Santral sinir sistemi metastazı PDX modelleri, insan metastazının fenotipik ve moleküler özelliklerini temsil eder ve bu da onları klinik öncesi çalışmalar için mükemmel modeller haline getirir. Burada PDX modellerinin nasıl oluşturulacağı ve klinik öncesi çalışmalar için en iyi kullanılan aşılama yolları açıklanmaktadır.
Merkezi sinir sistemi (MSS) metastazı için yeni tedavilerin geliştirilmesi, hastalığı doğru bir şekilde temsil eden preklinik modellerin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. CNS metastazının hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinin, insan hastalığının fenotipik ve moleküler özelliklerini daha iyi temsil ettiği ve aynı zamanda insan hasta tümörlerinin heterojenliğini ve klonal dinamiklerini tarihsel hücre hattı modellerine kıyasla daha iyi yansıttığı gösterilmiştir. Preklinik çalışmalar kurarken hasta kaynaklı dokuyu implante etmek için kullanılabilecek, her biri kendi avantaj ve dezavantajlarına sahip olan ve her biri metastatik kaskadın farklı yönlerini incelemek için uygun olan birden fazla bölge vardır. Burada protokol, PDX modellerinin nasıl oluşturulacağını ve CNS metastazı PDX modellerinin klinik öncesi çalışmalarda kullanılması için üç farklı yaklaşımın nasıl sunulacağını, uygulamalarının ve sınırlamalarının her birinin tartışılmasını açıklamaktadır. Bunlar arasında yan implantasyon, beyinde ortotopik enjeksiyon ve intrakardiyak enjeksiyon bulunur. Subkutan yan implantasyon, izlenmesi en kolay olanıdır ve bu nedenle klinik öncesi çalışmalar için en uygun olanıdır. Ek olarak, yan implantasyondan beyne ve diğer dokulara metastazlar gözlendi, bu da tümörün intravazasyon, ekstravazasyon ve kolonizasyon dahil olmak üzere birçok metastaz adımından geçtiğini gösterdi. Beyindeki ortotopik enjeksiyon, beyin tümörü mikroçevresini özetlemek için en iyi seçenektir ve biyolojiklerin kan-beyin bariyerini (BBB) geçme etkinliğini belirlemek için yararlıdır, ancak metastatik kaskadın çoğu adımını atlar. İntrakardiyak enjeksiyon beyne metastazı kolaylaştırır ve ayrıca organ tropizmini incelemek için de yararlıdır. Bu yöntem metastatik kaskadın daha önceki adımlarından vazgeçerken, bu hücreler hala dolaşımda hayatta kalmak, ekstravazasyon yapmak ve kolonize olmak zorunda kalacaklar. Bu nedenle, bir PDX modelinin faydası, tümör aşılama yolundan etkilenir ve hangisinin kullanılacağının seçimi, bilimsel soru ve deneyin genel hedefleri tarafından belirlenmelidir.
Santral sinir sistemine (SSS) metastaz insidansı son yıllarda artmıştır 1,2,3. Tümör rezeksiyonu, tüm beyin radyoterapisi ve stereotaktik radyocerrahi gibi CNS metastazı için geleneksel tedaviler büyük ölçüde palyatif ve nadiren iyileştirici olmuştur ve bilişsel bozulma gibi zayıflatıcı yan etkilere yol açabilir1. Son zamanlarda, CNS metastazlarının tedavisi için, daha az yan etkiye sahipken, daha etkili tedaviler olma konusunda umut vaat eden birçok yeni hedefe yönelik ve immünolojik tedavi geliştirilmektedir4.
Preklinik sonuçları anlamlı klinik sonlanım noktalarına çevirmek genellikle etkili ve tahmine dayalı modelleme stratejileri gerektirir. Tarihsel olarak, hücre hattı ksenograft modelleri, CNS metastazı araştırmalarında klinik öncesi araştırmalar için standarttı. Bununla birlikte, bu hücre hattı modelleri, konakçı tümörün gerçek tümör davranışını yansıtmaz veya hastalığın histolojik veya moleküler heterojenitesini temsil etmez. Ayrıca, hücre hattı modelleri in vitro büyüme koşullarına uyum sağlayabilir ve bu nedenle konakçı tümörün orijinal özelliklerini kaybedebilir. Bir hastanın tümörünü immün yetmezlikli veya insanlaştırılmış bir fareye aşılayan hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX’ler), translasyonel kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Araştırmacılar, PDX modellerinin genellikle tümör büyümesini, histolojik özellikleri, tümör heterojenitesini, metastatik potansiyelini ve moleküler genetik özelliklerini koruyabildiğini göstermiştir. Ek olarak, PDX modelleri prognostiktir, bu sayede PDX tümör gecikme süresi hastanın genel sağkalımı ile ilişkilidir ve ayrıca hasta çalışmalarında terapötik yanıtı doğru bir şekilde öngördükleri gösterilmiştir 5,6.
Çoğunlukla, bunlar küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC)7, meme kanseri8,9 ve melanom 10,11 gibi tek bir kökenden kaynaklanan tümörleri temsil eden tümörleri temsil eden geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, sekiz farklı histolojik alt tipi temsil eden geniş ve çeşitli PDX modelleri koleksiyonu geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir12. SSS metastazı için PDX modellerinin hem histolojik hem de moleküler olarak orijinal hasta tümörlerine çok benzediği ve ayrıca histolojik benzersiz farklılıklar ve benzerlikler gösterdiği gösterilmiştir10,12. Ayrıca, çoğu CNS metastazı PDX modeli, insan tümörlerinin klonal heterojenitesini korurken, bazıları klonal ardışık12 kanıtı göstermiş ve bu da onları tedaviden sonra klonal değişiklikleri izleyerek tedavilere direnci incelemek için ideal hale getirmiştir.
Burada açıklanan protokoller, PDX oluşturma yöntemlerini ve CNS metastazının klinik öncesi çalışmalarında kullanılan çeşitli aşılama yollarını özetlemektedir (Şekil 1). Bu implantasyon yöntemleri, büyüme ve metastazı taklit etme yeteneklerine göre değişir. Burada, protokol her implantasyon yolu için uygulamaları vurgulamakta ve CNS metastazının incelenmesi için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Bu yazıda PDX’in kurulması ve yaygınlaştırılması için yöntemler ayrıntılı olarak ele alınmıştır. CNS metastazını değerlendirirken preklinik çalışmaların kurulmasında kullanılabilecek üç farklı aşılama yöntemi de gösterilmiştir. Seçim yöntemi, deneyin hedeflerine bağlı olmalıdır. Bazı durumlarda birden fazla aşılama yolu kullanılması faydalı olacaktır. Örneğin, deri altı yan implantasyonu, bir ilacın tümör büyümesi üzerindeki etkinliğini incelemek ve ilacı hedefinde değerlendirmek için basit bir yaklaşım sağlar ve ayrıca kolayca izlenen ve ölçülen tümör boyutu için bir görsel sağlar. Bununla birlikte, hedef fizibilite ve anti-tümör büyüme özellikleri belirlendikten sonra, biyolojinin BBB’yi geçme etkinliğini değerlendirmek ve beyin tümörü mikroçevresi içindeki etkisini incelemek için ortotopik bir çalışma başlatılabilir. Ayrıca, sağkalım ortotopik ve intrakardiyak enjeksiyon çalışmalarında daha iyi değerlendirilmektedir.
Beyin metastazı PDX modellerinin intrakraniyal enjeksiyonu, beyin mikroçevresinin ve BBB’nin varlığı nedeniyle sıklıkla tercih edilen preklinik modeldir. Bununla birlikte, çalışmalar beyin metastazlarının, moleküllerin tümöre geçirgenliğini etkileyen BBB’yi modifiye etme yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir16. BBB’deki bu değişiklikler intrakraniyal implante tümörler tarafından yansıtılmayacaktır ve bu nedenle preklinik ilaç çalışmaları hasta tümörlerinin yanıtını tam olarak yansıtmayabilir. Bu uyarıyla bile, intrakraniyal enjeksiyon, preklinik modellerde BBB’yi geçmek için ilaçların geçirgenliğini ve etkinliğini test etmek için en iyi yöntem olmaya devam etmektedir. İntrakraniyal modellerle ilgili bir diğer zorluk, tümör büyümesini izlemek için zor olmaları ve görüntüleme tekniklerinin kullanılmasını gerektirmeleridir. PDX’lerin floresan veya biyolüminesan belirteçlerle viral transdüksiyonu geleneksel olarak kullanılmıştır, ancak gerçekleştirilmesi zor olabilir. Bununla birlikte, belirteçlerin kullanılmasını gerektirmeyen farelerde kullanılmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmektedir, bu da klinik öncesi çalışmalar için bu ortotopik beyin tümörlerinin izlenmesinin kolaylığını artırabilir. Bunlar arasında manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme ve mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) gibi görüntüleme teknolojileri bulunmaktadır. Son olarak, kafa içi enjeksiyon, leptomeningeal metastazda olduğu gibi, beynin dışındaki CNS metastazlarının mikro ortamını doğru bir şekilde yansıtmayabilir. Bu durumda, leptomeningeal metastazları daha doğru bir şekilde temsil etmek için cisterna magna’ya enjeksiyon yapılabilir17.
PDX modelinin hem fenotipik hem de moleküler özelliklerinin karakterizasyonu, klinik öncesi çalışmalar için en iyi modellerin seçilmesinde önemlidir. Tümör gecikmesi 7-140 gün arasında değişebilir ve alım oranları da oldukça değişkenolabilir 12. İmplant edilecek en uygun hayvan sayısı ve tedaviye başlama zamanlaması, her PDX modelinin özelliklerine dayanmalı ve ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, PDX tümörlerinin moleküler profili, preklinik çalışmalar için en temsili PDX modellerinin seçimi için de önemlidir. Model moleküler olarak donör dokuyu ne kadar yakın temsil ederse, klinik yanıtın o kadar öngörücü olması muhtemeldir. Ayrıca, insan verilerinden seçilen hedeflerin, çalışmalar için seçilen PDX’lerde mevcut olmasını ve klonal ardıllığın, görevdeki baskın klonun farklı bir genomik profili ile ilişkili olduğu gösterildiği gibi, birkaç nesil boyunca sürdürülmesini sağlamak çok önemlidir. Bunun ışığında, CNS metastazı PDX tümörlerinin fenotipik ve moleküler profilleri, çoklu nesiller boyunca kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir12.
CNS metastazı PDX modellerini kullanmanın birçok avantajına rağmen, kullanımlarıyla ilgili çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, alternatif bir tümör mikroçevresi ve özellikle bir bağışıklık sisteminin eksikliği, PDX modellerinin iyi belgelenmiş sınırlamalarıdır18. Bir insan tümörünün farelere ksenogrefti, insan stromasının sonraki her pasajda fare stroması ile değiştirilmesine neden olur ve insan stroması genellikle birkaç pasajdan sonra tamamen değiştirilir19. Bununla birlikte, tümör mikroortamındaki farklılıklar, orijinal hasta tümörü12’ye kıyasla kanat implante PDX tümörlerinin moleküler profilinde büyük farklılıklara neden olmamakta, bu da yan modellerin CNS metastazını incelemek için hala iyi deneysel modelleri temsil ettiğini göstermektedir. İkincisi, bağışıklık sistemi baskılanmış hayvanların kullanımı, tümörde bağışıklık hücresi infiltrasyonu eksikliği ve konakçı tarafından genel bir bağışıklık tepkisi ile sonuçlanır ve konakçının kanser büyümesiyle mücadele etmeye çalıştığı temel bir yolu sınırlar12. İnsan bağışıklık hücreleri ile aşılanmış insanlaştırılmış fareler, spesifik bağışıklık hücrelerinin tümörle etkileşimlerini incelemek için mevcut olsa da, bu sonuçların yaklaşımları, yöntemleri ve yorumlanması hakkında hala birçok soru ve tartışma vardır20.
PDX’lerin çoğunluğunun genetik olarak stabil olduğu gösterilmiş olsa da, biz ve diğerleri, nadir durumlarda, tedavilerin veya diğer dış seçici basınçların yokluğunda bile, tümörlerin klonlarında, minör klon devralma12,14,15 gibi değişiklikler olabileceğini göstermiştir. Bu, moleküler profilde dramatik değişikliklere neden olabilir, bu da sonuçta tümörün hasta tümöründeki baskın klonları yansıtmamasına neden olur12. Klonal ardıllık gösteren PDX’ler klinik öncesi çalışmalarda kullanılabilirken, hedeflemeye yönelik birçok gen (örneğin, Her2) klonal ardıllık ile kaybolabilir. Bu nedenle, istenen klonun moleküler profilini hala koruyup korumadıklarını belirlemek için PDX modellerinin sık sık taranması teşvik edilir.
Özetle, PDX modelleri sadece CNS metastazlarının değil, diğer tümör tiplerinin de incelenmesi için mükemmel bir model sistemini temsil etmektedir. Bu modellerin geliştirilmesi, insan CNS metastazının fenotipik, moleküler profilini ve heterojenliğini büyük ölçüde yansıttığını göstermiştir 8,9,10,12. Hem CNS metastaz biyolojisini incelemek için etkili modeller olarak hizmet ederler hem de tarihsel olarak CNS metastazının in vivo çalışmaları için kullanılan aşırı kullanılmış hücre hattı modellerinin yerini alan fizyolojik olarak ilgili klinik öncesi modellerin yanı sıra hizmet ederler. Kuşkusuz PDX ile donör hasta tümörü arasındaki farklar12,18’dir. Bu farklılıkların ne olduğunu bilmek, klinik öncesi çalışmaların doğru planlanması ve yürütülmesi için önemlidir. Son olarak, birkaç aşılama yolu arasından seçim yaparak, PDX modelleri, hastalığın birçok yönünün incelenmesine izin veren kullanımlarında çok yönlüdür. PDX’lerin modelleri şüphesiz CNS metastazı anlayışımızı ilerletmede ve yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir rol oynayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Şekil 3A, önceki yayınımız12’den alınmıştır ve Dr. Jann Sarkaria’nın Mayo Clinic’teki laboratuvarında oluşturulmuştur.
25G needle | VWR | BD305122 | |
70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
Surgical glue | MedVet | VG3 | |
Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
Syringe | VWR | 53548-001 | |
Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |