中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用

以下は、皮下側面移植によるPDXモデルの確立と、生物学的変化と転移カスケードのさまざまなステップの評価に役立つ治療のテストを可能にする前臨床試験の設定の両方に使用される一連の段階的なプロトコルです。すべての研究およびモデルは、3〜8週齢の雌NOGマウスを使用した。すべての組織サンプルは、治験審査委員会(IRB)によって承認されたプロトコルに従って、インフォームドコンセントの下で収集されました。すべての動物実験は、施設動物管理使用委員会(IACUC)が承認したプロトコルに従って実施されました。 1. 側面移植によるPDXモデルの構築と伝播 PDXモデルの確立手術室で患者から腫瘍を外科的切除した後、新鮮な腫瘍組織を適切な溶液(DMEMなど)に保管し、すぐに氷上に置きます。過剰の保存溶液(>10 mL)を使用して、組織が完全に水没していることを確認します。. 組織を組織培養皿に移し、5 mL DPBSですすいでください。注:このステップは、無菌技術を使用してバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。可能性のあるヒト感染性病原体から保護するために、適切な個人用保護具(PPE)を着用して予防措置を講じる必要があります。 腫瘍から壊死領域を取り除きます。注:これは、組織の中心に向かって白いどろどろした領域として認識できます。 残りの組織を約2 x 2 x 2 mmの小片に切ります。 組織を成長因子還元基底膜マトリックスを含むマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保存します。各組織片を完全に沈めるために、十分な基底膜マトリックス(>200 μL)が使用されていることを確認してください。 ステップ1.3に記載されているプロトコルに従って移植されない残りの組織を凍結保存します。 2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。 マウスの移植部位を特定します。注:これはマウスの右側または左脇腹にあり、通常は腹部の側面に横方向にマークされ、胸郭の尾側にある必要があります。 手術領域を準備するには、毛皮を剃り、ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで消毒します。 鉗子を使用して、マウスの皮膚を持ち上げ、皮膚を0.5〜1 cm切開します。 切開部位の皮膚下に手術用ハサミをゆっくりと挿入し、皮下空間にポケット(深さ0.5〜1cm)を作ります。 腫瘍片を慎重にポケットに入れ、腫瘍が滑り落ちないようにポケットの底に押し込みます。 4-0ナイロン外科用縫合糸を使用して切開を閉じます。注:非吸収性または吸収性の縫合糸や創傷クリップなどの他の創傷閉鎖方法も使用できます。 マウスをケージに戻し、歩行可能になるまで動物の麻酔からの回復を監視します。注:鎮痛薬は必要ありませんが、マウスに痛みが観察された場合は投与できます。 毎週腫瘍の成長を監視します。マウス1匹につき1つの腫瘍が予想されます。注:移植時の腫瘍の体積は最初は減少しているように見えますが、これは心配する必要はありません。腫瘍は、触知可能になり、対数成長期に入ると、腫瘍が採取されたと見なされます。この最初のパッセージは、F0 世代を表します。 腫瘍が成長し始めたら、週に3回腫瘍を測定します。ノギスで腫瘍の長さと幅を測定します。腫瘍の体積を計算するには、長さx幅x幅/ 2の式を使用します。 腫瘍の直径が15 mmを超える場合は、腫瘍の最長辺を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。CO2誘導室でCO2吸入による安楽死を行い、続いて二次的な方法として頸部脱臼を行う。 切開することによって動物の脇腹から腫瘍を切除する。切除した腫瘍を鈍いハサミと鉗子でやさしく解剖します。これを行うには、まず腫瘍の上の皮膚を切り取り、次に腫瘍をその下の筋肉層から切り取ります。 腫瘍組織を>10 mLの適切な保存溶液(DMEMなど)に移します。すぐに氷の上に置きます。この腫瘍は、凍結保存するか、別のマウスセットに継代することができます。この箇所をF1と考えてください。注:再度継代すると、腫瘍の通過がF2などになります。 PDXモデルの伝播切除した腫瘍をステップ1.1.19の保存溶液に保持することから始めます。 組織を組織培養皿に移し、5 mL DPBSですすいでください。 腫瘍から壊死領域を取り除きます。 ティッシュを約2 x 2 x 2 mmの小片に切ります。 組織を成長因子低減基底膜マトリックス(>200 μL)を含むマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保管します。 増殖に使用されない残りの組織を、ステップ1.3に記載のプロトコルに従って凍結保存します。 2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。 マウスの移植部位を特定します。注:これは、マウスの右側または左脇腹、通常は腹部、胸郭の尾側にある必要があります。 手術領域を準備するには、毛皮を剃り、ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで消毒します。 マウスの片側を0.5〜1 cm切開します。 切開部の皮膚の下に手術用ハサミをゆっくりと挿入し、皮下空間にポケット(深さ0.5〜1 cm)を作成します。 腫瘍片を慎重にポケットに入れ、ポケットの底に押し込んで、腫瘍が滑り落ちないようにします。 4-0ナイロン外科用縫合糸または他の創傷閉鎖方法を使用して切開を閉じます。 マウスをケージに戻し、歩行可能になるまで麻酔からの回復を監視します。注:鎮痛薬は必要ありませんが、マウスに痛みが観察された場合は投与できます。 潜伏期(非増殖期)の間、腫瘍の成長を毎週監視する。マウス1匹につき1つの腫瘍が予想されます。注:移植時の腫瘍の体積は最初は減少しているように見えますが、これは心配する必要はありません。腫瘍は、触知可能になり、継続的に成長し始めると、腫瘍が採取されたと見なされます。 腫瘍が成長し始めたら、週に3回腫瘍を測定します。ノギスで腫瘍の長さと幅を測定します。式を使用して腫瘍の体積を計算します:長さx幅x幅/ 2。 腫瘍の直径が15 mmを超える場合は、腫瘍の最長辺を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。CO2誘導室でCO2吸入による安楽死を行い、続いて二次的な方法として頸部脱臼を行います。 動物の脇腹から腫瘍を切除し、切開を行い、鈍いハサミと鉗子で腫瘍を穏やかに解剖します。 腫瘍組織を>10 mLの適切な保存溶液(DMEMなど)に移し、すぐに氷上に置きます。 PDX腫瘍の凍結保存腫瘍の直径が15 mmを超える場合は、腫瘍の最長辺を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。CO2誘導室でCO2吸入による安楽死を行い、続いて二次的な方法として頸部脱臼を行う。 動物の脇腹から腫瘍を切除し、切開を行い、鈍いハサミと鉗子で腫瘍を穏やかに解剖します。 腫瘍組織を>10 mLの適切な保存溶液(DMEMなど)に移し、すぐに氷上に置きます。 組織を組織培養皿に移し、5 mL DPBSですすいでください。 腫瘍から壊死領域を取り除きます。 ティッシュを約2 x 2 x 2 mmの小片に切ります。 組織を20%のDMEM、70%のFBS、および10%のDMSOを含むクライオチューブに移します。 クライオチューブを凍結保存容器に移し、-80°Cの冷凍庫に入れます。 クライオチューブを-80°Cに冷却したら、液体窒素貯蔵庫に移します。 2. 前臨床試験の接種経路 皮下側面移植。注:皮下側面移植は、簡単に使用でき、転移カスケードのすべてのステップを研究するのに役立ちます。最初の側面移植には、成長中のPDX腫瘍または凍結保存されたPDX腫瘍を使用します。 PDX腫瘍を増殖させるには、腫瘍の長さが15 mmを超える場合は、IACUC承認の方法を使用してマウスを安楽死させます。腫瘍を切除し、腫瘍組織を適切な保存溶液(DMEMなど)に移し、直ちに氷上に置きます。 凍結保存されたPDX腫瘍の場合、凍結保存されたPDX組織を37°Cの水浴に浸漬して迅速に解凍する。 手順 1.2.2-1.2.19 に従います。 脳内注射による同所性移植。注:このモデルは、BBBを通過する薬の有効性をテストし、腫瘍のコロニー形成を研究するために使用できます。このセクションでは、主に腫瘍解離キットの使用について言及しています( 材料表).組織の種類が異なれば、必要な解離プロトコルも異なります。解離効率を最大化するために、ユーザーがプロトコルをテストして最適化することをお勧めします。腫瘍の長さが15 mmを超える場合は、IACUC承認の方法を使用してPDX腫瘍を移植したマウスを安楽死させます。 バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で、PDX腫瘍を外科的に切除し、氷上のDMEMに保管します。 製造元のプロトコルで示されているように、酵素ミックスをDMEMに追加することにより、適切なチューブで解離溶液を調製します。 組織培養皿で5 mL DPBSで腫瘍を洗浄します。 腫瘍から壊死領域を取り除きます。 腫瘍を長さ2〜4 mmの小片に切ります。 腫瘍片を酵素ミックスを含むチューブに移します。 チューブを組織解離器に取り付け、組織の種類に適したプログラムを実行します。実行する適切なプログラムと必要な解離時間については、製造元のプロトコルを参照してください。 プログラムが完了したら、70 μmの細胞ストレーナーを通して細胞を濾します。 セルストレーナーを20 mLのDMEMで洗浄します。 解離した細胞を300 x g で7分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞をDPBSに再懸濁します。 細胞を数え、必要な濃度に希釈します。 製造元の指示に従って固定装置用フレームをセットアップし、マウス用の加熱パッドを準備します。70%エタノールですべての領域を消毒します。 2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。 頭皮を露出させるためにマウスの頭の毛皮を剃って手術領域を準備します。 皮下注射で投与される1 mg / kgのブプレノルフィン徐放性(SR)の1回の投与など、適切な鎮痛薬をマウスに提供します。. マウスを脳定位固定装置フレームに移します。マウスがバイトブロックを噛んでいることを確認します。イヤーバーを使用して、マウスの頭をしっかりと固定します。注意: 鉗子で軽く押しても頭が動かない場合は、マウスを適切に固定します。 ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで剃った部分を消毒します。 頭皮を5〜7 mm縦切開して頭蓋骨を露出させ、頭皮を引っ込めます。 鉗子などの鈍い手術器具で骨膜をこすり落とします。 頭蓋骨のブレグマを見つけます。 定位フレームの針をブレグマの上に置き、座標を0にリセットするか、アームの座標をメモします。 腕を正中線の右に1 mm後方(尾側)および1 mm横方向に動かします。 この場所を永久マーカーでマークします。アームにシリンジ用のスロットが含まれている場合は、シリンジスロットにマーカーを取り付けて位置をマークします。 この場所で頭蓋骨に小さなバリ穴を開けます。脳への穴あけを防ぐために、過度の圧力をかけないでください。 5 μL、26 Gのハミルトンシリンジに5-10 x 104 セルを1-2 μLの容量でロードし、脳定位固定装置アームに取り付けます。 ハミルトンシリンジ針を2mm脳にゆっくりと挿入します。 希望の速度(通常0.2〜0.5 μL / min)で細胞の注入を開始します。 注射が完了したら、ゆっくりと針を脳から引っ込めます。 バリ穴を骨ワックスで埋めます。 外科用縫合糸または外科用接着剤で切開部を閉じます。 マウスをケージに戻し、麻酔からの回復を監視します。 動物の状態を定期的に監視し、承認されたプロトコルで人道的エンドポイント基準に達したときに安楽死させます。注:脳内の腫瘍増殖が成功すると、動物の状態が悪化し、頭の傾き、髪のコートが荒れ、体が丸くなり、目を細め、活動が低下し、体の状態スコアが低下することがよくあります(BCS < 2)。 安楽死させた動物の剖検を行い、続いて組織学的分析を行って脳内の腫瘍の存在を確認します。着床から安楽死までの時間を記録します。 心臓内注射によるPDXモデルの移植注:このモデルは、腫瘍細胞が循環した後の臓器向性を研究するために使用できます。このセクションでは、腫瘍解離キットも使用しており、組織タイプによる最適化が必要です。手順 2.2.1-2.2.13 に従います。 2〜5%のイソフルランと酸素を含む誘導チャンバーで動物を麻酔します。麻酔をかけたら、動物をノーズコーンに移し、継続的な酸素供給で麻酔を1.5〜2.5%イソフルランに維持します。ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。手術中の目の乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を塗布します。動物が回復するまで、手順全体を通して動物に熱サポートを提供します。 次に、マウスを仰臥位に置きます。 胸部の手術領域を準備するには、毛皮を剃り、ポビドンヨードと70%エタノールの3つの交互のスクラブで消毒します。 0.5-10 x 105 細胞を28 G針のシリンジに最大100 μLの容量まで引き込みます。注:必要なセルの数はモデルの攻撃性によって異なり、最適なセル数はモデルごとに経験的に決定する必要があります。 注射部位(マウスの胸骨のわずかに左、胸骨ノッチと剣状突起の中間)を見つけます。 注射部位のマウスに針を垂直に挿入します。 注射器に入る血液の逆流を通して左心室への正常な侵入を観察してください。針を動かさずに細胞をゆっくりと左心室に分配します。 針をマウスから垂直にゆっくりと引き出します。 注射部位に滅菌ガーゼを塗り、出血が止まるまで約1分間圧力をかけながら、呼吸のために胸を動かします。 マウスを麻酔から外し、加熱パッドで回復させます。注:腫瘍の成長が成功すると、動物の状態が悪化し、フリルのヘアコート、猫背の体、目を細め、活動の低下、および低い体調スコアで現れることがよくあります(BCS < 2)。 動物の状態を定期的に監視し、承認されたプロトコルで人道的エンドポイント基準に達したときに安楽死させます。 剖検を行って安楽死させた動物の転移を特定し、続いて組織学的分析を行って標的臓器の腫瘍の存在を確認します。心臓内注射から安楽死までにかかる時間を記録します。