إنشاء واستخدام نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي
Summary
نقائل الجهاز العصبي المركزي تمثل نماذج PDX الخصائص الظاهرية والجزيئية للورم الخبيث البشري ، مما يجعلها نماذج ممتازة للدراسات قبل السريرية. الموصوف هنا هو كيفية إنشاء نماذج PDX وطرق التلقيح التي يتم استخدامها بشكل أفضل للدراسات قبل السريرية.
Abstract
تم إعاقة تطوير علاجات جديدة لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي (CNS) بسبب عدم وجود نماذج ما قبل السريرية التي تمثل المرض بدقة. لقد ثبت أن نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX) من ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي تمثل بشكل أفضل الخصائص المظهرية والجزيئية للمرض البشري ، فضلا عن أنها تعكس بشكل أفضل عدم التجانس والديناميكيات النسيلية لأورام المرضى البشرية مقارنة بنماذج خط الخلايا التاريخية. هناك العديد من المواقع التي يمكن استخدامها لزرع الأنسجة المشتقة من المريض عند إعداد التجارب قبل السريرية ، ولكل منها مزاياها وعيوبها ، ولكل منها مناسب لدراسة الجوانب المختلفة للسلسلة النقيلية. هنا ، يصف البروتوكول كيفية إنشاء نماذج PDX وتقديم ثلاثة طرق مختلفة لاستخدام نماذج PDX ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي في الدراسات قبل السريرية ، ومناقشة كل من تطبيقاتها وقيودها. وتشمل هذه زرع الجناح ، وحقن تقويم العظام في الدماغ ، والحقن داخل القلب. زرع الجناح تحت الجلد هو الأسهل في المراقبة ، وبالتالي ، الأكثر ملاءمة للدراسات قبل السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت نقائل إلى الدماغ والأنسجة الأخرى من زرع الجناح ، مما يشير إلى أن الورم قد خضع لخطوات متعددة من ورم خبيث ، بما في ذلك داخل الأوعية ، والتسرب ، والاستعمار. يعد الحقن التقويمي في الدماغ هو الخيار الأفضل لتلخيص البيئة المكروية لورم الدماغ وهو مفيد لتحديد فعالية البيولوجيا لعبور الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ولكنه يتجاوز معظم خطوات الشلال النقيلي. يسهل الحقن داخل القلب ورم خبيث في الدماغ وهو مفيد أيضا لدراسة انتحاء الأعضاء. في حين أن هذه الطريقة تتخلى عن الخطوات السابقة للسلسلة النقيلية ، إلا أنه لا يزال يتعين على هذه الخلايا البقاء على قيد الحياة أثناء الدورة الدموية والتسرب والاستعمار. وبالتالي ، تتأثر فائدة نموذج PDX بمسار تلقيح الورم واختيار أي نموذج يجب استخدامه يجب أن تمليه المسألة العلمية والأهداف العامة للتجربة.
Introduction
زاد حدوث ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي (CNS) خلال السنوات الأخيرة1،2،3. كانت العلاجات التقليدية لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي ، مثل استئصال الورم ، والعلاج الإشعاعي للدماغ بالكامل ، والجراحة الإشعاعية التجسيمية ، ملطفة إلى حد كبير ونادرا ما تكون علاجية ، ويمكن أن تؤدي إلى آثار جانبية منهكة ، مثل التدهور المعرفي1. في الآونة الأخيرة ، يتم تطوير العديد من العلاجات المستهدفة والمناعية الجديدة لعلاج ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي والتي تبشر بالخير في كونها علاجات أكثر فعالية ، مع وجود آثار جانبية أقل4.
غالبا ما تتطلب ترجمة النتائج قبل السريرية إلى نقاط نهاية سريرية ذات مغزى استراتيجيات نمذجة فعالة وتنبؤية. تاريخيا ، كانت نماذج الطعم الأجنبي لخط الخلية هي المعيار للبحوث قبل السريرية في أبحاث ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن نماذج خط الخلايا هذه لا تعكس سلوك الورم الحقيقي للورم المضيف أو تمثل عدم التجانس النسيجي أو الجزيئي للمرض. علاوة على ذلك ، فإن نماذج خط الخلايا قادرة على التكيف مع ظروف النمو في المختبر ، وبالتالي تفقد الخصائص الأصلية للورم المضيف. تستخدم الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDXs) ، والتي تدمج ورم المريض في فأر يعاني من نقص المناعة أو إنساني ، بشكل متزايد في أبحاث السرطان الانتقالية. أظهر الباحثون أن نماذج PDX يمكنها عادة تلخيص نمو الورم بأمانة ، والخصائص النسيجية ، والحفاظ على عدم تجانس الورم ، والإمكانات النقيلية ، والسمات الوراثية الجزيئية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نماذج PDX هي تنبؤ حيث ترتبط فترة كمون الورم PDX ببقاء المريض بشكل عام ، كما ثبت أنها تتنبأ بدقة بالاستجابة العلاجية في تجارب المرضى 5,6.
كان هناك ظهور لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي PDXs. في الغالب ، تم تطويرها تمثل الأورام الناشئة من أصل واحد ، مثل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) 7 وسرطان الثدي 8,9 وسرطان الجلد 10,11. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير وتوصيف مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج PDX ، تمثل ثمانية أنواع فرعية نسيجية مختلفة12. لقد ثبت أن نماذج PDX لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي تشبه إلى حد كبير ورم المريض الأصلي ، من الناحية النسيجية والجزيئية ، وقد أظهرت أيضا اختلافات وأوجه تشابه نسيجية فريدة10,12. علاوة على ذلك ، في حين أن معظم نماذج PDX النقائل في الجهاز العصبي المركزي تحافظ على عدم التجانس النسيلي للأورام البشرية ، فقد أظهر بعضها أدلة على التعاقب النسيلي12 ، مما يجعلها مثالية أيضا لدراسة مقاومة العلاجات من خلال مراقبة التغيرات النسيلية بعد العلاج.
تحدد البروتوكولات الموصوفة هنا طرق إنشاء PDX وطرق التلقيح المختلفة المستخدمة في الدراسات قبل السريرية لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي (الشكل 1). تختلف طرق الزرع هذه في قدرتها على تقليد النمو والانبثاث. هنا ، يسلط البروتوكول الضوء على التطبيقات لكل طريق من طرق الزرع ويوضح كيف يمكن استخدامها لدراسة ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في المخطوطة الحالية ، تم تفصيل طرق إنشاء PDX ونشرها. كما تم عرض ثلاث طرق تلقيح مختلفة يمكن استخدامها لإجراء دراسات قبل السريرية عند تقييم ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي. يجب أن تعتمد طريقة الاختيار على أهداف التجربة. في بعض الحالات ، سيكون من المفيد استخدام أكثر من طريق تلقيح واحد. على سبيل المثال ، يوفر زرع الجناح تحت الجلد نهجا بسيطا لدراسة فعالية الدواء على نمو الورم وتقييم الدواء على هدفه ، كما أنه يوفر صورة مرئية لحجم الورم يمكن مراقبتها وقياسها بسهولة. ومع ذلك ، بمجرد تحديد الجدوى المستهدفة وخصائص النمو المضادة للورم ، يمكن للمرء إجراء دراسة تقويمية لتقييم فعالية البيولوجيا لعبور BBB ودراسة تأثيرها داخل البيئة المكروية لورم الدماغ. أيضا ، يتم تقييم البقاء على قيد الحياة بشكل أفضل في دراسات الحقن التقويمي وداخل القلب.
غالبا ما يكون الحقن داخل الجمجمة لنماذج PDX لورم خبيث في الدماغ هو النموذج قبل السريري المفضل بسبب وجود البيئة المكروية للدماغ و BBB. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات أن النقائل الدماغية لديها القدرة على تعديل BBB ، مما يؤثر على نفاذية الجزيئات إلى الورم16. لن تنعكس هذه التغييرات في BBB عن طريق الأورام المزروعة داخل الجمجمة ، وبسبب هذه الدراسات الدوائية قبل السريرية قد لا تعكس بشكل كامل استجابة أورام المريض. حتى مع هذا التحذير ، يظل الحقن داخل الجمجمة أفضل طريقة لاختبار نفاذية وفعالية الأدوية لعبور BBB في النماذج قبل السريرية. التحدي الآخر مع النماذج داخل الجمجمة هو أنها صعبة لمراقبة نمو الورم وتتطلب استخدام تقنيات التصوير. تم استخدام النقل الفيروسي ل PDXs مع علامات الفلورسنت أو التوهج الحيوي تقليديا ولكن يمكن أن يكون من الصعب القيام به. ومع ذلك ، يتم تطوير العديد من تقنيات التصوير لاستخدامها في الفئران التي لا تتطلب إدخال علامات ، والتي يمكن أن تحسن سهولة مراقبة أورام الدماغ العظمية هذه للدراسات قبل السريرية. وتشمل هذه تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT). أخيرا ، قد لا يعكس الحقن داخل الجمجمة بدقة البيئة المكروية لنقائل الجهاز العصبي المركزي خارج الدماغ ، كما هو الحال في ورم خبيث ليبتومينينجي. في هذه الحالة ، يمكن إجراء الحقن في الصهريج الكبير لتمثيل النقائل leptomeningeal بشكل أكثر دقة17.
يعد توصيف كل من السمات المظهرية والجزيئية لنموذج PDX أمرا مهما لاختيار أفضل النماذج للدراسات قبل السريرية. يمكن أن يتراوح زمن انتقال الورم من 7 إلى 140 يوما ويمكن أن تكون معدلات الاستلام متغيرة للغاية12. يجب أن يعتمد العدد الأمثل للحيوانات المراد زرعها وتوقيت بدء العلاج على خصائص كل نموذج PDX ويجب تحديده تجريبيا. علاوة على ذلك ، فإن المظهر الجزيئي لأورام PDX مهم أيضا لاختيار نماذج PDX الأكثر تمثيلا للدراسات قبل السريرية. كلما كان النموذج أقرب جزيئيا يمثل أنسجة المتبرع كلما كان من المرجح أن يكون أكثر تنبؤا بالاستجابة السريرية. أيضا ، من الأهمية بمكان التأكد من أن الأهداف المختارة من البيانات البشرية موجودة في PDXs التي يتم اختيارها للدراسات ويتم الحفاظ عليها عبر بضعة أجيال ، كما هو موضح يرتبط التعاقب النسيلي بملف تعريف جينومي مختلف للاستنساخ السائد الحالي. في ضوء ذلك ، تم وصف الملامح الظاهرية والجزيئية لأورام PDX النقيلي في الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع على مدى أجيالمتعددة 12.
على الرغم من المزايا العديدة لاستخدام نماذج PDX النقائل في الجهاز العصبي المركزي ، إلا أن هناك العديد من القيود المتعلقة باستخدامها. أولا ، تعد البيئة المكروية البديلة للورم وخاصة نقص الجهاز المناعي قيودا موثقة جيدا لنماذج PDX18. يؤدي الطعم الأجنبي للورم البشري في الفئران إلى استبدال السدى البشري بسدى الفأر مع كل مرور لاحق ويتم استبدال السدى البشري بشكل عام بالكامل بعد عدة مقاطع19. ومع ذلك ، فإن الاختلافات في البيئة المكروية للورم لا تؤدي إلى اختلافات كبيرة في المظهر الجزيئي لأورام PDX المزروعة بالجناح مقارنة بورم المريضالأصلي 12 ، مما يشير إلى أن نماذج الجناح لا تزال تمثل نماذج تجريبية جيدة لدراسة ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي. ثانيا ، يؤدي استخدام الحيوانات التي تعاني من نقص المناعة إلى نقص تسلل الخلايا المناعية في الورم واستجابة مناعية عامة من قبل المضيف ، مما يحد من الطريقة الأساسية التي يحاول بها المضيف مكافحة نمو السرطان12. في حين أن الفئران المتوافقة مع البشر المطعمة بالخلايا المناعية البشرية متاحة لدراسة تفاعلات خلايا مناعية معينة مع الورم ، لا يزال هناك العديد من الأسئلة والخلافات حول مناهج وطرق وتفسير تلك النتائج20.
في حين ثبت أن غالبية PDXs مستقرة وراثيا ، فقد أظهرنا نحن وآخرون أنه في حالات نادرة ، حتى في حالة عدم وجود علاجات أو ضغوط انتقائية خارجية أخرى ، يمكن أن تكون هناك تغييرات في استنساخ الأورام ، مثل استنساخ بسيط12،14،15. قد يؤدي هذا إلى تغييرات جذرية في المظهر الجزيئي ، مما يجعل الورم في النهاية لا يعكس الحيوانات المستنسخة السائدة في ورم المريض12. في حين أن PDXs التي تعرض التعاقب النسيلي يمكن أن يكون لها استخدام في الدراسات قبل السريرية ، فإن العديد من الجينات المخصصة للاستهداف (على سبيل المثال ، Her2) يمكن أن تضيع مع التعاقب النسيلي. لذلك ، يتم تشجيع الفحص المتكرر لنماذج PDX لتحديد ما إذا كانت لا تزال تحافظ على المظهر الجزيئي للاستنساخ المطلوب.
باختصار ، تمثل نماذج PDX نظاما نموذجيا ممتازا لدراسة ليس فقط ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي ولكن أيضا أنواع الأورام الأخرى. وقد أظهر تطوير هذه النماذج أنها تعكس إلى حد كبير المظهر الظاهري والملف الجزيئي وعدم تجانس ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزيالبشري 8،9،10،12. إنها بمثابة نماذج فعالة لدراسة كل من بيولوجيا ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي وتعمل أيضا بشكل جيد كنماذج ما قبل السريرية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، لتحل محل نماذج خط الخلية المستخدمة بشكل مفرط المستخدمة تاريخيا في الدراسات في الجسم الحي لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي. مما لا شك فيه أن الاختلافات بين PDX وورم المريض المتبرع موجودة12,18. معرفة ما هي هذه الاختلافات أمر مهم للتخطيط السليم وتنفيذ الدراسات قبل السريرية. أخيرا ، من خلال الاختيار بين العديد من طرق التلقيح ، فإن نماذج PDX متعددة الاستخدامات في استخدامها مما يسمح بدراسة جوانب متعددة من المرض. لا شك أن نماذج PDXs ستلعب دورا مهما في تعزيز فهمنا لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي وتطوير علاجات جديدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الشكل 3 أ مأخوذ من منشورنا السابق12 وتم إنشاؤه في مختبر الدكتور جان ساركاريا في Mayo Clinic.
Materials
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
- Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
- Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
- Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).
- Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P. Recent advances in managing brain metastasis. F1000Research. 7, 1000 (2018).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
- Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
- Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
- Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).
- Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
- Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
- Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
- Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
- Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).
