMP)4、17を含むマルチモーダル経路を介して動的^かつ緊密に調節される。AMPは、複数のレベルでアクチンダイナミクスに影響を与えることができ(例えば、重合の発芽または抑制、フィラメント分岐の誘導、フィラメントの小片への切断、脱重化の促進、脱重化からの保護など)、様々な細胞外および細胞内信号^18、19、20に敏感な厳格な調節制御の下にある。複数のレベルでのこのような調節チェックは、シナプス細胞骨格におけるアクチンダイナミクスの厳格な調節を指示し、基底および活動誘発状態の両方で神経生理学の前および後のナプティックな側面を微調整する。

神経生理学におけるアクチンの重要な役割を考えると、神経変性、心理疾患、神経発達疾患^{3、21、22、23、24、25、26、27}を含む神経疾患の広い範囲に関連する重要な病原性事象として^、アクチンダイナミクスの変化の証拠を提供したいくつかの研究が驚くべきことではない。しかし、神経生理学や病態生理学におけるアクチンの重要な役割を指摘する豊富な研究データにもかかわらず、アクチンダイナミクス、特にシナプス細胞骨格の理解には依然として大きなギャップが残っています。より多くの研究は、病理学的条件下での神経アクチンとその変化のより良い理解を持っている必要があります。.この文脈における主な焦点領域の1つは、アクチン重合状態の評価である。ウエスタンブロッティングベースの商用キット(G-アクチン/F-アクチン in vivoアッセイ生化学キット;細胞骨格SKU BK037^28,29)及びF-アクチンレベル⁶の評価のための自家製アッセイ。しかし、これらはF-アクチンとG-アクチンの生化学的分離を必要とし、その後の定量化は免疫ブロッティングプロトコルに基づいているため、時間がかかる可能性があります。我々は、F-アクチンの基底レベルの両方を評価するために使用できる修飾を用いて、以前の研究³⁰から適応した蛍光分光法ベースのアッセイと、その組立分解の動的変化を報告する。特に、1 mLキュベットに適したサンプルを必要とするオリジナルのプロトコルを、現在の96ウェルプレート形式に効率的に変更しました。したがって、改質されたプロトコルは、アッセイに必要な組織/サンプル量を大幅に減少させました。また、このプロトコルは、脳組織の均質化だけでなく、単離シナプス末端(シナプトソームおよびシナプトニューロソーム)などの細胞内分画にも適しているという証拠を提供する。最後に、このアッセイは、解剖されたばかりのげっ歯類の脳組織と長期保存された死後のヒト脳サンプルに使用することができる。注意すべきは、アッセイは神経細胞の文脈において提示されるが、それらに関連する他の細胞型および生理学的プロセスに好適に拡張することができる。