超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

注:すべての実験手順は、ノルウェー動物研究当局によって承認されました。プロトコルで使用された材料の詳細については、 資料表を参照してください。 1. マイクロバブルの製造 注:この研究では、目的のマイクロバブルは、タンパク質およびナノ粒子安定化マイクロバブルであり、生産プロトコルは以前に説明された28,33,48です。したがって、製造プロトコルは、ここで簡単にまとめました。 まず、ピペットを使用して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に0.5重量%のカゼインを含む超純水を混合し、蛍光色素の0.21重量%で標識されたナノ粒子の1重量%、NR668(改変ナイルレッド)を無菌ガラス圧着トップバイアル(10mL、直径2cm)に混合する。ポリマーナノ粒子は、Mørchらが述べたようにミニエマルジョン重合法を用いて作製する。38.注:ここでは、色素はナノ粒子放出の可視化を可能にするモデル薬として機能します。ナノ粒子溶液を使用する場合は、ラボコート、ゴーグル、手袋を着用してください。ナノ粒子溶液のこぼれを100%アセトンですぐに拭き取ります。 バイアルにゴムキャップをかぶり、わずかに混ぜ、室温で10分間超音波浴に入れ、可能な凝集体を排除します。ガラスバイアルの底から約0.5cmの攪拌機の先端を用いて分散工具を置きます。ガス容器に接続されたガラスピペットを使用して、溶液がわずかに泡立ち始めるまで、溶液を含むバイアルのヘッドスペースにパーフルオロプロパンガスを加えます。注:攪拌中にガラスバイアルの滑りを防ぐために、分散ツールのベースの周りにセルフシールフィルムをラップします。 分散工具を使用して、1935× g (3mmの回転半径で24,000 rpm)で溶液を4分間激しく攪拌します。ゴム製キャップでバイアルを閉め、バイアルを密封してさらに使用します。注:攪拌は液体中の気体を包み込む。マイクロバブルシェルは、アクティブなステップを必要とせずに、その後自己組み立てます。 過剰なカゼインとナノ粒子溶液を4°Cで保存し、100%アセトンで分散工具を洗浄します。 2. 単一の気泡をイメージング 共焦点顕微鏡 サンプル準備 単一のマイクロバブルを次のようにして、泡溶液を希釈します。通気針(19 G-21 G)を、セクション1に記載された手順に従って生成されるマイクロバブルを含むガラス圧着上部バイアルに入れます。大きな泡がバイアルのシールから離れるように、バイアルを逆さまにします。 バイアルが逆さまになっている間に、小さな(〜1 mL)の注射器の別の針先(19 G)をバイアルに挿入します。少量の気泡懸濁液を取り除き、次のステップでピペットを容易にするため、注射器の内容物を小さなチューブに移します。注:抽出する懸濁液の量は、気泡懸濁液の種類と濃度に依存します。この場合、0.2mLが抽出された。 ピペットを使用して、濾過されたPBSでマイクロバブル懸濁液(セクション1から)を希釈し、105 マイクロバブル/mL×約2×105 〜6の濃度を達成し、単一泡イメージングを可能にします。注意:気泡の種類によっては、気泡懸濁液を洗浄して蛍光染料を除去することをお勧めします。これは、蛍光色素がシェルに注入される気泡で特に重要です。泡を洗浄するには、気泡懸濁液を希釈し(例えば、 PBSの10mLで100μLの気泡溶液を取ることによって)、遠心分離機(通常は100× gの速度で)最後に、マイクロバブルを含む上清をピペットで除去し、さらなる分析を行います。残りの溶液は、遊離蛍光粒子を含み、廃棄することができる。洗浄工程は必要に応じて繰り返す必要があります。 混合物にグリセロールを加えると、培地の粘度が増加し、ブラウン運動によって引き起こされる動きが除去され、それ以外の場合はむしろ遅い共焦点Zスタックイメージングを妨げるであろう。注意:グリセロールの量は、画像化される気泡の種類によって異なります(ここでは、〜50%)。気泡の一部のタイプ, グリセロールは、安定性に悪影響を持っている可能性があります 49.しかし、共焦点像の下では約30分の気泡には顕著な変化は認められなかった。さらに、グリセロールはマイクロバブルの音響応答を変化させる可能性があるため、マイクロバブルが起きていないイメージング法でのみ使用できます。 マイクロバブル懸濁液を薄い壁のあるチャンバーに入れ、チャネルスライドなどの最適なイメージングを行います。 イメージングプロトコル 共焦点顕微鏡のスイッチを入れ、共焦点顕微鏡で使用する適切な目的と目的のレーザーとスキャナーを選択します。注:ここでは、0.08 μm/ピクセルの解像度に60倍の水浸し目標を使用し、バブルサイズに応じて、256 x 256ピクセルまたは128 x 128ピクセルの領域を画像化します。これらの特定の実験では、488 nmレーザーとガルヴァーノスキャナを使用します。発光波長は蛍光色素に依存し、一般的にブロードバンドです。 明視野でマイクロバブルを見つけ、共焦点顕微鏡に切り替えます。共焦点顕微鏡がスキャンする間に、目的の上面と底面を設定します。Zスタックを取得して3D構造を観察します。Z 方向に 100 nm のステップ サイズを使用します。 明視野顕微鏡光学系の組み立て注: 明視野顕微鏡の設定の概略図を 図 3A に示します。邪魔されない超音波の伝播を確実にするために、水浴は2つの開口部を含んでいる:光源のための1つと超音波トランスデューサーのための1つ。光学系は(モジュラー)顕微鏡、高速カメラ、および一致する光学装置から成っている。マイクロバブル振動の周期は、通常、1 μs(1 MHz超音波を使用)の順序であるため、カメラは少なくとも毎秒500万フレームのフレームレートで記録するように設定する必要があります。ここでは、カメラは、高調波を含むバブルダイナミクスのすべての詳細をキャプチャするために、毎秒1000万フレーム(256 x 400ピクセル)で256フレーム(256×400ピクセル)で記録するように設定されます。 適切な倍率、作動距離、NAを顕微鏡に取り付けて、水浸漬目的を取り付けます。注:水の浸漬目的は、水の徐々に蒸発にもかかわらず、安定した作業距離を提供するために使用されました。ここでは、60倍の倍率で水浸出目的、2mmの作動距離、および1のNAを選択した。 照明には最低 1 kW のピーク出力を持つストロボライトを使用し、顕微鏡とカメラの間のチューブレンズを使用して、できるだけ少ない周囲光が高速カメラのセンサーに到達するようにします。 単一のマイクロバブルに焦点を当て、リアルタイムイメージング用の光学および音響システムのアライメントを行う場合は、調光可能なハロゲン光源を使用します。 音響システムの組み立て プログラム可能な任意波形発生器とパワーアンプ(56dBゲイン)を使用して、滑らかなエンベロープと波形でトランスデューサを駆動します。オシロスコープを任意波形発生器に接続して信号を確認します。パーソナルコンピュータを任意波形発生器に接続し、社内で書かれたスクリプトを使用して、受信する音響圧力波をプログラムします。 パルス/遅延発生器をマスタートリガとして使用し、光システムと音響システムを同期させます。パルス/遅延発生器とカメラソフトウェアにトリガ遅延を設定し、超音波波が気泡に到達できるように、超音波伝送後に16 μsの記録が開始されるようにします。記録開始前に光源を1.5 μsトリガーし、バブル振動中の適切な照明を確保します(タイミング図については 図3B を参照)。 適切な中心周波数を持つ適切なトランスデューサを選択します。水浴の開口部に置き、試料ホルダー膜からの反射を最小限に抑え、立ち波形成を低減するために、光軸に対する角度になるように配置する。注:ここでは、2.25MHzの中心周波数を有する単一要素の集光型浸入変換器、焦点距離1″、および0.75″の要素直径を、光軸に対して35°の角度で配置しました。伝達機能の較正は、音響システムで使用されているのと同じアンプを使用して行う必要があります。超音波送信周波数の関数として光ファイバーハイドロフォンを使用してトランスデューサの電圧振幅から圧力振幅への転送関数を較正する。 サンプルホルダーの選択 光学的および音響的に透明な膜を備えたサンプルホルダーと、同じサンプル内の複数の単一のマイクロバブルのイメージングを可能にする大きさの大きさを使用します。注:ここでは、体積10mL、膜領域25cm2、膜厚175μmの細胞培養カセットを使用しました。下膜の音響反射、顕微鏡の目的と上膜によって反射された波からの干渉により、その場合の音響圧力は任意の波形発生器でプログラムされるものとは異なる場合があります。サンプルホルダー膜に対して角度でトランスデューサーを配置すると、立ち波形成が減少しますが、膜からの反射を増加させることができます。 サンプルを完全に沈め、トランスデューサと顕微鏡の目的の両方の焦点内に持ち込むことができることを確認してください。3Dマイクロポジションステージに取り付けられたアルミニウム・サポートを使用して、サンプルホルダーを独立して移動します。 光学系と音響システムのアライメント 3D 変換でセットアップを調整するには、水浴を XY 変換ステージに取り付け、実験中に移動しないように、ステージを光学表に取り付けます。その後、水浴に水を満たし、調光可能なハロゲン光源をオンにします。アライメント中に、顕微鏡の目的を側面に移動して、超音波反射を防止します。 サンプルホルダーアームにニードルハイドロフォン(0.2mm)を取り付け、目的の視野に先端を置いて水浴に針ハイドロフォンを置きます。アンプと任意の波形発生器をオンにします。5~10回の超音波サイクルの単一パルスと15Hzのパルス繰り返し周波数を使用します。最大圧力振幅に達するまで、タンクをXY方向に、針をZ方向に移動します。 マイクロスコープの焦点を合わせて、ハイドロフォンの先端に再び焦点を合わせます。注:このプロトコルは顕微鏡焦点とトランスデューサの焦点の間の位置合わせを保障する。位置合わせ後に顕微鏡とトランスデューサの位置を変更しないでください。 サンプル準備 サンプルソリューションを準備するために、ステップ2.1.1.1から2.1.1.3を繰り返します。バブル溶液を希釈してシングルバブルイメージングを可能にし、隣接する気泡の音響相互作用を排除します。 サンプルホルダーの出口を開きます。シリンジを使用して、サンプル溶液を完全に充填するまでサンプルホルダーの他の開口部に注入します。超音波分野との不要な相互作用を防ぐために、サンプルホルダーの内側に気泡がないことを確認してください。 サンプルホルダの両方のバルブを閉じ、サンプルホルダーを光軸に垂直に配置します。注:充填されたサンプルホルダーレベルを保ち、移動中に泡がサンプルホルダーの片側に移動するのを防ぎます。 イメージングプロトコル 前述の社内書き込みスクリプトを介して任意波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧力をプログラムします。注:ここでは、音響圧力波は、8サイクルガウステーパーパルスで、40サイクルの単一のバーストでした。これらの実験で使用された超音波周波数は、1MHz、2MHz、または3MHzで、81kPaから1200kPaまでの音響圧振幅を有する。 顕微鏡の焦点に単一のマイクロバブルを見つけるために、XYZステージを使用してサンプル溶液を含むサンプルホルダーを移動します。サンプルホルダーの隅にある視野から始めて、マイクロバブルの端がはっきりと見え、焦点を合わせられるようにします(理想的なカメラビューの 場合は図3C を参照)。 以前ハロゲン光に接続されていた光ファイバの端部をストロボライトに取り付け、もう一方の端が水浴に接続されるようにします。録音をトリガーします。 ステップ 2.2.6.2 ~ 2.2.6.3 を超音波設定ごとに必要な回数だけ繰り返し(周波数と音響圧力)、マイクロバブルを含む細胞培養カセットを前の場所から少なくとも 2 mm (焦点面) から移動して、これまでの実験で視野のマイクロバブルが不変にならないようにします。注:ここでは、各実験を~20回繰り返しました。サンプルホルダ全体がゾンフィスされたら、サンプルホルダーを空にし、その後の実験のために新鮮なサンプル溶液で補充します。 データ分析 プログラミング環境を採用し、研究課題に応じたデータ解析を行い、画像処理後にエッジ検出を行います。画像領域の特性を測定する関数を使用して、各気泡の周囲のバブルの中心と強度プロファイルの導体を見つけ、気泡の輪郭(したがって、気泡半径 R)を検出する。単一のマイクロバブルの時間の経過とともに半径から関連するパラメータを抽出します。注: 本研究では、単一のマイクロバブルの記録を二項化およびフィルタリングするための画像処理にプログラミング環境が使用されました。社内スクリプトを使用して、各バブルの周囲の強度プロファイルの微分を見つけます。 蛍光顕微鏡光学系の組み立て 2.2節で説明する明視野顕微鏡で使用されているのと同じベースで、蛍光顕微鏡のセットアップ(図4A)を構築します。注: セクション 2.3 で説明されているセットアップは、セクション 2.2 で明視野顕微鏡で説明されている設定と組み合わせることができます。蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡の両方を組み合わせることで、ナノ粒子放出をイメージングしながらマイクロバブルガスコアを可視化することができます。 128 フレーム (256 μs) の場合、高速カメラを秒あたり 500,000 フレーム (400 x 250 ピクセル) で録画するように設定します。注:光強度は蛍光で制限されており、粒子送達が発生するタイムスケールが気泡ダイナミクスよりも長いため、イメージング時間は明視野実験よりも長くなります。 十分な光を供給するのに十分な高いパワーを持つレーザーを選択し、適切な励起波長を有し、サンプルの漂白を避けるためにアクロス視変調器と結合されていることを確認します。注:この研究では、532nmの励起波長を有する5W連続波レーザーを使用して、ナノ粒子の蛍光を励起した。 レーザーと顕微鏡の目的との間にビームスプリッター、二色性ミラーおよびノッチフィルターを配置し、蛍光放射をカメラに到達させながら、励起光をサンプルに向けます。 音響システムの組み立て マイクロバブルを起こすためには、セクション 2.2.2 と同じ音響セットアップを使用します。これらの特定の実験でトランスデューサを単一要素に変更し、中心周波数2.25MHzの集焦点浸変換器、焦点距離1.88″、および要素直径1″に変更します。光軸に対して35°の角度で配置して、サンプルホルダー膜からの反射を最小限に抑え、定在波形成を低減します。 光学系と音響システムのアライメント セクション 2.2.4 で説明されている手順を繰り返します。 サンプル準備 セクション 2.2.5 で説明されているようにサンプル ソリューションを準備します。 イメージングプロトコル 前述の社内書き込みスクリプトを介して任意波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧振幅を設定します。注:ここでは、音響圧力波は、10サイクルのガウステーパーパルスを備えた140サイクルの超音波の単一のバーストとしてプログラムされました。一般に、バブルダイナミクスの研究に必要なものと比較して、バイオ効果を誘導するためには、より長いパルス持続時間が必要です。これらの実験で使用された超音波周波数は、1MHz、2MHz、または3MHzで、81kPaから1200kPaまでの音響圧振幅を有する。 パルス/遅延発生器で、記録中のマイクロバブルからのナノ粒子の蛍光励起用のレーザーのトリガ遅延を設定します。注:これらの特定の実験では、トリガ遅延は20 μs~170 μsで、合計150 μsの時間でした。タイミング図を 図4Bに示します。 顕微鏡の焦点に単一のマイクロバブルを見つけるために、XYZステージを使用してサンプル溶液を含むサンプルホルダーを移動します。サンプルホルダーの角の視野から始めます。マイクロバブルのインターフェースがはっきりと見え、焦点を合わせている理想的なカメラビューについては、 図4C を参照してください。録音をトリガーします。 ステップ2.3.5.3を超音波設定ごとに所望の回数だけ繰り返し(周波数および音響圧力)、マイクロバブルを含む細胞培養カセットを以前の位置から少なくとも2mm(光学面)から移動させ、これまでの実験で視野内のマイクロバブルが超音波処理されないようにする。注:この研究では、各実験を~10~20倍に繰り返しました。サンプルホルダ全体がゾンフィスされたら、サンプルホルダーを空にし、その後の実験のために新鮮なサンプル溶液で補充します。実験の間にサンプルホルダを移動する距離は、音響ビームサイズによって異なります。 データ分析 研究課題に従って蛍光顕微鏡記録を分析します。マイクロバブルごとに、蛍光顕微鏡実験でナノ粒子の送達が起こったかどうかを視覚的に判断する。ガスコアからサンプルホルダー膜へのナノ粒子の剥離および堆積が単一のマイクロバブルに対して観察された場合、プログラミング環境で発生したその送達を手動で入力する。 3. 生体内顕微鏡 下皮折り窓室手術(前に説明した26,47,50) 窓チャンバーを配置する前に1週間動物を順応させます。雌マウスと雄マウスの両方を使用することができ、年齢は重要ではないが、マウスの体重が少なくとも22〜24gであることを確認して、皮膚が十分に柔軟になるようにする。 術中および術後鎮痛治療を用いて全身麻酔下で手術を行う。フェンタニル(0.05 mg/kg)/メデトミジン(0.5mg/kg)/ミダゾラム(5mg/kg)/水(2:1:2:5)の皮下注射で動物を10g重量当たり0.1mLの用量で麻酔する。動物の体温を維持するために加熱パッドまたは加熱ランプを使用してください。 皮膚が窓チャンバーの2つの対称的なポリオキシメチレンフレームの間に挟まれるように、動物の背中の皮膚の二重層を優しく引っ張ります。二重皮層を通って伸びる2つのねじを置き、部屋の上端に沿って縫合することによってチャンバーを固定する。 皮膚の片側のチャンバーの円形フレーム内の皮膚を取り除きます。皮膚を取り除くフレーム内に直径11.8mmのカバーガラスを置き、組織に窓を形成します。 麻酔を終了させる解毒剤として、10gあたり0.1 mLの用量で、アトペマゾール(2.5mg/kg)、フルマゼニル(0.5mg/kg)、水(1:1:8)の皮下注射を使用してください。一晩加熱回収ラックに動物を置きます。25 mg/mL のエンロフロキサシンで動物の水を補い、外科現場での感染を防ぎます。 腫瘍モデル作成 癌細胞を37°Cで、適切な培養培地中の5%のCO2 雰囲気で、10%のウシ胎児血清と100U/mLペニシリンと100mg/mLストレプトマイシンを補充します。注:ヒト骨肉腫(OHS)細胞株はこのプロトコルで使用されましたが、他の細胞株も使用することができます。 ステップ3.1.5の翌日に、イオフルラン(誘導時に5%、メンテナンス中に1〜2%)で動物を数分間麻酔する。カバーガラスを取り外し、30μLの細胞培養培地に5×106 個のがん細胞を塗布し、カバーガラスを交換します。 腫瘍をイメージング前に2週間増殖させ、この期間中に週に少なくとも3回、動物の体重と健康状態をモニタリングする。 光学系の組み立て 超音波治療中に(前の研究26で説明したように)、懸害のある研究課題に応じて適切な顕微鏡と目的で、生体内イメージングを行います。実験用セットアップの概略図については 、図 5A を参照してください。注:この特定の実験のために、20x水浸しの目的(1.0のNAおよび2mmの作動距離)および脈打つレーザーを装備した多光子顕微鏡が使用された。画像は、400 x 400 μm2の視野を持つ31フレーム/秒(512 x 512ピクセル)で共振スキャンモードで取得されました。励起波長は790nmであった。2つのガリウムヒ素リン化検出器の前のフィルターは、蛍光の検出のために590nmのロングパス590nmおよびバンドパス525/50nmであった。 音響システムの組み立て 適切な超音波トランスデューサを導波管(カスタムメイド)に取り付け、光軸に対して45°の角度で目標の下に配置し、下面皮折り窓室のカバーガラスからの反射を最小限に抑え、立ち波形成を低減します。導波管に蒸留水と脱気水を入れます。導波管の上に超音波カップリングゲルを塗布します。 光学系と音響システムのアライメント 超音波の焦点に光軸を合わせます。目的の焦点に光ファイバーハイドロフォンを配置します。次に、アンプと任意波形発生器をオンにして、パルス繰り返し周波数100Hzの短いバースト(5〜10サイクル)でトランスデューサを励起し、オシロスコープのハイドロフォン信号で最高圧が検出された位置に超音波トランスデューサを移動します。メモ:位置合わせ後にトランスデューサの位置を変更しないでください。 イメージングプロトコル 導波管と目的の間のXY位置決め段階に接続された加熱された動物のホルダー(カスタム設計)を置き、さらにカップリングゲルを加えます。動物を麻酔し、尾静脈カテーテルを置きます。加熱されたホルダーにマウスを置き、ホルダーに窓チャンバーを固定します。窓の部屋のカバースリップの上に水滴を加え、腫瘍組織をイメージするために目的を所定の位置に動かします。 図5B は、事象の順序を示す実験のタイミング図を示す。蛍光標識された2 MDaデキストランを静脈内(30μL、生理食塩水で希釈した4mg/mL)を注入して血管構造を可視化し、XY翻訳段階を使用してマウスを動かし、適切な血管を持つ位置を見つけます。超音波治療の前にベースライン画像を記録します。画像化する顕微鏡や染料の詳細や研究課題に応じて、フレームレート、視野、記録の長さを調整します。注:これらの実験では、400 x 400 μm2の視野で毎秒31フレームを記録し、5分間連続的にイメージングを行いました。 任意の波形発生器に所望の超音波駆動周波数、パルス長、音響圧振幅を設定します。注:これらの実験では、1MHzの周波数を使用し、パルス長は10 ms、陰圧振幅は0.2 MPa~0.8 MPaの間で使用されました。0.5 Hzまたは0.1 Hzのパルス繰り返し周波数を使用して、新しいマイクロバブルが超音波パルス間の処理領域に再浸透することを可能にしました。 50 μL マイクロバブル(2 × 108 ~5 × 108 マイクロバブル/mL)を静脈内に注入し、26に記載されているように、イメージング中に超音波を適用します。 データ分析 研究課題に応じて、(オープンソース)画像処理ソフトとプログラミング環境を用いて画像を分析し、in26で述べ、血管パラメータ(直径、分岐、流速、方向)、血管内のナノ粒子の蓄積、および運動およびデキストランおよびナノ粒子の腫瘍組織への外挿の深さなどを決定する。