L’établissement et l’utilisation de modèles de xénogreffes dérivés de patients de métastases du système nerveux central

Voici une série de protocoles étape par étape utilisés à la fois pour établir des modèles PDX par implantation sous-cutanée du flanc et pour mettre en place des études précliniques qui permettent de tester les traitements, ce qui peut aider à évaluer les changements biologiques et les différentes étapes de la cascade métastatique. Toutes les études et tous les modèles ont utilisé des souris NOG femelles âgées de 3 à 8 semaines. Tous les échantillons de tissus ont été prélevés avec un consentement éclairé conformément à un protocole approuvé par le Comité d’examen des établissements (CISR). Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC). 1. Etablissement et propagation de modèles PDX par implantation de flanc Mise en place de modèles PDXAprès la résection chirurgicale de la tumeur du patient dans la salle d’opération, stockez les tissus tumoraux frais dans une solution appropriée (telle que DMEM) et placez-la immédiatement sur de la glace. Utilisez un excès de solution d’entreposage (>10 ml) pour vous assurer que le tissu est complètement immergé. Transférer le tissu dans une boîte de culture tissulaire et rincer avec 5 ml de DPBS.REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité à l’aide de techniques aseptiques. Des précautions doivent être prises en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié pour se protéger contre d’éventuels agents infectieux humains. Enlever les régions nécrotiques de la tumeur.REMARQUE: Cela peut être reconnu comme une région pâteuse blanche vers le centre du tissu. Couper le reste du tissu en morceaux d’environ 2 x 2 x 2 mm. Transférer les tissus dans un tube microcentrifuge contenant la matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit et les stocker sur de la glace. S’assurer qu’une matrice membranaire basale suffisante (>200 μL) est utilisée pour submerger complètement chaque morceau de tissu. Cryoconserver les tissus restants qui ne seront pas implantés selon le protocole décrit à l’étape 1.3. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse. Identifiez le site d’implantation sur la souris.REMARQUE: Cela devrait être sur le flanc droit ou gauche de la souris, généralement marqué latéralement sur le côté de la région abdominale, caudale à la cage thoracique. Pour préparer la zone chirurgicale, rasez la fourrure et désinfectez avec trois gommages alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70%. À l’aide de forceps, soulevez la peau de la souris et faites une incision de 0,5 à 1 cm sur la peau. Insérez lentement une paire de ciseaux chirurgicaux sous la peau au site de l’incision pour créer une poche (0,5 à 1 cm de profondeur) dans l’espace sous-cutané. Placez soigneusement un morceau de tumeur dans la poche et poussez-le au fond de la poche pour empêcher la tumeur de glisser. Fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales en nylon 4-0.REMARQUE: D’autres méthodes de fermeture de la plaie telles que les sutures et les clips de plaie non résorbables ou résorbables peuvent également être utilisées. Remettez la souris dans la cage et surveillez le rétablissement de l’animal après l’anesthésie, jusqu’à ce qu’il soit ambulatoire.REMARQUE: Les analgésiques ne sont pas nécessaires, mais peuvent être administrés si une douleur est observée chez les souris. Surveillez la croissance tumorale chaque semaine. Une tumeur est attendue par souris.REMARQUE: Le volume de la tumeur à la transplantation semblera diminuer initialement, mais ce n’est pas une source de préoccupation. Une tumeur est considérée comme ayant pris une fois qu’elle devient palpable et entre dans une phase de croissance logarithmique. Ce premier passage représente la génération F0. Une fois que les tumeurs commencent à se développer, mesurez les tumeurs trois fois par semaine. Mesurez la longueur et la largeur des tumeurs avec un pied à coulisse. Pour calculer le volume de la tumeur, utilisez la formule: longueur x largeur x largeur / 2. Euthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX lorsque les tumeurs ont un diamètre supérieur à 15 mm en utilisant le côté le plus long de la tumeur. Effectuer l’euthanasie par inhalation de CO 2 dans une chambre d’induction de CO2, suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire. Réséquer la tumeur du flanc de l’animal en faisant une incision. Disséquez doucement la tumeur excisée avec des ciseaux émoussés et des pinces. Pour ce faire, coupez d’abord la peau au-dessus de la tumeur, puis coupez la tumeur loin de la couche musculaire en dessous. Transférer le tissu tumoral à >10 mL d’une solution de stockage appropriée (telle que le DMEM). Placez-le immédiatement sur la glace. Cette tumeur peut être cryopréservée ou transmise à un autre groupe de souris. Considérez ce passage comme F1.REMARQUE: Passer à nouveau rendrait le passage de la tumeur F2 et ainsi de suite. Propagation des modèles PDXCommencez par la tumeur réséquée conservée dans une solution de stockage à partir de l’étape 1.1.19. Transférer le tissu dans une boîte de culture tissulaire et rincer avec 5 ml de DPBS. Retirez les régions nécrotiques de la tumeur. Couper le tissu en morceaux d’environ 2 x 2 x 2 mm. Transférer les tissus dans un tube microcentrifuge contenant une matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (>200 μL) et conserver sur de la glace. Cryoconserver le tissu restant qui n’est pas utilisé pour la multiplication selon le protocole décrit à l’étape 1.3. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse. Identifiez le site d’implantation sur la souris.REMARQUE: Cela devrait être sur le flanc droit ou gauche de la souris, généralement dans la région abdominale, caudale à la cage thoracique. Pour préparer la zone chirurgicale, rasez la fourrure et désinfectez avec trois gommages alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70%. Faites une incision de 0,5 à 1 cm sur un flanc de la souris. Insérez lentement une paire de ciseaux chirurgicaux sous la peau au niveau de l’incision pour créer une poche (0,5 à 1 cm de profondeur) dans l’espace sous-cutané. Placez soigneusement un morceau de tumeur dans la poche et poussez-le au fond de la poche pour empêcher la tumeur de glisser. Fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales en nylon 4-0 ou d’autres méthodes de fermeture de la plaie. Transférez la souris dans la cage et surveillez sa récupération de l’anesthésie, jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.REMARQUE: Les analgésiques ne sont pas nécessaires, mais peuvent être administrés si une douleur est observée chez les souris. Pendant la latence (phase de non-croissance), surveillez la croissance tumorale chaque semaine. Une tumeur est attendue par souris.REMARQUE: Le volume de la tumeur à la transplantation semblera diminuer initialement, mais ce n’est pas une source de préoccupation. Une tumeur est considérée comme prise une fois qu’elle devient palpable et commence à croître continuellement. Une fois que les tumeurs commencent à se développer, mesurez les tumeurs trois fois par semaine. Mesurez la longueur et la largeur des tumeurs avec un pied à coulisse. Calculez le volume de la tumeur en utilisant la formule: longueur x largeur x largeur / 2. Euthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX lorsque les tumeurs ont un diamètre supérieur à 15 mm en utilisant le côté le plus long de la tumeur. Pratiquer l’euthanasie par inhalation de CO2 dans une chambre d’induction de CO2, suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire. Réséquez la tumeur du flanc de l’animal en faisant une incision et en disséquant doucement la tumeur avec des ciseaux et des pinces émoussés. Transférer le tissu tumoral à >10 mL d’une solution de stockage appropriée (telle que DMEM), puis placer immédiatement sur de la glace. Cryoconservation des tumeurs PDXEuthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX lorsque les tumeurs ont un diamètre supérieur à 15 mm en utilisant le côté le plus long de la tumeur. Pratiquer l’euthanasie par inhalation de CO 2 dans une chambre d’induction de CO2, suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire. Réséquez la tumeur du flanc de l’animal en faisant une incision et en disséquant doucement la tumeur avec des ciseaux et des pinces émoussés. Transférer le tissu tumoral à >10 mL d’une solution de stockage appropriée (telle que DMEM), puis placer immédiatement sur de la glace. Transférer le tissu dans une boîte de culture tissulaire et rincer avec 5 ml de DPBS. Enlever les régions nécrotiques de la tumeur. Couper le tissu en morceaux d’environ 2 x 2 x 2 mm. Transférer le tissu dans des cryotubes contenant 20% de DMEM, 70% de FBS et 10% de DMSO. Transférer les cryotubes dans un récipient de cryoconservation et les placer dans un congélateur à -80 °C. Lorsque les cryotubes sont refroidis à -80 °C, transférez-les dans un stockage d’azote liquide. 2. Voies d’inoculation pour les études précliniques Implantation sous-cutanée du flanc.REMARQUE: L’implantation sous-cutanée du flanc peut être utilisée pour faciliter et peut être utile pour étudier toutes les étapes de la cascade métastatique.Utilisez des tumeurs PDX en croissance ou des tumeurs PDX cryoconservées pour l’implantation initiale du flanc. Pour les tumeurs PDX en croissance, euthanasier les souris en utilisant une méthode approuvée par l’IACUC lorsque les tumeurs ont une longueur supérieure à 15 mm; réséquer la tumeur et transférer le tissu tumoral vers une solution de stockage appropriée (telle que DMEM) et placer immédiatement sur de la glace. Pour les tumeurs PDX cryoconservées, décongeler rapidement le tissu PDX cryoconservé en l’immergeant dans un bain-marie à 37 °C. Suivez les étapes 1.2.2-1.2.19. Implantation orthotopique par injection intracrânienne dans le cerveau.REMARQUE: Ce modèle peut être utilisé pour tester l’efficacité des médicaments à traverser la BHE et pour étudier la colonisation tumorale. Cette section fait principalement référence à l’utilisation du kit de dissociation tumorale (voir Tableau des matériaux). Différents types de tissus nécessitent différents protocoles de dissociation. Il est recommandé que l’utilisateur teste et optimise le protocole pour maximiser l’efficacité de la dissociation.Euthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX en utilisant une méthode approuvée par l’IACUC lorsque les tumeurs ont une longueur supérieure à 15 mm. Dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité, réséquer chirurgicalement les tumeurs PDX et les stocker dans du DMEM sur de la glace. Préparer la solution de dissociation dans le tube approprié en ajoutant le mélange enzymatique dans le DMEM comme indiqué par le protocole du fabricant. Laver la tumeur dans 5 mL DPBS dans un plat de culture tissulaire. Retirez les régions nécrotiques de la tumeur. Coupez la tumeur en petits morceaux de 2 à 4 mm de longueur. Transférer les morceaux tumoraux dans le tube contenant le mélange d’enzymes. Fixez le tube au dissociateur tissulaire et exécutez le programme adapté au type de tissu. Consultez le protocole du fabricant pour connaître le programme approprié à exécuter et le temps de dissociation requis. Une fois le programme terminé, filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire de 70 μm. Lavez la passoire cellulaire avec 20 ml de DMEM. Centrifuger les cellules dissociées à 300 x g pendant 7 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans DPBS. Compter les cellules et diluer à la concentration requise. Installez le cadre stéréotaxique selon les instructions du fabricant et préparez un coussin chauffant pour les souris. Désinfectez toutes les zones avec de l’éthanol à 70%. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse. Préparez la zone chirurgicale en rasant la fourrure sur la tête de la souris pour exposer le cuir chevelu. Fournir à la souris l’analgésique approprié, tel qu’une dose de 1 mg / kg de buprénorphine à libération prolongée (SR) administrée par injection sous-cutanée. Transférez la souris sur le cadre stéréotaxique. Assurez-vous que la souris mord sur le bloc de morsure. Utilisez les barres d’oreille pour fixer fermement la tête de la souris.REMARQUE: La souris est correctement fixée si la tête ne bouge pas lorsqu’elle est poussée doucement avec une pince. Désinfectez la zone rasée avec trois gommages alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70%. Faites une incision longitudinale de 5 à 7 mm sur le cuir chevelu pour exposer le crâne et rétracter le cuir chevelu. Grattez le périoste avec un instrument chirurgical contondant tel qu’une pince. Localisez le bregma sur le crâne. Placez l’aiguille du cadre stéréotaxique sur le dessus du bregma et réinitialisez les coordonnées à 0 ou notez la coordonnée sur le bras. Déplacez le bras de 1 mm vers l’arrière (caudale) et de 1 mm latéralement, à droite de la ligne médiane. Marquez cet emplacement avec un marqueur permanent. Si le bras contient une fente pour la seringue, fixez un marqueur à la fente de la seringue pour marquer l’emplacement. Percez un petit trou de bavure dans le crâne à cet endroit. N’appliquez pas trop de pression pour éviter de percer dans le cerveau. Charger une seringue Hamilton de 5 μL, 26 G avec 5-10 x 104 cellules, dans un volume de 1-2 μL, et fixer au bras stéréotaxique. Insérez lentement l’aiguille de la seringue Hamilton de 2 mm dans le cerveau. Commencez à injecter les cellules à la vitesse désirée, généralement 0,2-0,5 μL / min. Une fois l’injection terminée, retirez lentement l’aiguille du cerveau. Remplissez le trou de bavure avec de la cire d’os. Fermez l’incision avec des sutures chirurgicales ou de la colle chirurgicale. Remettez la souris dans la cage et surveillez sa récupération après l’anesthésie. Surveiller régulièrement l’état des animaux et les euthanasier lorsque les critères d’évaluation sans cruauté sont atteints dans le protocole approuvé.REMARQUE: Une croissance tumorale réussie dans le cerveau entraîne une détérioration de l’état de l’animal, qui se manifeste souvent par une inclinaison de la tête, un pelage rugueux, un corps voûté, des yeux plissés, une activité réduite et un faible score d’état corporel (BCS < 2). Effectuer une nécropsie sur les animaux euthanasiés, suivie d’une analyse histologique pour confirmer la présence de tumeurs dans le cerveau. Notez le temps qu’il faut entre l’implantation et l’euthanasie. Implantation de modèles PDX par injection intracardiaqueREMARQUE: Ce modèle peut être utilisé pour étudier le tropisme des organes une fois que les cellules tumorales sont en circulation. Cette section utilise également le kit de dissociation tumorale et nécessite une optimisation par type de tissu.Suivez les étapes 2.2.1-2.2.13. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse. Ensuite, placez la souris en décubitus dorsal. Pour préparer la zone chirurgicale sur la poitrine, rasez la fourrure et désinfectez-la avec trois gommages alternés de povidone-iode et d’éthanol à 70%. Aspirer 0,5-10 x 105 cellules dans une seringue sur une aiguille de 28 G, jusqu’à un volume de 100 μL.REMARQUE : Le nombre de cellules requises varie en fonction de l’agressivité du modèle et le nombre optimal de cellules doit être déterminé empiriquement pour chaque modèle. Localisez le site d’injection (légèrement à gauche du sternum de la souris et à mi-chemin entre l’encoche sternale et le processus xyphoïde). Insérez l’aiguille verticalement dans la souris au site d’injection. Observez l’entrée réussie dans le ventricule gauche par un reflux de sang entrant dans la seringue. Distribuez lentement les cellules dans le ventricule gauche sans bouger l’aiguille. Retirez lentement l’aiguille verticalement de la souris. Appliquez un morceau de gaze stérile sur le site d’injection et appliquez une pression pendant environ 1 min jusqu’à ce que le saignement cesse, tout en permettant le mouvement de la poitrine pour la respiration. Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussinet chauffant.REMARQUE: Une croissance tumorale réussie entraîne une détérioration de l’état de l’animal, qui se manifeste souvent par un pelage ébouriffé, un corps voûté, des yeux plissés, une activité réduite et un faible score d’état corporel (BCS < 2). Surveiller régulièrement l’état des animaux et les euthanasier lorsque les critères d’évaluation sans cruauté sont atteints dans le protocole approuvé. Effectuer une nécropsie pour identifier les métastases sur les animaux euthanasiés, suivie d’une analyse histologique pour confirmer la présence de tumeurs dans l’organe cible. Notez le temps qu’il faut entre l’injection intracardiaque et l’euthanasie.