NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus
Summary
Das fragmentbasierte Screening mittels NMR ist eine robuste Methode zur schnellen Identifizierung von niedermolekularen Bindemitteln an Biomakromoleküle (DNA, RNA oder Proteine). Es werden Protokolle vorgestellt, die die automatisierungsbasierte Probenvorbereitung, NMR-Experimente und Aufnahmebedingungen sowie Analyse-Workflows beschreiben. Die Technik ermöglicht die optimale Nutzung von 1H und 19F NMR-aktiven Kernen für den Nachweis.
Abstract
Das fragmentbasierte Screening (FBS) ist ein gut validiertes und akzeptiertes Konzept innerhalb des Wirkstoffforschungsprozesses sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie. Der größte Vorteil des NMR-basierten Fragmentscreenings ist seine Fähigkeit, nicht nur Bindemittel über 7-8 Größenordnungen der Affinität zu detektieren, sondern auch die Reinheit und chemische Qualität der Fragmente zu überwachen und so qualitativ hochwertige Treffer und minimale falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu erzeugen. Eine Voraussetzung innerhalb des FBS ist die Durchführung einer anfänglichen und periodischen Qualitätskontrolle der Fragmentbibliothek, die Bestimmung der Löslichkeit und chemischen Integrität der Fragmente in relevanten Puffern und die Einrichtung mehrerer Bibliotheken, um verschiedene Gerüste abzudecken, um verschiedene Makromolekül-Zielklassen (Proteine/RNA/DNA) aufzunehmen. Darüber hinaus ist eine umfassende NMR-basierte Optimierung des Screening-Protokolls in Bezug auf Probenmengen, Geschwindigkeit der Erfassung und Analyse auf der Ebene des biologischen Konstrukts/Fragmentraums, im Zustandsraum (Puffer, Additive, Ionen, pH und Temperatur) und im Ligandenraum (Ligandenanaloga, Ligandenkonzentration) erforderlich. Zumindest in der akademischen Welt wurden diese Screening-Bemühungen bisher nur in sehr begrenztem Umfang manuell durchgeführt, was zu einer begrenzten Verfügbarkeit der Screening-Infrastruktur nicht nur im Arzneimittelentwicklungsprozess, sondern auch im Zusammenhang mit der Entwicklung chemischer Sonden führte. Um den Anforderungen wirtschaftlich gerecht zu werden, werden fortschrittliche Workflows vorgestellt. Sie nutzen die Vorteile der neuesten hochmodernen Hardware, mit der die flüssige Probenentnahme auf temperaturkontrollierte Weise automatisiert in die NMR-Röhrchen gefüllt werden kann. 1H/19F NMR-Liganden-basierte Spektren werden dann bei einer bestimmten Temperatur aufgenommen. Der Probenwechsler mit hohem Durchsatz (HT-Probenwechsler) kann mehr als 500 Proben in temperaturgesteuerten Blöcken verarbeiten. Zusammen mit fortschrittlichen Softwaretools beschleunigt dies die Datenerfassung und -analyse. Des Weiteren wird die Anwendung von Screening-Routinen auf Protein- und RNA-Proben beschrieben, um die etablierten Protokolle für eine breite Anwenderbasis in der biomakromolekularen Forschung bekannt zu machen.
Introduction
Das fragmentbasierte Screening ist heute eine häufig verwendete Methode zur Identifizierung von relativ einfachen und niedermolekularen Molekülen (MW <250 Da), die eine schwache Bindung an makromolekulare Ziele wie Proteine, DNA und RNA aufweisen. Initiale Treffer von Primär-Screens dienen als Grundlage, um ein Sekundär-Screening von kommerziell erhältlichen größeren Analoga der Hits durchzuführen und dann chemiebasierte Fragmentwachstums- oder Verknüpfungsstrategien zu nutzen. Für eine erfolgreiche fragmentbasierte Wirkstoffentdeckungsplattform (FBDD) ist im Allgemeinen eine robuste biophysikalische Methode zum Nachweis und zur Charakterisierung schwacher Treffer, eine Fragmentbibliothek, ein biomolekulares Ziel und eine Strategie für die Follow-up-Chemie erforderlich. Vier häufig angewandte biophysikalische Methoden innerhalb der Wirkstoffforschungskampagnen sind thermische Verschiebungsassays, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Kristallographie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR).
Die NMR-Spektroskopie hat in den verschiedenen Stadien der FBDD unterschiedliche Rollen gespielt. Neben der Sicherstellung der chemischen Reinheit und Löslichkeit der Fragmente in einer Fragmentbibliothek, die in einem optimierten Puffersystem gelöst sind, können Liganden-beobachtete NMR-Experimente die Bindung von Fragmenten an ein Target mit geringer Affinität nachweisen, und die Target-beobachteten NMR-Experimente können das Bindungsepitop des Fragments abgrenzen, wodurch detaillierte Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien möglich sind. Innerhalb der Epitopkartierung können NMR-basierte chemische Verschiebungsänderungen nicht nur die orthosterischen Bindungsstellen identifizieren, sondern auch allosterische Stellen, die kryptisch und nur in sogenannten angeregten Konformationszuständen des biomolekularen Ziels zugänglich sein könnten. Wenn das biomolekulare Target bereits an einen endogenen Liganden bindet, können die identifizierten Fragmenttreffer durch NMR-basierte Konkurrenzexperimente leicht als allosterisch oder orthosterisch klassifiziert werden. Die Bestimmung der Dissoziationskonstante (KD) der Ligand-Target-Wechselwirkung ist ein wichtiger Aspekt im FBDD-Prozess. NMR-basierte chemische Shift-Titrationen, entweder Liganden- oder Target-Titrationen, können problemlos durchgeführt werden, um den KD zu bestimmen. Ein großer Vorteil der NMR besteht darin, dass die Interaktionsstudien in Lösung und in der Nähe physiologischer Bedingungen durchgeführt werden. Somit können alle Konformationszustände für die Analyse der Ligand/Fragment-Wechselwirkung mit seinem Target untersucht werden. Darüber hinaus sind NMR-basierte Ansätze nicht nur auf das Screening gut gefalteter löslicher Proteine beschränkt, sondern werden auch auf größere Zielräume wie DNA, RNA, membrangebundene und intrinsisch ungeordneteProteine angewendet 1.
Fragmentbibliotheken sind ein unverzichtbarer Bestandteil des FBDD-Prozesses. Im Allgemeinen fungieren Fragmente als erste Vorläufer, die schließlich Teil (Substruktur) des neuen Inhibitors werden, der für ein biologisches Ziel entwickelt wurde. Es wurde berichtet, dass mehrere Medikamente (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) als Fragmente begonnen haben und nun erfolgreich in den Kliniken eingesetzt werden. Typischerweise handelt es sich bei Fragmenten um organische Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht (<250 Da) und einer hohen wässrigen Löslichkeit und Stabilität. Eine sorgfältig ausgearbeitete Fragmentbibliothek, die in der Regel einige hundert Fragmente enthält, kann bereits eine effiziente Erkundung des chemischen Raums versprechen. Die allgemeine Zusammensetzung von Fragmentbibliotheken hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt und wurde meist durch das Zerlegen bekannter Medikamente in kleinere Fragmente abgeleitet oder rechnerisch entworfen. Diese verschiedenen Fragmentbibliotheken enthalten hauptsächlich flache aromatische oder Heteroatome und halten sich an die Lipinski-Regel von 5 6 oder an die aktuelle kommerzielle Trendregel von 3 7, vermeiden jedoch reaktive Gruppen. Einige Fragmentbibliotheken wurden auch von hochlöslichen Metaboliten, Naturstoffen und/oder deren Derivaten abgeleitet oder zusammengesetzt8. Eine allgemeine Herausforderung, die von den meisten Fragmentbibliotheken gestellt wird, ist die Einfachheit der nachgelagerten Chemie.
Das Zentrum für Biomolekulare Magnetresonanz (BMRZ) der Goethe-Universität Frankfurt ist Partner von iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), einem Konsortium für strukturelle Forschungsinfrastrukturen für alle europäischen Forschenden aus allen Bereichen der biochemischen und biomedizinischen Forschung. Im Rahmen der vorherigen Initiative von iNEXT, die 2019 endete, wurde eine Fragmentbibliothek mit 768 Fragmenten erstellt, mit dem Ziel, “minimale Fragmente und maximale Vielfalt” zu erreichen, die einen großen chemischen Raum abdeckt. Darüber hinaus wurde die iNEXT-Fragmentbibliothek im Gegensatz zu allen anderen Fragmentbibliotheken auch auf der Grundlage des Konzepts der “ausgeglichenen Fragmente” entwickelt, mit dem Ziel, die nachgelagerte Synthese komplexer Liganden mit hoher Affinität zu erleichtern, und von nun an als Inhouse-Bibliothek (Diamond, Structural Genomic Consortium und iNEXT) bezeichnet.
Die Etablierung von FBDD mittels NMR erfordert Arbeitskräfte, Wissen und Instrumente. Am BMRZ wurden optimierte Arbeitsabläufe entwickelt, um die technische Unterstützung beim Fragment-Screening mittels NMR zu unterstützen. Dazu gehören Qualitätskontrolle und Löslichkeitsbewertung der Fragmentbibliothek 9, Pufferoptimierung für die ausgewählten Targets, 1H oder 19F- beobachtetes 1D-Liganden-basiertes Screening, Konkurrenzexperimente zur Unterscheidung zwischen orthosterischer und allosterischer Bindung, 2D-basierte Target-beobachtete NMR-Experimente zur Epitopkartierung und zur Charakterisierung der Wechselwirkung mit sekundären Derivaten der ursprünglichen Fragmenttreffer. Das BMRZ hat automatisierte Routinen für die Analyse von Kleinmolekül-Protein-Wechselwirkungen etabliert, wie auch bereits in der Literatur 10,11 diskutiert, und verfügt über die notwendige automatisierte Infrastruktur für das NMR-basierte Fragmentscreening. Es hat Sättigungstransferdifferenz-NMR (STD-NMR), Wasser-Liganden-Spektroskopie (waterLOGSY) und Carr-Purcell-Meiboom-Gill-basierte (CPMG-basierte) Relaxationsexperimente implementiert, um Fragmente innerhalb eines breiten Spektrums von Affinitätsregimen zu identifizieren, sowie modernste automatisierte NMR-Instrumente und Software für die Wirkstoffforschung. Während das NMR-basierte Fragment-Screening für Proteine gut etabliert ist, wird dieser Ansatz weniger häufig verwendet, um neue Liganden zu finden, die mit RNA und DNA interagieren. Das BMRZ hat den Proof-of-Concept für neue Protokolle etabliert, die die Identifizierung von niedermolekularen RNA/DNA-Wechselwirkungen ermöglichen. In den folgenden Abschnitten dieses Beitrags wird über die Anwendung von Screening-Routinen auf Protein- und RNA-Proben berichtet, um die etablierten Protokolle für eine breite Anwenderbasis in der biomakromolekularen Forschung bekannt zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vielseitigkeit des NMR-basierten Fragment-/Wirkstoff-Screenings. Das BMRZ hat erfolgreich modernste automatisierte NMR-Instrumente sowie STD-NMR-, waterLOGSY- und Relaxationsexperimente implementiert, um Fragmente innerhalb eines breiten Affinitätsbereichs für die Wirkstoffforschung zu identifizieren. Die installierte Hardware umfasst einen Hochdurchsatz-Probenvorbereitungsroboter und eine Hochdurchsatz-Probenspeicher-, Wechsler- und Datenerfassungseinheit, die einem 600-MHz-Spektrometer zugeordnet sind. Eine kürzlich erworbene Kryosonde für 1 H, 19 F, 13C und 15 N gewährleistet die erforderliche Empfindlichkeit für die vorgeschlagenen Messungen und ermöglicht eine Entkopplung von 1 H (1) während der 19F-Detektion. Diese Sonde ist mit der neuesten Generation von NMR-Konsolen verbunden, die die Möglichkeit bieten, die fortschrittlichen Software-Tools von Bruker zu verwenden, einschließlich CMC-q, CMC-assist, CMC-se und FBS (in TopSpin enthalten). Das fragmentbasierte Screening-Tool (FBS) ist in der neuesten Version von TopSpin enthalten und hilft bei der Analyse der Hochdurchsatzdaten, die aus STD-, waterLOGSY- und T2/T 1-r-Relaxationsexperimenten bestehen. Die flüssige 1D-1H-Probenentnahme kann mit Hilfe des Probenfüllroboters automatisiert in die NMR-Röhrchen gefüllt werden. In der Regel wird ein Block von 96 Röhrchen (3 mm) in etwa zwei Stunden befüllt. Die 96-Well-Platten-Racks werden direkt im HT-Probenwechsler positioniert, der den Barcode des Blocks liest und die NMR-Röhrchen den von der Automatisierungssoftware (IconNMR) gesteuerten Experimenten zuordnet. Fünf 96-Well-Platten-Racks können gleichzeitig im HT-Probenwechsler gelagert und programmiert werden. Die Temperatur der einzelnen Racks kann separat gesteuert und geregelt werden. Zusätzlich kann jede einzelne Probe vor der Messung auf die gewünschte Temperatur vorkonditioniert werden (Vorwärmen und Röhrchentrocknung zur Entfernung von kondensierter Feuchtigkeit).
Eignung für ein breites Anwendungsspektrum. Eine der breiten Anwendungen dieses automatisierten NMR-basierten Screenings ist die Identifizierung und Entwicklung neuartiger Liganden, die an ein biomakromolekulares Ziel (DNA/RNA/Proteine) binden. Zu diesen Liganden können orthosterische und allosterische Inhibitoren gehören, die typischerweise nicht-kovalent binden. Darüber hinaus wird die FBDD mittels NMR in der Regel als erster Schritt zur Auswahl vielversprechender Verbindungen eingesetzt, wobei die zu erfüllenden Anforderungen die Verfügbarkeit des biomolekularen Targets in ausreichenden Mengen sind. Dieses Ziel gliedert sich in zwei Hauptaufgaben.
Aufgabe eins ist die Entwicklung und Charakterisierung einer internen Fragmentbibliothek aus folgenden Gründen: anfängliche und periodische Qualitätskontrolle, Charakterisierung und Quantifizierung von mehr als 1000 Fragmenten; Bestimmung der Löslichkeit der Fragmente in Puffern, die für jedes Target, insbesondere für Proteintargets, optimiert sind; und die Einrichtung mehrerer Bibliotheken, um verschiedene Gerüste unterzubringen und sich auf andere Makromolekülklassen auszudehnen. Aufgabe zwei ist die Integration von Arbeitsabläufen für das fragmentbasierte Wirkstoffdesign (FBDD) mittels NMR mit: automatisiertem 1D-Liganden-Beobachtungs-Screening (1H und 19F beobachtet); automatisierte Ersatzassays (Konkurrenzexperimente mit (natürlichen) Liganden) zur Unterscheidung von orthosterischer und allosterischer Bindung; automatisierte Sekundärscreenings mit mehreren Fragmenten; automatisiertes 2D-Protein-Screening und Sekundär-Screening einer Reihe von Derivaten um einen ersten Treffer unter Verwendung der EU-OPENSCREEN-Bibliothek oder einer anderen Bibliothek; und Re-Profiling-Screening der FDA-Bibliothek gegen die ausgewählten Ziele.
Darüber hinaus kann die Metabotypisierung verschiedener Zelllinien (krankheitsrelevant) durchgeführt werden, um die regulatorischen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Kontrolle des Zellzyklus und den Stoffwechsel miteinander verbinden. Darüber hinaus gibt es eine funktionelle Charakterisierung von RNA/DNA/Protein-Regulationselementen in vivo und in vitro zur Optimierung der Konstrukt-/Domänenoptimierung (Stabilitätsoptimierung für strukturelle Untersuchungen (Puffer-, pH-, Temperatur- und Salzscreening) und eine Erweiterung des NMR-basierten Fragmentscreenings auf Membranproteine und intrinsisch ungeordnete Proteine, die für andere Techniken im Allgemeinen unzugänglich sind.
Begrenzungen. Die Verwendung von 19-F– und 1-H-Fragmentbibliotheken hat ihre Vor- und Nachteile, von denen im Folgenden einige erwähnt werden. Der größte Vorteil von 19F gegenüber 1H Messungen ist die Geschwindigkeit sowohl der eigentlichen Messzeit als auch der anschließenden Analyse, da die Mischungen fast doppelt so viele Fragmente enthalten und weniger Experimente durchgeführt werden müssen. Auch die Nachanalyse ist für das 19F-Screening einfacher, da es keine Interferenzen durch Puffer gibt und zusätzlich einen breiteren chemischen Verschiebungsbereich mit nahezu keiner Signalüberlappung für ein optimal ausgelegtes Fragmentgemisch bietet. Die Spektren selbst sind stark vereinfacht und haben in der Regel nur ein oder zwei Signale pro Fragment, abhängig von der Anzahl der Fluoratome. Die Analyse dieser Spektren kann so automatisiert werden, was wiederum Zeit spart. Dies geht auf Kosten der chemischen Vielfalt, zumindest für die in dieser Studie verwendete Bibliothek. Da nur ~13% der Bibliothek 19 F enthalten, aber natürlich alle im 1-H-Screening verwendbar sind, ist die Diversität der 19F-Screening-Fragmente geringer. Dies könnte durch die Verwendung speziell entwickelter 19-F-Bibliotheken mit mehr Fragmenten und größerer chemischer Vielfalt umgangen werden. Ein weiterer Nachteil des 19-F-Screenings ist die geringe Anzahl von Signalen pro Fragment. Fragmente bestehen in der Regel aus mehr als einem Wasserstoffatom. Daher können sich 1H beobachtete Screening-Experimente auf unterschiedliche Signale für dasselbe Fragment verlassen, um die Bindung zu erkennen. Dies führt zu einem höheren Maß an Sicherheit bei der Identifizierung von Treffern für das 1-H-Screening, während sich das 19-F-Screeningauf ein oder zwei Signale pro Fragment verlassen muss.
Es wurde ein detaillierter Bericht über die modernen, automatisierten NMR-basierten Fragment-Screening-Instrumente, die Software und die Analysemethoden und deren Protokolle vorgestellt. Die installierte Hardware umfasst einen Hochdurchsatz-Probenvorbereitungsroboter und eine Hochdurchsatz-Probenspeicher-, Wechsler- und Datenerfassungseinheit, die einem 600-MHz-Spektrometer zugeordnet ist. Ein kürzlich installierter kryogener Sondenkopf für 1 H, 19 F, 13C und 15N gewährleistet die erforderliche Empfindlichkeit für die vorgeschlagenen Messungen und ermöglicht eine1-H-Entkopplung bei 19F-Detektion. Darüber hinaus bietet die neueste Generation der NMR-Konsole die Möglichkeit, fortschrittliche Analysesoftware zur Unterstützung der Erfassung und On-the-Fly-Analyse zu verwenden. Die oben besprochene Technologie, die Arbeitsabläufe und die beschriebenen Protokolle sollten Anwendern, die FBS mittels NMR verfolgen, einen bemerkenswerten Erfolg bescheren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von iNEXT-Discovery, Projekt Nummer 871037, gefördert durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission.
Materials
| Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
| Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
| Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
| SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
| SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |
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