NMRベースのフラグメントスクリーニングは、最小サンプルで最大限の自動化モードで

1. フラグメントライブラリ 社内フラグメントライブラリ注:iNEXTの共同研究活動の1つの枠組みの中で、堅牢で下流の化学に優しい第1世代フラグメントライブラリが開発され12 、その後、エナミンと共同で第2世代のライブラリがまとめられ、DSI(Diamond-SGC-iNEXT)ポーズフラグメントライブラリ(以降、「社内ライブラリ」と呼びます)として知られています。このライブラリは、スクリーニング目的でBMRZで入手できます。フラグメントライブラリの完全性と溶解性を、以前に報告されたNMRベースのプロトコル9を使用して評価します。注:社内ライブラリは、非常に高い化学的多様性(>200シングルトン)を持つ768個のフラグメントで構成されています。フラグメント混合物でスクリーニングを実行すると、スクリーニングキャンペーンを大幅にスピードアップできます。ただし、ミックス中のフラグメントの数は、 1H-NMRスペクトルにおけるシグナルのオーバーラップのために制限されます。社内ライブラリが提供するより高い化学的多様性により、 1H観測NMRスペクトルに大きな化学シフトの重複なしに、12種類のフラグメントを含む混合物を調製できます。 768個のフラグメントのうち103個のフラグメントはフッ素原子を有する。19 Fスクリーニングの目的で、フッ素基を有する103個のフラグメントすべてを、最小19Fの化学シフトオーバーラップに基づいて5つのミックスに分割します。19Fスクリーニングでシグナルのオーバーラップを最小限に抑えるには、単一化合物測定からの化学シフト情報を使用して、フラグメント数が最大でシグナルのオーバーラップが最小の混合物を設計します。各混合物には20〜21個のフラグメントがあり、19Fの化学シフトが異なるため、フラグメントを明確に割り当てることができます。 ユーザー定義/提供のフラグメントライブラリユーザー定義または提供されたフラグメントライブラリを使用してスクリーニングキャンペーンを実行します。ただし、スクリーニングキャンペーンの前に次の手順を実行する必要があります。 ユーザーが事前に指定しない場合は、フラグメントのNMRベースの品質管理を実行します(BMRZでは、高度なソフトウェアツールが使用されます。9、第6.1.1章)。 使用前に、生体分子ターゲット、構造の完全性、およびフラグメントの濃度について、選択したバッファーへのフラグメントの溶解度を確認してください。 NMRスペクトルと測定時間の両方でシグナルのオーバーラップが減少するように混合物を設計します。 ステップ4.2に従って混合物を設計します。 ライブラリ全体ではなく、単一のフラグメントまたは混合物のサブセットをスクリーニングします。 2. サンプル調製 注:NMRによるハイスループットスクリーニングでは、サンプル調製にピペッティングロボットを使用します。NMRスペクトルだけでなく、タンパク質、RNA、DNAのシグナル取得の数日間にわたる安定性も温度変動に非常に敏感であるため、温度制御された自動システムは、ピペットで移されるサンプルの安定性を大幅に促進します。この目的のために、4〜40°Cで動作する追加のアドオンデバイスがピペッティングロボットに結合され、温度制御された環境でNMRサンプルを液体処理します。 リガンド混合物の調製サンプル調製ロボットを用いてNMR測定用のスクリーニングサンプルを調製します。ロボットの柔軟な構成により、幅広いアプリケーション(NMRチューブから保存容器へのサンプルの回収や一般的な液体処理作業など)が可能になります。異なる直径(1.7、2.0、2.5、3.0、5.0 mm)のNMRチューブを使用できます。サンプルロボットシステムと高度な制御ソフトウェアは、各コンテナタイプに割り当てられたバーコードを読み取り、液体充填プロトコルを最適に実行します。 社内ライブラリリガンド混合物の調製には、バーコードバイアルを使用してください。バーコード化されたバイアルは、サンプルの最高レベルの信頼性と最適なトレーサビリティを保証します。 768 個の化合物を 96 ウェルフォーマットの 8 枚のプレートに分配します。個々の断片のストック濃度は、d 6-DMSO/D2O(9:1)中で50 mMです。合計で、それぞれ12個のフラグメントを含む64個のミックスを準備します。混合物中の各フラグメントの最終濃度は4.2 mMです。注:ピペッティングロボットは、さまざまな形状のさまざまな容器タイプ(クライオまたはオートサンプラーバイアル、深さ96ウェルプレートの円形または正方形、バーコード化された標準バイアル、マイクロ遠心チューブ)に対応でき、さまざまなNMRチューブやラックへの液体移送の効率的な実行を支援します。 図1:(A)BMRZに設置されたハイスループットNMR試料調製とNMRチューブ充填ロボット。(B)BMRZ施設の600MHz分光計に設置された個別の温度制御ラックを備えたハイスループットサンプルチェンジャー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ブランク(参照リガンドスペクトル)およびターゲット(ターゲット存在下でのリガンド)によるスクリーニングサンプル調製NMRスクリーニングサンプルの調製には、標的生体分子(タンパク質/RNA/DNA)およびリガンド混合物の存在下で、標準NMRチューブのブルカーNMRポートフォリオから選択した3 mm NMR HTサンプルチェンジャーチューブを使用します。 定義されたスクリーニングバッファー中の生体分子ターゲット( 例:1H スクリーニング:10 μM RNAまたはタンパク質)を手動またはピペッティングロボットを使用して3 mm NMRチューブ(最終容量200 μL)に移します。 ロボットシステムを使用して次のステップでリガンド混合物の10 μL( 例:1Hスクリーニング)を、制御ソフトウェアの内蔵プロトコルを使用して、ターゲット生体分子と混合物を含むバーコード化された3 mm NMRチューブに移します。注:NMRチューブのバーコード番号は、取得したNMRデータセットに便利かつ自動的に組み込まれるため、取り違えのないID指向のワークフローが保証されます。ピペッティングロボット温度制御アクセサリを使用すると、NMRチューブ内の調製サンプルを一定の温度に保つことができます。 社内で定義した条件とパラメータ社内フラグメントライブラリに対してRNAおよびタンパク質のスクリーニングを行うための最適なバッファー条件を確立します。BMRZでのRNAには、25 mM KPi、50 mM KCl、pH 6.2でコンディショニングされたサンプルが使用されます。Mg2+ は任意である。 タンパク質は溶液条件に対して非常に敏感です。選択したターゲットに最適なバッファーを使用します。これらのバッファーのそれぞれについて、分析用のブランクとして機能するリガンドの追加参照スペクトルを取得します。 ユーザー指定の条件注:社内で確立された条件が潜在的なユーザーからスクリーニングされるターゲットに適していない場合は、次の手順を実行する必要があります。リガンド観察スクリーニング実験を実施および分析する際にバッファーの成分からの干渉を最小限に抑えるために、バッファーのみの1H-NMRを実行します。干渉成分は、重水素化等価物で適切に置換することができる。 サンプル生産(目標数量)/条件と入手可能性の制限注:特定の生体高分子の単離または組換え生産は、場合によっては困難であることが判明し、薬物スクリーニングキャンペーンを成功させるための標的の利用可能性が限られる可能性があります。ターゲットの可用性が限られているか無制限である場合は、NMRベースのフラグメントスクリーニングを成功させるために、以下の代替手段を利用することができます。制限がある場合は、 19F-NMRベースのスクリーニングを使用してください。典型的なフッ素化配位子は単一の 19Fシグナルを有する。したがって、信号の重複がない25〜30個のフラグメントを含むカクテルを使用してください。解析する信号が少なく、バッファ成分からの信号干渉がなく、ヒット識別のために依存する信号も少なくなります。 無制限の場合は、 1H-NMRなどの大型スクリーンを使用してください。より大きなフラグメントライブラリをスクリーニングできます。通常、フラグメントは複数の陽子で構成されているため、分析に使用できるシグナルが多くなります。 3. NMR取得条件 社内で一般的に定義された条件HTサンプルチェンジャーを搭載した分光器(自動化)ハイスループットスクリーニングには、HTサンプルチェンジャーを使用してのみ測定できる96ウェルプレートを使用してください。HTサンプルチェンジャーは、各ラックを個別に焼き戻す可能性も提供します。 最適なS/N比を得るには、ヘリウムまたは窒素冷却された極低温プローブを備えた分光器を使用してください。自動化には、自動チューニングおよびマッチングモジュール(ATM)が必要です。 パラメータセットとパルスシーケンス注:多くのNMR実験では、結合イベントを特徴付けることができます。ヒットの識別は、実験のセットアップによって異なります。以下の実験は、BMRZスクリーニングキャンペーンで日常的に使用されています。ただし、ユーザー定義のスクリーニングキャンペーンやユーザー仕様に応じて変更を加えることができます。TopSpinソフトウェアを使用する場合は、リガンドベースの実験用のパラメーターセット(SCREEN_STD、SCREEN_T1R、SCREEN_T2、SCREEN_WLOGSY)を含めます。パラメータセットには、必要なすべてのパラメータとパルスシーケンスが含まれています:STD:stddiffesgp.3;T1ρ: t1rho_esgp2d;T2: cpmg_esgp2d;と水LOGSY:ephogsygpno.2。 列挙されたすべての実験について、励起彫刻13 を水抑制として使用してください。参考までに、1D励起スカルプティング(zgesgp)を使用してください。スキャンの回数は、システムの感度(磁場強度とプローブヘッド)、サンプル濃度、および実験の選択によって異なります。NS=64 の 1D、NS=128 の T1ρ & T2 、NS=256 の STD、NS= 384 または 512 の waterLOGSY が推奨されます。 19 Fスクリーニングでは、1DとT2の両方の実験を使用します:1D:19 F{1 H}プローブヘッドにはF19CPD(pp=zgig)、19F/1HプローブヘッドにはF19(pp=zg)。SCREEN_19F_T2 (pp = cpmgigsp) です。 スペクトル幅は 220 ppm、励起周波数は -140 ppm を使用してください。実験時間は、ハードウェアとサンプル濃度に応じて1〜5時間です(生体高分子の長期安定性を確保します)。T2の場合、CPMG時間は0ミリ秒から200ミリ秒の間で交互に行われるはずです。 加工STD、T1ρ およびT2 実験を擬似2Dとして記録する。2つの単一の1Dスペクトルを処理するために、IconNMRは、リラックスオプションの有無にかかわらず、auプログラムproc_stdを使用します。最初のオプションは、参照1Dと2つのスペクトルの差を提供します。2番目のオプションは、短い緩和時間と長い緩和時間を持つ2つの別々のスペクトルを生成します。waterLOGSYは単一の1Dであり、溶媒信号に対して負の位相でフェーズする必要があります。 ユーザー固有の条件前述のパラメータのいずれかをユーザー定義の条件に適合させます。例えば、施設のユーザー提供タンパク質が一般的に使用される温度で安定していない場合、温度、濃度、緩衝条件などを変化させて最適化実験を行うことができます。 4.データ分析 フラグメントライブラリQC(d6-DMSO/特異的バッファー)および定量シーエムシー-q注:フラグメントライブラリの品質管理は、スクリーニングキャンペーンの開始前に不可欠です。さらに、フラグメントライブラリの長期安定性は、いくつかのスクリーニングキャンペーンの適用のために確保される必要があり、ライブラリの品質を定期的に評価する必要があります。この目的のために、TopSpinの統合ソフトウェアCMC-qとCMC-aが品質と数量の評価に使用されます。CMC-qおよびCMC-aは、トップスピン社のソフトウェアモジュールで、有機低分子から得られる1H-NMRスペクトル9を用いた構造検証を含むスムーズな取得・解析が可能です。完全性のために、d6-DMSO中のフラグメント濃度が1 mMの評価サンプルを調製します。ピペッティングロボットを使用して、液体サンプルコレクションを3 mm NMRチューブに充填することにより、自動化された方法でサンプルを調製します。 溶解度評価には、pH 7.4の50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、150 mM塩化ナトリウム、90%H2O/10O、および1 mMの3-(トリメチルシリル)プロピオン酸-2,2,3,3-D4酸ナトリウム塩(TMSP-Na)中の1 mM化合物からなるサンプルを使用します。 三重共鳴5 mm TCI極低温プローブと一度に579サンプルを処理できるHTサンプルチェンジャーを備えた600 MHz NMR分光計を使用して、298 Kまたは293 KのNMRスペクトルを収集します。 CMC-qソフトウェアのセットアップについては、IconNMRユーザーの作成、FastLaneNMRのアクティブ化、およびHTサンプルチェンジャーの変更を実装するユーザーマニュアルの指示に従ってください。 90°パルスを校正し、TopSpinプロソルテーブルに保存します。 96サンプルウェルプレートをHTサンプルチェンジャーの5つのラック位置のいずれかに配置します。 提案された化学構造、一意の識別子、およびバッチ内の各サンプルのHTサンプルチェンジャー内の位置を含むSDFファイル(構造データファイル)をロードするには、CMC-qセットアップウィンドウの[参照]に移動し、.sdfで終わるファイルを選択してから[開く]をクリックします。 CMC.qバッチ自動化設定で、測定する実験を定義する検証タイプ、IconNMRユーザーを設定し、溶媒を定義します。 SDFファイルのパス、分子ID、サンプル位置のSDFファイルを定義します。 [開始]をクリックして取得を開始します。もう一度[取得の開始]をクリックします。CMC-q セットアップは、[保存] をクリックして保存することもできます。 CMC-qのセットアップ手順の詳細については、ブルカーのユーザーマニュアルの指示に従ってください。 シーエムシー-aCMC-aについては、トップスピン社内のソフトウェアモジュールを使用して、有機低分子9から得られる1H-NMRスペクトルを用いた構造検証を含む解析が可能です。 混合設計注:適切な混合設計は、NMRをプラットフォームとして使用するスクリーニングにおいて重要な役割を果たします。混合物あたりのフラグメント数が多いと、スクリーニングが速くなりますが、偽陽性および偽陰性のリスクが高まります。数値を小さくすると、そのリスクは減少しますが、スクリーニングの実施にかかる時間が長くなります。一般に、混合を作成するときは信号のオーバーラップを避ける必要があります。社内ライブラリを使用すると、ライブラリは多様性が高く、高い化学的多様性を維持しながらシグナルの重複がほとんどないように特別に設計されているため、 1Hスクリーニングではこれを無視できます。これは、64ミックスを作成するために特別な設計手順を実行する必要がないことを意味します。19Fスクリーニングは、フッ素を含む社内ライブラリのフラグメントに依存しており、ライブラリはこれらの特定のフラグメントのシグナルオーバーラップを減らすために作成されていないため、適切な混合物を設計してください。 19Fを含むすべてのフラグメントの単一化合物スペクトルを測定します。 各信号の化学シフト情報に注意してください。 この情報に従って、混合物ごとに20〜21個のフラグメントを選択してください。これにより、シグナルの重複のない20〜21個のフラグメントを含む5つの混合物が得られ、データの半自動分析が可能になります。 リガンド内で観察された生体高分子-リガンド相互作用のヒット同定を実行注: 19Fと 1Hのスクリーニング手順では、ヒットの定義が異なります。以下のヒット識別は、当社が設定し、特定のルールに従っています。ヒット判定の対象は非常に主観的な方法であり、ユーザーごとに異なる場合があります。それにもかかわらず、検証と信頼性を維持するために、ヒット識別のルールが一度合意されると変更されないことが最も重要です。1Hスクリーン ヒットを確実に決定するには、1D 1Hスペクトル、waterLOGSYおよびT2 緩和実験をターゲットの存在下および非存在下の両方で取得し、結合剤を同定します。3つの実験はすべて、結合イベントを示す可能性があります。ブランクスペクトルと比較してサンプルスペクトルに6Hzを超えるCSPが見られる場合、これはヒットの兆候と見なされます。waterLOGSY中の強い正のシグナルと、サンプルスペクトルの30%以上のT2 減少が見られる場合も同様です。結合イベントは、スペクトルを含むサンプルをそれぞれのブランクスペクトルと比較すると、3つの実験すべてで示すことができます。ただし、結合イベントは、3つの実験すべてで表示されない場合があります。このため、フラグメントを結合ヒットとして分類するために、前述のイベントのうち少なくとも2つが発生する必要があることが合意されました。 TopSpinのFBSツールを使用して、フラグメントの状態をバインディング、あいまい、不明、集約、非バインディングに定義します。 ミックスが終了したら、FBSツール内で承認します。 FBSプロジェクト内の[概要]タブで、[ スクリーニングレポートの作成]をクリックします。これにより、.xlsxファイルを作成するウィンドウが開きます。ユーザーは、スプレッドシートで報告されるすべてのリガンド、結合リガンドのみ、結合リガンドのみではない、あいまいなリガンドのいずれかを選択できます。 19名F 画面非バインダー、週バインダー、および強バインダーを区別するには、200 msのターゲット測定値と200 msブランク測定値の積分商を0 msターゲット測定値の商で割り、0 msブランク測定値を使用します。注: これにより、0 から ~1 (ヒット スコア) の範囲の値が得られ、バインド状態ごとにしきい値を割り当てることができます。 参照 200 ミリ秒の測定の平均をベースラインしきい値として使用して、ヒット スコアが 1 を超えるケースをマークします。これは、インポートされた積分に負の値が含まれている場合、または参照測定値がターゲット測定値よりも高い場合に発生する可能性があります。ヒットスコア ≤ 0.67 は弱ヒット、0.33 はノーヒットと見なされます。 図 2 に例を示します。 図2: 19Fスクリーニングのヒット識別。 例示化合物の 19FCPMG NMRスペクトルの断面図。この図は、バインダーの特性を説明しています。 19名RNAの存在下および非存在下での混合物サンプルから取得した化合物のF-CPMGスペクトル。値は、対応するピークのノルム積分値を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 データ分析分析用のデータの準備メモ: 集録したデータに目に見える欠陥がないことが重要です。これは、シミングに問題がある、または水抑制が不十分なデータを分析のために考慮すべきではないことを意味します。むしろ、データを再度記録し、サンプル(気泡がないなど)、温度、シム、および水分抑制ですべてが正常であることを確認することをお勧めします。データの正確性は、DMSO信号を比較する際に常に評価できます。 1Hスクリーニング1Hスクリーニングデータを解析するには、TopSpin 4.0.9のFBSツール(追加ライセンスが必要)を使用してください。 FBSツールマニュアルの指示に従って、データ分析を開始します。次の手順は、マニュアルに記載されている手順をまとめたものです。 スクリーニングキャンペーンからのBMRZ NMRデータを保存し、異なるスクリーニング混合物ごとに独自のディレクトリを持ち、サブディレクトリにサンプルで測定されたさまざまな実験を保持するようにします。 FBSツールを使用するには、生体分子ターゲットを含まないサンプルから保存されたすべてのデータを含む参照スペクトルと、異なる/nmrディレクトリで測定された単一の化合物を保存します。FBSツールはそれぞれのディレクトリパスを個別に要求するため、これは重要です。注:FBSツールは、次のデータセットがスクリーニングサンプルの混合物が保存されているのと同じディレクトリに保存されている場合、ディレクトリをスクリーニングプロジェクトとして認識します(csv、FragmentScreen XMLドキュメント、およびBAKファイル)。 TopSpin 4.0.9を使用する場合は、取得したデータを含むディレクトリへの直接パス、いわゆるDIRを作成します。 すべての混合物が個別のディレクトリを持つ/nmrディレクトリを選択します。 スクリーニングされたサンプルの FBS ツールを起動するには、シンボル FBS プロジェクトを TopSpin ウィンドウの中央にドラッグします。選択したディレクトリに、以前に指定されたデータセットがコピーされた場合、FBSプロジェクトシンボルが表示されます。 フラグメント ベースのスクリーニングオプション ウィンドウは、新しいFBSプロジェクトを最初にロードするときに自動的に開きます。このウィンドウで、カクテルファイルを選択します。カクテルファイルは、ミックスの名前の割り当て、各フラグメントの名前、およびミックスへの分割を含むcsvファイルです。また、単一フラグメントのすべての測定スペクトルを含む参照リガンドスペクトルフォルダーを定義します。最後に、参照空の実験フォルダー (通常は、調査対象のターゲットを含まないミックスのデータセットを含むフォルダー) を定義します。 フラグメントベースのスクリーニングオプションには、スペクトルタイプと呼ばれるタブがあり、調査されたスペクトルと スペクトル を表示するための色を定義できます。あらかじめ処理されたデータに応じてスペックタイプを設定します。 [表示レイアウト ]タブで、仕様タイプに従って互いに比較するスペクトルを定義します。 [OK] をクリックして FBS プロジェクトを開始します。 データを見ていると、別のウィンドウが開き、すべてのカクテルミックスと各ミックスのすべてのリガンドが表にまとめられます。セルをダブルクリックすると、それぞれのデータセットが開き、たとえば 1H 1D Blankスペクトルとターゲットを含むデータセットが比較されます。 バインダーを割り当てる前に、基準ピーク(すべての測定値のDMSO、および単一の化合物)が互いに一致し、同じ化学シフトを持っていることを確認してください。違いが見られる場合は、TopSpinのシリアル処理オプションを使用して修正します。 シリアル処理オプションは、[詳細設定] の [プロセス] タブにあります。データセットから選択したすべてのスペクトルに変更を適用します。このようにして、Spectypesを実験番号に簡単に割り当てることができ、すべてのスペクトルを一度にシフトしてリファレンスに合わせることができます。 19名F スクリーニング19F 混合の最初の分析では、各混合の統合ファイルを作成します。統合領域を定義するには、[分析]タブの[統合]機能をクリックします。混合物中のすべてのフラグメントについて、対応する19F単体の明確な積分領域が定義されていることを確認してください。 [統合リージョンの保存/エクスポート] ボタンを使用して、将来使用するために統合ファイルをエクスポートします。使用されている統合ファイルを C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng または TopSpin インストールディレクトリの対応するパスに保存します。 19F データの場合は、調査対象のターゲットの有無にかかわらずデータセットを開きます。 統合ファイルを現在のスペクトルにロードするには、分析タブを再度開き、統合に移動し、統合領域の読み取り/インポートボタンを使用して、対応する統合ファイルをロードします。これにより、そのファイルの定義された領域が現在のスペクトルに読み込まれます。 保存して戻り、 積分 タブですべての統合領域のリストを検索します。これをスプレッドシートまたはデータのさらなる分析に使用されるその他のツールにコピーします。 ターゲットの有無にかかわらず、すべてのミックスに対してこの手順を繰り返します。 データ管理使いやすさと生産性のために、取得したデータをさらに分析および保存するために、統一されたワークフローを設定します。 1Hと 19Fの両方のスクリーニングでは、それぞれに特別に設計されたスプレッドシートを使用します。注: 1Hスクリーニングでは、これは純粋にデータ管理と各ターゲットの要約に使用され、 19Fスクリーニングでは、第4.3章で説明した商を使用して、積分データがコピーされた後、各フラグメントをヒット/ヒットなしとして自動的にラベル付けしました。これにより、ファイルが適切に設定されていると仮定すると、分析中の人為的エラーのリスクが軽減され、すべての重要な情報がファイル内の1か所に収集され、データを最初に確認するための追加のプログラムを必要とせずに、事実上誰でも開くことができます。