Estabelecimento e Utilização de Modelos de Xenoenxerto de Metástases do Sistema Nervoso Central Derivados de Pacientes
Summary
Os modelos PDX de metástases do sistema nervoso central representam as características fenotípicas e moleculares das metástases humanas, tornando-os excelentes modelos para estudos pré-clínicos. Descrevemos aqui como estabelecer modelos de PDX e as rotas de inoculação que são mais bem utilizadas para estudos pré-clínicos.
Abstract
O desenvolvimento de novas terapias para metástases no sistema nervoso central (SNC) tem sido dificultado pela falta de modelos pré-clínicos que representem com precisão a doença. Demonstrou-se que modelos de xenoenxerto derivado de pacientes (PDX) de metástase no SNC representam melhor as características fenotípicas e moleculares da doença humana, bem como refletem melhor a heterogeneidade e a dinâmica clonal de tumores de pacientes humanos em comparação com modelos históricos de linhagem celular. Existem vários locais que podem ser usados para implantar tecido derivado do paciente ao estabelecer ensaios pré-clínicos, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens, e cada um adequado para estudar diferentes aspectos da cascata metastática. Aqui, o protocolo descreve como estabelecer modelos PDX e apresenta três abordagens diferentes para a utilização de modelos PDX de metástase do SNC em estudos pré-clínicos, discutindo cada uma de suas aplicações e limitações. Estes incluem implante de flanco, injeção ortotópica no cérebro e injeção intracardíaca. O implante do flanco subcutâneo é o mais fácil de monitorar e, portanto, mais conveniente para estudos pré-clínicos. Além disso, metástases para o cérebro e outros tecidos a partir do implante do flanco foram observadas, indicando que o tumor sofreu múltiplas etapas de metástase, incluindo intravasamento, extravasamento e colonização. A injeção ortotópica no cérebro é a melhor opção para recapitular o microambiente do tumor cerebral e é útil para determinar a eficácia dos biológicos para atravessar a barreira hematoencefálica (BHE), mas ignora a maioria das etapas da cascata metastática. A injeção intracardíaca facilita a metástase para o cérebro e também é útil para estudar o tropismo de órgãos. Embora esse método renuncie a etapas anteriores da cascata metastática, essas células ainda terão que sobreviver à circulação, extravasar e colonizar. A utilidade de um modelo PDX é, portanto, impactada pela via de inoculação tumoral e a escolha de qual utilizar deve ser ditada pela questão científica e pelos objetivos gerais do experimento.
Introduction
A incidência de metástases para o sistema nervoso central (SNC) tem aumentado nos últimos anos 1,2,3. As terapias tradicionais para metástases do SNC, como ressecção tumoral, radioterapia cerebral total e radiocirurgia estereotáxica, têm sido em grande parte paliativas e raramente curativas, podendo levar a efeitos colaterais debilitantes, como deterioraçãocognitiva1. Recentemente, muitas novas terapias direcionadas e imunológicas estão sendo desenvolvidas para o tratamento de metástases do SNC que se mostram promissoras por serem tratamentos mais eficazes, porém com menos efeitoscolaterais4.
A tradução de resultados pré-clínicos em desfechos clínicos significativos geralmente requer estratégias de modelagem eficazes e preditivas. Historicamente, os modelos de xenoenxerto de linhagem celular foram o padrão para pesquisa pré-clínica na pesquisa de metástases do SNC. Entretanto, esses modelos de linhagens celulares não refletem o verdadeiro comportamento tumoral do tumor hospedeiro ou representam a heterogeneidade histológica ou molecular da doença. Além disso, modelos de linhagens celulares são capazes de se adaptar às condições de crescimento in vitro e, portanto, perder as propriedades originais do tumor hospedeiro. Os xenoenxertos derivados do paciente (PDXs), que enxertam o tumor de um paciente em um camundongo imunodeficiente ou humanizado, são cada vez mais usados na pesquisa translacional do câncer. Os pesquisadores mostraram que os modelos PDX geralmente podem recapitular fielmente o crescimento tumoral, as características histológicas, manter a heterogeneidade tumoral, o potencial metastático e as características genéticas moleculares. Além disso, os modelos PDX são prognósticos em que o período de latência tumoral do PDX se correlaciona com a sobrevida global do paciente e também demonstraram predizer com precisão a resposta terapêutica em estudos compacientes5,6.
Houve o surgimento de PDXs metastáticos do SNC. Em sua maioria, estes foram desenvolvidos representando tumores originados de uma única origem, como o câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC)7, câncer demama8,9 emelanoma10,11. Mais recentemente, uma grande e diversificada coleção de modelos PDX foi desenvolvida e caracterizada, representando oito diferentes subtiposhistológicos12. Demonstrou-se que os modelos PDX para metástases no SNC se assemelham muito ao tumor original do paciente, tanto histológica quanto molecularmente, e também demonstraram diferenças e semelhanças histológicasúnicas10,12. Além disso, enquanto a maioria dos modelos PDX de metástases no SNC mantém a heterogeneidade clonal dos tumores humanos, alguns apresentaram evidências de sucessãoclonal12, tornando-os também ideais para estudar a resistência a terapias por meio do monitoramento das alterações clonais após o tratamento.
Os protocolos aqui descritos descrevem métodos de estabelecimento de PDX e várias vias de inoculação utilizadas em estudos pré-clínicos de metástases no SNC (Figura 1). Esses métodos de implantação variam em sua capacidade de mimetizar crescimento e metástase. Aqui, o protocolo destaca as aplicações para cada via de implantação e demonstra como elas poderiam ser usadas para o estudo de metástases no SNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente manuscrito, métodos para o estabelecimento e propagação de PDX foram detalhados. Três diferentes métodos de inoculação que podem ser usados para estabelecer estudos pré-clínicos na avaliação de metástases no SNC também foram demonstrados. O método de escolha deve depender dos objetivos do experimento. Em alguns casos, seria benéfico usar mais de uma via de inoculação. Por exemplo, o implante de flanco subcutâneo fornece uma abordagem simples para estudar a eficácia de uma droga no crescimento do tumor e avaliar a droga em seu alvo, além de fornecer uma visão do tamanho do tumor que é facilmente monitorada e medida. No entanto, uma vez estabelecida a viabilidade do alvo e as propriedades antitumorais de crescimento, pode-se estabelecer um estudo ortotópico para avaliar a eficácia do biológico em atravessar a BHE e estudar seu efeito dentro do microambiente do tumor cerebral. Além disso, a sobrevida é melhor avaliada em estudos de injeção ortotópica e intracardíaca.
A injeção intracraniana de modelos PDX de metástases cerebrais é frequentemente o modelo pré-clínico de escolha devido à presença do microambiente cerebral e BBB. No entanto, estudos têm demonstrado que as metástases cerebrais têm a capacidade de modificar a BHE, o que afeta a permeabilidade das moléculas ao tumor16. Essas alterações na BHE não seriam refletidas por tumores implantados intracranialmente e, devido a isso, os estudos pré-clínicos com drogas podem não refletir totalmente a resposta dos tumores dos pacientes. Mesmo com essa ressalva, a injeção intracraniana continua sendo o melhor método para testar a permeabilidade e a eficácia de drogas para atravessar a BHE em modelos pré-clínicos. Outro desafio dos modelos intracranianos é que eles são difíceis de monitorar o crescimento tumoral e requerem o uso de técnicas de imagem. A transdução viral de PDXs com marcadores fluorescentes ou bioluminescentes tem sido tradicionalmente usada, mas pode ser desafiadora de ser realizada. No entanto, várias técnicas de imagem estão sendo desenvolvidas para uso em camundongos que não requerem a introdução de marcadores, o que poderia melhorar a facilidade de monitoramento desses tumores cerebrais ortotópicos para estudos pré-clínicos. Estas incluem tecnologias de imagem como ressonância magnética (RM) e tomografia por emissão de pósitrons (PET) e microtomografia computadorizada (micro-TC). Finalmente, a injeção intracraniana pode não refletir com precisão o microambiente de metástases do SNC fora do cérebro, como nas metástases leptomeníngeas. Nesse caso, a injeção na cisterna magna poderia ser realizada para representar com maior precisão as metástases leptomeníngeas17.
A caracterização das características fenotípicas e moleculares do modelo PDX é importante para a seleção dos melhores modelos para estudos pré-clínicos. A latência tumoral pode variar de 7 a 140 dias e as taxas de demora também podem ser muitovariáveis12. O número ideal de animais a serem implantados e o momento para iniciar o tratamento teriam que ser baseados nas características de cada modelo de PDX e precisam ser determinados empiricamente. Além disso, o perfil molecular dos tumores PDX também é importante para a seleção dos modelos PDX mais representativos para estudos pré-clínicos. Quanto mais próximo o modelo representar molecularmente o tecido doador, mais preditivo de resposta clínica ele provavelmente será. Além disso, é fundamental garantir que os alvos selecionados a partir de dados humanos estejam presentes nos PDXs que estão sendo escolhidos para estudos e sejam sustentados ao longo de algumas gerações, como mostrado que a sucessão clonal está associada a um perfil genômico diferente do clone dominante incumbente. Em vista disso, os perfis fenotípicos e moleculares dos tumores PDX metastáticos do SNC têm sido extensivamente caracterizados ao longo de múltiplasgerações12.
Apesar das inúmeras vantagens do uso de modelos PDX de metástase no SNC, existem várias limitações relacionadas ao seu uso. Primeiro, um microambiente tumoral alternativo e, especialmente, a falta de um sistema imunológico são limitações bem documentadas dos modelos PDX18. O xenoenxerto de um tumor humano em camundongos resulta na substituição do estroma humano pelo estroma de camundongo a cada passagem subsequente e o estroma humano geralmente é completamente substituído após váriaspassagens19. No entanto, as diferenças no microambiente tumoral não resultam em grandes diferenças no perfil molecular dos tumores PDX implantados no flanco em comparação com o tumor original dopaciente12, sugerindo que os modelos de flanco ainda representam bons modelos experimentais para estudar metástases no SNC. Em segundo lugar, o uso de animais imunocomprometidos resulta em falta de infiltração de células imunes no tumor e em uma resposta imune geral do hospedeiro, limitando uma maneira fundamental pela qual o hospedeiro tenta combater o crescimento docâncer12. Embora camundongos humanizados enxertados com células imunes humanas estejam disponíveis para estudar as interações de células imunes específicas com o tumor, ainda existem muitas dúvidas e controvérsias sobre as abordagens, métodos e interpretação dessesresultados20.
Embora a maioria das PDXs tenha se mostrado geneticamente estável, nós e outros mostramos que, em casos raros, mesmo na ausência de tratamentos ou outras pressões seletivas externas, pode haver alterações nos clones dos tumores, como a aquisição de clones menores12,14,15. Isso poderia resultar em mudanças dramáticas no perfil molecular, o que acabaria por tornar o tumor não refletindo os clones dominantes no tumor dopaciente12. Embora PDXs exibindo sucessão clonal possam ter uso em estudos pré-clínicos, muitos genes destinados ao alvo (por exemplo, Her2) podem ser perdidos com a sucessão clonal. Portanto, a triagem frequente de modelos PDX para determinar se eles ainda mantêm o perfil molecular do clone desejado é encorajada.
Em resumo, os modelos PDX representam um excelente sistema modelo para o estudo não só de metástases no SNC, mas também de outros tipos tumorais. O desenvolvimento desses modelos mostrou que eles refletem em grande parte o perfil fenotípico, molecular e a heterogeneidade das metástases do SNC humano8,9,10,12. Eles servem como modelos eficazes para estudar a biologia de metástases do SNC e também servem bem como modelos pré-clínicos fisiologicamente relevantes, substituindo modelos de linhagem celular usados em excesso historicamente usados para estudos in vivo de metástases no SNC. Sem dúvida, existem diferenças entre o PDX e o tumor do pacientedoador12,18. Saber quais são essas diferenças é importante para o planejamento e execução adequados de estudos pré-clínicos. Por fim, ao escolher entre várias vias de inoculação, os modelos PDX são versáteis em seu uso, permitindo o estudo de múltiplos aspectos da doença. Os modelos PDXs sem dúvida desempenharão um papel importante no avanço de nossa compreensão da metástase do SNC e no desenvolvimento de novas terapias.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Figura 3A foi retirada de nossa publicação anterior12 e foi gerada no laboratório do Dr. Jann Sarkaria na Mayo Clinic.
Materials
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
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