单一肌纤维培养测定法用于评估体外成人肌肉干细胞功能

动物的牺牲必须按照国家动物实验规定进行。这里描述的协议是根据莱布尼茨衰老研究所 – 弗里茨·李普曼研究所的指导方针和欧盟（EU）指令2010/63 / EU（器官摘取许可证编号：O_JvM_18-20）执行的。 图1总结了该协议的基本步骤。 1. 培养板、培养基和巴斯德移液器的制备 注意：分离和培养单个肌峰布所需的所有材料和设备都需要尽可能无菌。因此，建议在半无菌解剖罩下分离单个肌纤维。 使用无菌HS（马血清）涂覆组织培养板。涂层可防止单个肌纤维附着在塑料表面。对于每只小鼠，需要4孔12孔板用于分离，24孔板的专用孔用于培养。将1 mL的12孔板的孔和具有0.5mL HS的24孔板的孔在室温（室温）下孵育5分钟，然后取出HS并让板再干燥5分钟。注意：如果保持无菌，HS可以多次收集并重复用于涂层目的。 通过补充DMEM（Dulbecco的改性Eagle培养基，含有4.5g / L葡萄糖和丙酮酸钠）和20S（胎儿牛血清）来制备肌纤维分离培养基，通过0.22μm过滤器过滤。在分离前约30分钟将培养基加入预包被的隔离板（12孔板，每孔2-4mL分离培养基），并在加湿的37°C培养箱中平衡，其中CO2为5%。 通过补充DMEM（Dulbecco的改性Eagle培养基，含有4.5g / L葡萄糖和丙酮酸钠）和20S（胎儿牛血清）和1%鸡胚提取物来制备肌纤维培养基，通过0.22μm过滤器过滤。在分离前约30分钟向预包衣培养板（24孔板）的每个孔中加入0.5mL培养基，并在加湿的37°C培养箱中平衡，其中CO为5%。 通过将0.2%（w / v）胶原酶1型（来自组织 溶解梭状芽胞杆菌）溶解在DMEM（Dulbecco的改性Eagle培养基，含有4.5g / L葡萄糖和丙酮酸钠）中来制备胶原酶消化溶液，通过0.22μm过滤器过滤。对于两个EDL（长指伸肌）肌肉，在无菌的15 mL反应管中使用2.5 mL胶原酶溶液。此外，在开始隔离之前，在37°C的循环水浴中预热溶液约10分钟。 准备无菌巴斯德移液器，用于胶原酶消化的肌肉的研磨。使用钻石笔切割巴斯德移液器。 对于每只小鼠，使用一个大孔径移液器，开口约0.3厘米，长度约10-12厘米，第二个玻璃移液器，小开口约0.1厘米，长度约22厘米（图2F）。 通过用本生燃烧器的火焰进行热抛光，使两个移液器的边缘变得光滑。轻轻移动，将移液器吸头放入火焰中5-10秒，以允许均匀的热量分布，直到锋利的玻璃边缘变得平滑。 使用前立即用无菌HS涂覆两种类型的玻璃移液器，在整个移液器中加入〜2mL HS5分钟，然后，弹出HS并让移液器在室温下干燥5分钟。 2. EDL肌肉分离和胶原酶消化 用70%乙醇喷洒所有设备，以避免污染。 按照国家动物实验规定牺牲小鼠。 用70%乙醇喷洒小鼠的后肢。使用硬化的细弯曲剪刀（24毫米切削刃）和细镊子（Dumont 7，弯曲或直）去除皮肤并暴露下面的肌肉。避免下层肌肉与皮毛接触（增加污染的风险）。 用细小弯曲的镊子去除周围的筋膜，而不会损坏下面的肌肉（图2A）。合上镊子以避免弯曲。 使用弯曲的镊子暴露TA（胫骨前）和EDL肌肉的远端肌腱。要去除TA，请用镊子抓住远端TA肌腱，并用精细的Vannas弹簧剪刀（5毫米切削刃，0.35毫米尖端直径）切割。当将TA保持在肌腱处时，将其拉向膝盖并切开靠近膝盖的肌肉（图2B），EDL肌肉现在暴露在外。注意：请确保在此步骤中仅抓住TA肌腱，否则下面的EDL可能会损坏。当切断TA肌肉时，请确保膝盖处的肌腱在之后可以很容易地看到。 用细弯曲的镊子抬起远端EDL肌腱，并用细Vannas弹簧剪刀切割（图2C）。通过小心地将EDL拉向膝盖来暴露近端EDL肌腱。用细的Vannas弹簧剪刀剪开近端肌腱。将EDL肌肉转移到步骤1.4的15mL反应管中预热的37°C的2.5mL胶原酶消化溶液中。（图2D）。注意：在外膝关节结缔组织做一个小切口，以完全暴露EDL肌腱近端。确保只抓住肌腱，不要过度拉伸EDL。 重复步骤 2.3。到 2.6.与第二个EDL。将两块EDL肌肉加入装有2.5 mL胶原酶消化溶液的同一15 mL反应管中。 将EDL肌肉在循环水浴中在37°C的反应管中孵育。注意：孵育时间取决于几个因素，例如胶原酶活性，小鼠年龄和纤维化组织的数量。成年小鼠（2-6个月大）的EDL肌肉的典型孵育时间为1-1.5小时，老年小鼠（18个月大）的典型孵育时间为1.5-2小时。 为避免肌肉过度消化，请在消化时间检查肌肉。当肌肉松弛并且可以看到单个肌纤维时停止消化（图2E）。用大口径移液管小心地将肌肉转移到含有肌纤维分离培养基的预热12孔板的第一孔（图2G）。 3. 肌纤维解离与培养 对于以下步骤，请使用立体双目显微镜，最好配备加热板（37°C）。使用大口径移液器用温隔离培养基冲洗肌肉，直到释放单个肌排纤维。用大口径移液器解离肌肉，直到所需数量的肌纤维在溶液中自由漂浮。注意：避免过度研磨，以降低肌纤维受损的风险。强烈建议使用加热板进行肌纤维解离，因为在分离过程中温度会下降，这将导致肌纤维死亡。 将带有HS涂层的小口径玻璃移液器的非收缩肌峰（图2H）转移到充满隔离介质的第二孔中，以洗去碎片和收缩（损坏的）肌峰（图2I）。注意：为避免孤立的肌纤维过度移动，可以将它们转移到第二个孔中，然后可以继续研磨过程。 将未收缩的肌纤维转移到下一个（第3个）充满隔离培养基的孔中再次洗涤。 使用涂有HS的小口径玻璃移液器将约50-100个非收缩肌力移植到含有肌纤维培养基的24孔板中。 在37°C，5%CO2 下孵育肌纤维，用于专用时间（建议最长96小时）。注意：μSCs在培养42小时后分裂一次平面或顶端基底。此外，在培养72小时后，MuSCs形成由自我更新，增殖或承诺（分化）MuSC组成的多细胞簇。 4. 硅核酸转染 肌纤维分离后4小时，用脂质转染试剂转染肌纤维相关MuSCs（在充满500μL培养基的24孔板的一个孔中转染50-100个非收缩肌奥夫体），例如根据制造商的方案，终浓度为5 pmol siRNA。因此，将25μLOpti-MEM和相应体积的siRNA加入到含有1.5μL转染试剂的25μL Opti-MEM中。孵育反应混合物5分钟，然后加入到500μL培养基中。注意：对于较长的培养期，例如超过48小时，建议在24小时或48小时后进行第二次转染。转染后无需更换培养基。 5. 固定和中频染色 对于免疫染色，请使用立体双目显微镜。以下步骤中的所有体积都调整到24孔板的一个孔中。使用HS涂层的小口径移液器执行所有以下步骤。 小心地丢弃肌纤维培养基，同时在孔中留下一些溶液（每24孔约100μL）。对于所有进一步的步骤，请执行此操作，除非另有说明以允许肌纤维漂浮。加入500μL2%PFA以将肌纤维与相邻的MuSC固定，在室温（RT）下孵育5分钟。 小心地除去上清液，并用PBS洗涤肌峰三次（pH 7.4，500μL，每次室温5分钟）。 加入500μL透化溶液（0.1%Triton X-100，PBS中0.1M甘氨酸，pH 7.4），在室温下孵育10分钟。 除去透化溶液，加入500μL封闭溶液（PBS中的5%HS，pH 7.4）在室温下1小时。注意：检查推荐的一抗封闭溶液，以避免非特异性结合。 除去封闭溶液，每孔加入300μL一抗稀释液（例如，抗Pax7（PAX7，DSHB，未稀释），抗MyoD（克隆G-1，Santa Cruz，1：200））。在4°C孵育过夜。 用每孔500μLPBS洗涤三次（室温5分钟）。 除去PBS，每孔加入300μL二抗稀释液（例如，抗小鼠IgG1-546和抗小鼠IgG2b-488 1：1000）。在避光室下孵育1小时。对于以下步骤，建议使用轻度减少条件。 用每孔500μLPBS洗涤两次（室温5分钟）。 通过在每孔使用500μL溶液（最终DAPI浓度10μg/ mL）在室温下进行5分钟进行DAPI染色。 用每孔500μLPBS洗涤两次（室温5分钟）。 使用疏水笔在微观载玻片上画一个圆圈，以形成防水屏障，防止含有肌纤维的液体溢出。将尽可能小体积的肌峰移送到显微载玻片上，并将它们分散在载玻片上。注意：避免在微观载玻片上物理拉动肌，因为这可能会导致摩擦，导致簇与肌纤维分离。 用小口径巴斯德移液器或200μL移液器除去残留液体。 使用两滴水性安装介质，并用盖玻片覆盖肌纤维。让载玻片在制造商建议的时间内干燥。将载玻片储存在4°C的黑暗中。