Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe
Summary
Wir berichten über einen einfachen, zeiteffizienten und auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Hochdurchsatz-Assay zur Quantifizierung von Aktinfilamenten in ex vivo biologischen Proben aus Hirngeweben von Nagetieren und menschlichen Probanden.
Abstract
Actin, der Hauptbestandteil des Zytoskeletts, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Struktur und Funktion. Unter physiologischen Zuständen tritt Aktin im Gleichgewicht in seinen zwei Formen auf: monomeres kugelförmiges (G-Aktin) und polymerisiertes Filament (F-Aktin). An den synaptischen Terminals bildet das Aktin-Zytoskelett die Grundlage für kritische prä- und postsynaptische Funktionen. Darüber hinaus sind dynamische Veränderungen des Aktinpolymerisationsstatus (Interkonversion zwischen kugelförmigen und filamentösen Formen von Aktin) eng mit plastizitätsbedingten Veränderungen der synaptischen Struktur und Funktion verbunden. Wir berichten hier über eine modifizierte fluoreszenzbasierte Methodik zur Beurteilung des Polymerisationsstatus von Aktin unter Ex-vivo-Bedingungen. Der Assay verwendet fluoreszierend markiertes Phalloidin, ein Phallotoxin, das spezifisch an Aktinfilamente (F-Actin) bindet und ein direktes Maß für polymerisiertes filamentöses Aktin liefert. Als Proof of Principle liefern wir den Nachweis für die Eignung des Assays sowohl in Nagetier- als auch in postmortalen menschlichen Hirngewebehomogenaten. Mit Latrunculin A (einem Medikament, das Aktinfilamente depolymerisiert) bestätigen wir den Nutzen des Assays bei der Überwachung von Veränderungen der F-Aktinspiegel. Darüber hinaus erweitern wir den Assay auf biochemische Fraktionen isolierter synaptischer Terminals, wobei wir eine erhöhte Aktinpolymerisation bei Stimulation durch Depolarisation mit hohem extrazellulärem K+bestätigen.
Introduction
Cytoskelettprotein Aktin ist an mehreren zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich struktureller Unterstützung, zellulärem Transport, Zellmotilität und -teilung. Aktin kommt im Gleichgewicht in zwei Formen vor: monomeres kugelförmiges Aktin (G-Aktin) und polymerisiertes filamentöses Aktin (F-Aktin). Schnelle Veränderungen im Polymerisationsstatus von Aktin (Interkonversion zwischen seinen G- und F-Formen) führen zu einem schnellen Auf- und Abbau von Filamenten und liegen seiner regulatorischen Rolle in der Zellphysiologie zugrunde. Aktin bildet den Hauptbestandteil der neuronalen Zytoskelettstruktur und beeinflusst ein breites Spektrum neuronaler Funktionen1,2. Bemerkenswert ist, dass das Aktin-Zytoskelett ein integraler Bestandteil der strukturellen Plattform der synaptischen Terminals ist. Als solches ist es eine wichtige Determinante der synaptischen Morphogenese und Physiologie und spielt eine grundlegende Rolle bei der Kontrolle der Größe, Anzahl und Morphologie der Synapsen3,4,5. Insbesondere die dynamische Aktinpolymerisation-Depolymerisation ist eine Schlüsseldeterminante des synaptischen Umbaus, der mit der synaptischen Plastizität verbunden ist, die den Gedächtnis- und Lernprozessen zugrunde liegt. Tatsächlich hängen sowohl präsynaptische (wie Neurotransmitterfreisetzung6,7,8,9,10) als auch postsynaptische Funktionen (plastizitätsbezogene dynamische Umgestaltung11,12,13,14) kritisch von dynamischen Veränderungen des Polymerisationsstatus des Aktin-Zytoskeletts ab.
Unter physiologischen Bedingungen werden die F-Aktinspiegel dynamisch und eng durch einen multimodalen Weg reguliert, der posttranslationale Modifikation4,15,16 sowie Aktin-bindende Proteine (ABPs)4,17umfasst . ABPs können die Aktindynamik auf mehreren Ebenen beeinflussen (z. B. Initiierung oder Hemmung der Polymerisation, Induktion von Filamentverzweigungen, Durchtrennen von Filamenten in kleinere Stücke, Förderung der Depolymerisation und Schutz vor Depolymerisation) und stehen wiederum unter einer strengen modulatorischen Kontrolle, die empfindlich auf verschiedene extra- und intrazelluläre Signalereagiert 18,19,20. Solche regulatorischen Kontrollen auf mehreren Ebenen diktieren eine strenge Regulierung der Aktindynamik am synaptischen Zytoskelett und verfeinern prä- und postsynaptische Aspekte der neuronalen Physiologie sowohl im basalen als auch im aktivitätsinduzierten Zustand.
Angesichts der wichtigen Rolle von Aktin in der neuronalen Physiologie ist es nicht verwunderlich, dass mehrere Studien Hinweise auf Veränderungen der Aktindynamik als kritische pathogene Ereignisse im Zusammenhang mit einer Vielzahl von neurologischen Störungen wie Neurodegeneration, psychischen Erkrankungen sowie neurologischen Entwicklungsbeschwerden erbracht haben3,21,22,23,24,25,26,27. Trotz der Fülle von Forschungsdaten, die auf eine Schlüsselrolle von Aktin in der neuronalen Physiologie und Pathophysiologie hinweisen, bestehen jedoch noch erhebliche Lücken im Verständnis der Aktindynamik, insbesondere am synaptischen Zytoskelett. Weitere Forschungsstudien sind erforderlich, um ein besseres Verständnis von neuronalem Aktin und seinen Veränderungen unter pathologischen Bedingungen zu haben. Ein Schwerpunkt in diesem Zusammenhang ist die Beurteilung des Aktinpolymerisationsstatus. Es gibt kommerzielle Kits auf Basis von Western Blotting (G-Actin / F-Actin in vivo Assay biochemisches Kit; Cytoskeleton SKU BK03728,29) und hausgemachte Assays zur Beurteilung der F-Aktin-Spiegel6. Da diese jedoch eine biochemische Isolierung von F-Aktin und G-Aktin erfordern und ihre anschließende Quantifizierung auf Immunblotting-Protokollen basiert, können sie zeitaufwändig sein. Wir berichten hier über einen auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Assay, der aus einer früheren Studie30 mit Modifikationen angepasst wurde, die verwendet werden können, um sowohl den basalen Gehalt an F-Aktin als auch dynamische Veränderungen in seiner Montage-Demontage zu bewerten. Insbesondere haben wir das ursprüngliche Protokoll, das Proben erfordert, die für eine 1-ml-Küvette geeignet sind, effizient auf das aktuelle 96-Well-Plattenformat modifiziert. Das modifizierte Protokoll hat daher die für den Assay erforderliche Gewebe-/Probenmenge deutlich reduziert. Darüber hinaus liefern wir den Nachweis, dass das Protokoll nicht nur für Hirngewebehomogenate, sondern auch für subzelluläre Fraktionen wie isolierte synaptische Terminals (Synaptosomen und Synaptoneurosomen) geeignet ist. Schließlich kann der Assay für frisch seziertes Nagetier-Hirngewebe und langfristig gelagerte postmortale menschliche Gehirnproben eingesetzt werden. Bemerkenswert ist, dass der Assay zwar in einem neuronalen Kontext präsentiert wird, aber in geeigneter Weise auf andere Zelltypen und damit verbundene physiologische Prozesse ausgedehnt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier beschriebene Assay, der im Wesentlichen aus einer früheren Studie30 mit Modifikationen adaptiert wurde, verwendet ein Phallotoxin, Phalloidin, das mit einem fluoreszierenden Etikett gekennzeichnet ist. Fluoreszierende Phalloidin-Analoga gelten als Goldstandard für die Färbung von Aktinfilamenten in festen Geweben47,48,49. Tatsächlich sind sie die ältesten Werkzeuge zur spezifischen Identifiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), dem New Zealand Health Research Council (#16-597) und dem Department of Anatomy der University of Otago, Neuseeland, unterstützt. Wir sind der Neurologischen Gewebebank der HCB-IDIBAPS BioBank (Spanien) für menschliches Hirngewebe zu Dank verpflichtet. Wir danken Jiaxian Zhang für ihre Hilfe bei der Aufnahme und Bearbeitung des Videos.
Materials
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
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