Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Caenorhabiditis elegans es ampliamente reconocido como un modelo sobresaliente en neurociencia basado en que tiene 302 neuronas que coordinan todos los comportamientos de los gusanos, incluido el apareamiento, la alimentación, la puesta de huevos, la defecación, la natación y la locomoción en medios sólidos¹. Estos nematodos hermafroditas también se utilizan ampliamente para comprender una amplia gama de mecanismos de enfermedades humanas, lo que es posible gracias a su genoma bien caracterizado y su alta homología de ~ 80% de genes entre C. elegans y humanos^2,3,4. C. elegans se ha utilizado durante mucho tiempo para interrogar la enfermedad mitocondrial humana^{5,6,7,8,9,10,}que es un grupo altamente heterogéneo genética y fenotípicamente heterogéneo de trastornos metabólicos hereditarios que comparten una capacidad deteriorada para generar energía celular y, a menudo, clínicamente presentes con una función neuromuscular sustancialmente deteriorada, intolerancia al ejercicio y fatiga^{11 ,12,13,14}. Con este fin, el uso de modelos de C. elegans permite el modelado preclínico de aspectos cuantitativos de la actividad animal y la función neuromuscular en diferentes subtipos genéticos de enfermedad mitocondrial, así como su respuesta a terapias candidatas que pueden mejorar su función neuromuscular y actividad general.

La actividad neuromuscular en C. elegans es objetivamente medible por una serie de metodologías experimentales, incluyendo enfoques manuales y semiautomatizados que permiten análisis funcionales en medios sólidos o líquidos(Tabla 1)^1,15. La cuantificación precisa de la actividad de C. elegans ha demostrado ser importante para permitir descubrimientos relacionados con la función y el desarrollo del sistema muscular y nervioso^16,17,18. Este estudio resume y compara los requisitos experimentales, las ventajas y las limitaciones de 17 ensayos diferentes que se pueden realizar en laboratorios de investigación para evaluar la función y la actividad neuromuscular en cuatro resultados clave en modelos de enfermedades por C. elegans, tanto al inicio en un rango de etapas y edades de desarrollo como en respuesta a terapias candidatas (Tabla 1 ). De hecho, el estudio proporciona una visión detallada de la gama de enfoques experimentales disponibles para caracterizar las tasas de golpeo de C. elegans (curvas corporales por minuto), la actividad locomotora, el bombeo faríngeo y la quimiotaxis, en cada caso especificando la metodología experimental y analítica utilizada, las ventajas y limitaciones de cada método, el equipo y el software necesarios para realizar y analizar cada ensayo, y la capacidad de rendimiento de cada método para apoyar su uso con fines de detección genética o de drogas de alto rendimiento. La capacidad de rendimiento de cada ensayo se describe como baja, media o alta en función de la complejidad del protocolo experimental, incluido el mantenimiento del gusano, el tiempo de procesamiento, el uso de placas de uno o varios pozos y / o el tiempo del experimentador necesario para completar el entorno experimental y los análisis de datos.

Los análisis manuales de thrashing^19,actividad locomotora^20,bombeo faríngeo^17,21y quimiotaxis^{22, 23} son metodologías bien establecidas para evaluar la actividad de los gusanos que requieren un estereomicroscopio²⁴. Mientras que la medición de la actividad de los gusanos requiere un análisis en medios líquidos para determinar la frecuencia de las curvas del cuerpo por minuto, la actividad locomotora del gusano se puede medir en medios sólidos o en medios líquidos. Sin embargo, los análisis manuales de la actividad individual del gusano son intrínsecamente lentos e implican un sesgo inevitable generado por el usuario. La automatización de los análisis de actividad de gusanos minimiza el sesgo generado por el usuario y puede aumentar en gran medida el rendimiento experimental²⁵. Las grabaciones de video de la actividad de golpeo de gusanos en medios líquidos se pueden analizar utilizando wrMTrck, un complemento de ImageJ²⁶. Sin embargo, la configuración experimental original que se desarrolló para wrMTrck limitó su utilidad, ya que demasiados gusanos en una sola gota líquida llevaron a la superposición de gusanos que dificultaron el seguimiento preciso. Si bien esta limitación experimental se ha resuelto²⁷, el método wrMTrck no es capaz de soportar la detección de alto rendimiento.

Existe una variedad de métodos para cuantificar la actividad locomotora del gusano al inicio y en respuesta a las terapias candidatas en modelos de enfermedad mitocondrial de C. elegans. Estos incluyen ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker^28,amplia plataforma de seguimiento de nematodos de campo de visión (WF-NTP)^29,WormMotel, WormWatcher^30,WormLab^31,Infinity Chip³²y WMicrotracker One³³ (Tabla 1). Estos métodos permiten el análisis simultáneo de la locomoción en múltiples cepas o condiciones de gusanos, generalmente en placas de múltiples pozos, lo que respalda aplicaciones de detección de fármacos de mayor rendimiento. Algunos de estos métodos tienen consideraciones únicas que pueden limitar o mejorar su utilidad general, como la necesidad de equipos costosos en comparación con el software de acceso abierto, y la facilidad variable de realizar protocolos experimentales. En general, ningún sistema o protocolo experimental es ideal para todos los experimentos de actividad locomotora de C. elegans. Más bien, es importante elegir cuidadosamente qué método se adapta mejor a los objetivos y requisitos experimentales del investigador específico.

El bombeo faríngeo representa otro resultado importante para evaluar la actividad neuromuscular en C. elegans. La faringe de C. elegans está compuesta por 20 células musculares, 20 neuronas y otras 20 células que permiten la ingestión de Escherichia coli (E. coli)en el extremo anterior del tracto alimentario del gusano^34,35,36. Se han establecido varios métodos manuales para determinar las tasas de bombeo faríngeo^17,21,37,38. La mayoría de los métodos se basan en el uso de un estereomicroscopio y una cámara para visualizar y registrar la frecuencia de bombeo faríngeo con conteo directo por el observador experimental²¹. El análisis automatizado de la velocidad de bombeo faríngeo es posible mediante la realización de un registro extracelular denominado electrofaringigograma (EPG), que proporciona información adicional sobre la duración de cada bomba³⁹. El análisis de la velocidad de bombeo faríngeo también es posible en un sistema microfluídico, WormSpa, donde los gusanos individuales están confinados en cámaras^40,41. Un método comercial disponible para facilitar el análisis de la tasa de bombeo faríngeo es el sistema ScreenChip (InVivo Biosystems), que mide, visualiza y analiza los aspectos neuromusculares del comportamiento de alimentación en un solo gusano que se inmoviliza en un chip personalizado. Este enfoque de cuantificación del bombeo faríngeo se puede utilizar para evaluar las respuestas neuronales y fisiológicas a los fármacos, el envejecimiento y otros factores^42,43,44,45.

La quimiotaxis describe el movimiento de C. elegans en respuesta a un odorante colocado lejos de los gusanos en un área definida de la placa de medios de crecimiento de nematodos (NGM). La evaluación de la respuesta de quimiotaxis proporciona una medida integrada de la actividad neuronal y neuromuscular del gusano que es cuantificable al observar y medir la distancia física recorrida por los gusanos hacia el odorante en un período de tiempo definido⁴⁶. El Multi-Worm Tracker es un método automático que se puede utilizar para mejorar la eficiencia experimental de cuantificar la distancia recorrida por los gusanos hacia un atrayente o desde un repelente⁴⁷.

Aquí, se describe el protocolo detallado para dos métodos novedosos y semiautomatizados establecidos para cuantificar la actividad del gusano. El primer enfoque utiliza ZebraLab, un software comercial que se desarrolló originalmente para estudiar la actividad de natación de Danio rerio (pez cebra), para una nueva aplicación de rendimiento medio para cuantificar la actividad locomotora general en medios líquidos de C. elegans en función de los cambios de píxeles durante el movimiento(Tabla 1, Figura 1). La salida de datos se obtiene rápidamente de un gran número de condiciones concurrentes y muestras analizadas en un portaobjetos de vidrio, aunque este método no es adecuado para un formato de placa de múltiples pozos. El segundo enfoque es una adaptación novedosa de la metodología WormScan^48,49 (Figura 2), que utiliza un escáner de cama plana para crear una imagen diferencial de dos escaneos secuenciales que se pueden usar de manera variable con software de código abierto para permitir el análisis cuantitativo semiautomatizado de resultados fisiológicos integrados como la fecundidad y la supervivencia. Aquí, se desarrolló una nueva adaptación de alto rendimiento de la metodología WormScan para cuantificar la actividad locomotora del gusano en medios líquidos en poblaciones de quince gusanos larvales en etapa 4 (L4) por pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos. Esta metodología WormScan semiautomatizada y de bajo costo se puede adaptar fácilmente a las pruebas de detección de medicamentos de alto rendimiento, así como a los análisis de varias etapas animales y edades^{de 48,49}.

Aquí, el protocolo y la eficacia del análisis de la actividad locomotora de C. elegans utilizando los métodos semiautomatizados ZebraLab y WormScan se demuestran en un modelo bien establecido de C. elegans para la enfermedad mitocondrial del complejo I, gas-1(fc21). gas-1 (gen K09A9.5) es un ortólogo del NDUFS2 humano (NADH: núcleo de ubiquinona oxidorreductasa (proteína hierro-azufre) subunidad 2)(Figura 3). La cepa mutante C. elegans gas-1(fc21)porta una mutación homocigota p.R290K sin sentido en el ortólogo humano de NDUFS2^50,causando una disminución significativa de la fecundidad y la vida útil, deterioro de la capacidad de fosforilación oxidativa de la cadena respiratoria (OXPHOS)^51,así como disminución de la masa mitocondrial y el potencial de membrana con aumento del estrés oxidativo^5,8 . A pesar de su uso bien establecido en las últimas dos décadas para estudiar la enfermedad mitocondrial, la actividad locomotora de los mutantes gas-1(fc21)no se informó previamente. Aquí, los métodos ZebraLab y WormScan se aplicaron para cuantificar de forma independiente la actividad locomotora del gas-1(fc21)en comparación con los gusanos de tipo salvaje (WT, N2 Bristol), tanto como una forma de validar los métodos como para demostrar su utilidad comparativa y eficiencia de los protocolos experimentales y los análisis informáticos. El software ZebraLab permitió la cuantificación rápida de varias condiciones concurrentes de actividad locomotora del gusano en modelos de enfermedad mitocondrial de C. elegans, con aplicación potencial para estudios dirigidos de detección o validación de fármacos. El análisis de WormScan, en particular, es adecuado para permitir fácilmente cribado farmacológico de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos y priorizar los cables que mejoran la función neuromuscular animal y la actividad locomotora en modelos preclínicos de C. elegans de enfermedad mitocondrial primaria.