Сравнительный анализ экспериментальных методов количественной оценки активности животных в моделях митохондриальной болезни Caenorhabditis elegans

Caenorhabiditis elegans широко признана как выдающаяся модель в нейробиологии, основанная на том, что она имеет 302 нейрона, которые координируют все поведение червей, включая спаривание, кормление, яйцекладку, дефекацию, плавание и передвижение на твердых носителях^1. Эти гермафродитные нематоды также широко используются для понимания широкого спектра механизмов заболеваний человека, что стало возможным благодаря его хорошо охарактеризованным геному и высокой гомологии ~ 80% генов между C. elegans и людьми^2,3,4. C. elegans уже давно используются для опроса митохондриальныхзаболеваний человека^{5,6,7,8,9,10,}которые представляют собой высоко генетически и фенотипически гетерогенную группу наследственных метаболических нарушений, которые имеют нарушенную способность генерировать клеточную энергию и часто клинически присутствуют с существенно нарушенной нервно-мышечной функцией, непереносимостью физических упражнений и усталостью^{11 ,12,13,14}. С этой целью использование моделей C. elegans позволяет доклиническое моделирование количественных аспектов активности животных и нервно-мышечной функции у различных генетических подтипов митохондриальных заболеваний, а также их реакции на кандидаты в терапии, которые могут улучшить их нервно-мышечную функцию и общую активность.

Нервно-мышечная активность у C. elegans объективно измерима с помощью ряда экспериментальных методологий, включая как ручные, так и полуавтоматические подходы, позволяющие проводить функциональный анализ в твердых или жидких средах(таблица 1)^1,15. Точное количественное значение активности C. elegans оказалось важным для открытия, связанных с функцией и развитием мышечной и нервной системы^16,17,18. В этом исследовании обобщены и сопоставлены экспериментальные требования, преимущества и ограничения 17 различных анализов, которые могут быть выполнены в исследовательских лабораториях для оценки нервно-мышечной функции и активности по четырем ключевым исходам в моделях заболеваний C. elegans, как на исходном уровне на различных стадиях развития и возраста, так и в ответ на кандидаты в терапию(таблица 1). ). Действительно, исследование дает подробный обзор диапазона доступных экспериментальных подходов к характеристике скорости метания C. elegans (изгибы тела в минуту), двигательной активности, накачки глотки и хемотаксиса – в каждом случае с указанием используемой экспериментальной и аналитической методологии, преимуществ и ограничений каждого метода, оборудования и программного обеспечения, необходимого для выполнения и анализа каждого анализа, и пропускная способность каждого метода поддерживать его использование для высокопроизводительного генетического скрининга или скрининга лекарств. Пропускная способность каждого анализа описывается как низкая, средняя или высокая на основе сложности экспериментального протокола, включая обслуживание червя, время обработки, использование одно- или многоядерных пластин и/или время экспериментатора, необходимое для завершения экспериментальной установки и анализа данных.

Ручной анализ трешинга^19,двигательной активности^20,глоточного насоса^17,21и хемотаксиса^{22, 23} являются хорошо заявильными методологиями оценки активности червей, которые требуют стереомикроскопа^24. В то время как измерение метательной активности червей требует анализа в жидких средах для определения частоты изгибов тела в минуту, двигательная активность червя может быть измерена как на твердых средах, так и в жидких средах. Тем не менее, ручной анализ активности отдельных червей по своей сути отнимает много времени и включает в себя неизбежную предвзятость, создаваемую пользователем. Автоматизация анализа активности червей минимизирует предвзятость, генерируемую пользователем, и может значительно увеличить экспериментальную пропускную способность^25. Видеозаписи активности метания червей в жидких средах могут быть проанализированы с помощью wrMTrck, плагина ImageJ^26. Однако первоначальные экспериментальные установки, которые были разработаны для wrMTrck, ограничивали его полезность, поскольку слишком много червей в одной капле жидкости приводило к перекрытию червей, что затруднялось точное отслеживание. Хотя это экспериментальное ограничение было разрешено^27,метод wrMTrck не способен поддерживать высокопроизводительный скрининг.

Существует ряд методов количественной оценки локомоторной активности червей на исходном уровне и в ответ на кандидаты в терапию в моделях митохондриальных заболеваний C. elegans. К ним относятся ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker^28,платформа отслеживания нематод с широким полем зрения (WF-NTP)^29,WormMotel, WormWatcher^30,WormLab^31,Infinity Chip³²и WMicrotracker One³³ (таблица 1). Эти методы позволяют одновременно анализировать локомоцию в нескольких штаммах или условиях червей, как правило, на пластинах с несколькими скважинами, тем самым поддерживая более высокопроизводительный скрининг лекарств. Некоторые из этих методов имеют уникальные соображения, которые могут ограничить или повысить их общую полезность, такие как потребность в дорогостоящем оборудовании по сравнению с программным обеспечением открытого доступа и различная простота выполнения экспериментальных протоколов. В целом, ни одна экспериментальная система или протокол не идеально подходит для всех экспериментов с двигательной активностью C. elegans. Скорее, важно тщательно выбирать, какой метод лучше всего подходит для экспериментальных целей и требований конкретного исследователя.

Глоточная накачка представляет собой еще один важный результат для оценки нервно-мышечной активности у C. elegans. Глотка C. elegans состоит из 20 мышечных клеток, 20 нейронов и 20 других клеток, которые позволяют проглатывать кишечную палочку (E. coli)на переднем конце пищеварительного тракта червя^34,35,36. Было установлено несколько ручных методов для определения скорости глотки откачки^17,21,37,38. Большинство методов основаны на использовании стереомикроскопа и камеры для визуализации и записи частоты накачки глотки с прямым подсчетом экспериментальным наблюдателем^21. Автоматизированный анализ скорости накачки глотки возможен путем выполнения внеклеточной записи, названной электрофарингеограммой (EPG), которая предоставляет дополнительную информацию о продолжительности каждого насоса^39. Анализ скорости накачки глотки также возможен в микрофлюидной системе WormSpa, где отдельные черви заключены в камеры^40,41. Коммерческим методом, доступным для облегчения анализа скорости глоточного насоса, является система ScreenChip (InVivo Biosystems), которая измеряет, визуализирует и анализирует нервно-мышечные аспекты пищевого поведения у одного червя, который иммобилизован в пользовательском чипе. Этот подход к количественному накачке глотки может быть использован для оценки как нейронных, так и физиологических реакций на лекарства, старение и другие факторы^42,43,44,45.

Хемотаксис описывает движение C. elegans в ответ на одорант, помещенный от червей в определенную область пластины среды роста нематод (NGM). Оценка реакции хемотаксиса обеспечивает интегрированную меру нейронной и нервно-мышечной активности червя, которая поддается количественной оценке путем наблюдения и измерения физического расстояния, пройденного червями к одоранту за определенный период^{времени 46.} Multi-Worm Tracker – это автоматический метод, который может быть использован для повышения экспериментальной эффективности количественной оценки расстояния, пройденное червями к аттрактанту или от репеллента^47.

Здесь описан подробный протокол для двух новых, полуавтоматических методов, созданных для количественной оценки активности червей. Первый подход использует ZebraLab – коммерческое программное обеспечение, которое было первоначально разработано для изучения плавательной активности Danio rerio (рыбки данио), для нового приложения со средней пропускной способностью для количественной оценки общей локомоторной активности в жидких средах C. elegans на основе изменений пикселей во время движения(таблица 1, рисунок 1). Вывод данных быстро получается из большого количества параллельных условий и образцов, проанализированных на стеклянной горке, хотя этот метод не подходит для формата пластины с несколькими скважинами. Второй подход представляет собой новую адаптацию методологии WormScan^48,49 (рисунок 2),которая использует планшетный сканер для создания дифференциального изображения двух последовательных сканирований, которые могут по-разному использоваться с программным обеспечением с открытым исходным кодом для обеспечения полуавтоматического количественного анализа интегрированных физиологических результатов, таких как плодовитость и выживаемость. Здесь была разработана новая высокопроизводительная адаптация методологии WormScan для количественной оценки локомоторной активности червей в жидких средах в популяциях пятнадцати червей 4-й стадии (L4) на скважину плиты с плоским дном из 96 скважин. Эта полуавтоматизированная и недорогая методология WormScan может быть легко адаптирована к высокопроизводительный скринингу лекарств, а также к анализу различных стадий животных и возрастов^{48,49 лет.}

Здесь протокол и эффективность анализа двигательной активности C. elegans с использованием полуавтоматических методов ZebraLab и WormScan демонстрируется в хорошо заведомо заданной модели C. elegans для митохондриального комплекса I заболевания, gas-1(fc21). газ-1 (ген K09A9.5) является ортологом человеческого NDUFS2 (NADH: ядро убихиноноксидоредуктазы (железо-серный белок) субъедицы 2)(рисунок 3). Мутантный штамм C. elegans gas-1(fc21)несет гомозиготную мутацию p.R290K в ортологе человека NDUFS2^50,вызывая значительное снижение плодовитости и продолжительности жизни, нарушение способности окислительного фосфорилирования дыхательной цепи (OXPHOS)^51,а также снижение митохондриальной массы и мембранного потенциала с повышенным окислительным стрессом^5,8 . Несмотря на его хорошо заявленное использование в течение последних двух десятилетий для изучения митохондриальных заболеваний, о двигательной активности мутантов газа-1(fc21)ранее не сообщалось. Здесь методы ZebraLab и WormScan были применены для независимой количественной оценки локомоторной активности газа-1(fc21)по сравнению с червями дикого типа (WT, N2 Bristol), как для проверки методов, так и для демонстрации их сравнительной полезности и эффективности экспериментальных протоколов и анализа информатики. Программное обеспечение ZebraLab позволило быстро количественно оценить несколько одновременных состояний двигательной активности червей в моделях митохондриальных заболеваний C. elegans с потенциальным применением для целевого скрининга лекарств или валидационных исследований. Анализ WormScan, в частности, хорошо подходит для обеспечения высокопроизводительного скрининга лекарств в библиотеках соединений и определения приоритетов лидов, которые улучшают нервно-мышечную функцию животных и двигательную активность в доклинических моделях C. elegans первичных митохондриальных заболеваний.