Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Caenorhabiditis elegans é amplamente reconhecido como um modelo excepcional na neurociência com base em ter 302 neurônios que coordenam todos os comportamentos de vermes, incluindo acasalamento, alimentação, colocação de ovos, defecação, natação e locomoção em mídia sólida¹. Estes nematoides hermafroditas também são amplamente utilizados para entender uma ampla gama de mecanismos de doença humana, possibilitados por seu genoma bem caracterizado e alta homologia de ~80% de genes entre C. elegans e humanos^2,3,4. C. elegans têm sido usados há muito tempo para interrogar a doença mitocondrial humana^5,6,7,8,9,10, que é um grupo altamente geneticamente e fenotipicamente heterogêneo de distúrbios metabólicos herdados que compartilham capacidade prejudicada para gerar energia celular e muitas vezes clinicamente presente com função neuromuscular substancialmente prejudicada, intolerância ao exercício e fadiga^{11 ,12,13,14}. Para isso, o uso de modelos C. elegans permite modelagem pré-clínica de aspectos quantitativos da atividade animal e função neuromuscular em diferentes subtipos genéticos da doença mitocondrial, bem como sua resposta a terapias candidatas que podem melhorar sua função neuromuscular e atividade geral.

A atividade neuromuscular em C. elegans é objetivamente mensurável por uma série de metodologias experimentais, incluindo abordagens manuais e semi-automatizadas que permitem análises funcionais em mídia sólida ou líquida(Tabela 1)^1,15. A quantitação precisa da atividade de C. elegans tem se mostrado importante para permitir descobertas relacionadas à função e desenvolvimento do sistema muscular e nervoso^16,17,18. Este estudo resume e compara requisitos experimentais, vantagens e limitações de 17 ensaios diferentes que podem ser realizados em laboratórios de pesquisa para avaliar a função neuromuscular e a atividade em quatro desfechos fundamentais em modelos de doenças C. elegans, tanto na linha de base em uma gama de estágios e idades do desenvolvimento, bem como em resposta às terapias dos candidatos (Tabela 1 ). De fato, o estudo fornece uma visão geral detalhada da gama de abordagens experimentais disponíveis para caracterizar taxas de C. elegans thrashing (dobras corporais por minuto), atividade locomotor, bombeamento farínngeal e quimiotaxis – em cada caso especificando a metodologia experimental e analítica utilizada, as vantagens e limitações de cada método, o equipamento e software necessários para executar e analisar cada ensaio, e a capacidade de rendimento de cada método para apoiar seu uso para fins de triagem genética ou medicamentosa de alto rendimento. A capacidade de rendimento de cada ensaio é descrita como baixa, média ou alta com base na complexidade experimental do protocolo, incluindo manutenção de vermes, tempo de processamento, uso de placas únicas ou multi-poços e/ou tempo de experimentador necessário para completar a configuração experimental e análises de dados.

As análises manuais de thrashing¹⁹, atividade locomotor^20,bombeamento faríndico^17,21, e^{quimiotaxis 22,23} são metodologias bem estabelecidas para avaliar a atividade do verme que requerem um estereomicroscope²⁴. Embora medir a atividade de desbaste de vermes requer análise em mídia líquida para determinar a frequência de dobras corporais por minuto, a atividade locomotor de vermes pode ser medida tanto em mídia sólida quanto em mídia líquida. No entanto, as análises manuais da atividade individual do worm são inerentemente demoradas e envolvem viés inevitável gerado pelo usuário. A automação das análises de atividade de worm minimiza o viés gerado pelo usuário e pode aumentar consideravelmente o throughput experimental²⁵. Gravações de vídeo de atividade de espancamento de worms em mídia líquida podem ser analisadas usando wrMTrck, um plugin ImageJ²⁶. No entanto, as configurações experimentais originais que foram desenvolvidas para o wrMTrck limitaram sua utilidade, uma vez que muitos worms em uma única gota líquida levaram à sobreposição de worms que dificultavam o rastreamento preciso. Embora essa limitação experimental tenha sido resolvida^27,o método wrMTrck não é capaz de suportar a triagem de alto rendimento.

Existem uma série de métodos para quantificar a atividade locomotor de vermes na linha de base e em resposta às terapias candidatas em modelos de doença mitocondrial C. elegans. Estes incluem ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker²⁸, ampla plataforma de rastreamento de nematoides de campo de visão (WF-NTP)²⁹, WormMotel, WormWatcher^30,WormLab³¹, Infinity Chip³²e WMicrotracker One³³ (Tabela 1). Esses métodos permitem a análise simultânea da locomoção em múltiplas cepas ou condições de vermes, tipicamente em placas de vários poços, suportando assim aplicações de triagem de medicamentos de maior rendimento. Alguns desses métodos têm considerações únicas que podem limitar ou melhorar sua utilidade geral, como a necessidade de equipamentos caros versus software de acesso aberto e a facilidade variada de executar protocolos experimentais. No geral, nenhum sistema ou protocolo experimental único é ideal para todos os experimentos de atividade locomotor de C. elegans. Em vez disso, é importante escolher cuidadosamente qual método é mais adequado para as metas e requisitos experimentais do investigador específico.

O bombeamento faringeal representa outro resultado importante para avaliar a atividade neuromuscular em C. elegans. A faringe C. elegans é composta por 20 células musculares, 20 neurônios e 20 outras células que permitem a ingestão de Escherichia coli (E. coli)na extremidade anterior do trato alimentar do verme^34,35,36. Vários métodos manuais foram estabelecidos para determinar as taxas de bombeamento faringeal^17,21,37,38. A maioria dos métodos baseia-se no uso de um estereómico e câmera para visualizar e registrar a frequência de bombeamento faringeal com contagem direta pelo observador experimental²¹. A análise automatizada da taxa de bombeamento faringeal é possível realizando um registro extracelular denominado eletrofarngeoograma (EPG), que fornece informações adicionais sobre a duração de cada bomba³⁹. A análise da taxa de bombeamento faringeal também é possível em um sistema microfluido, WormSpa, onde vermes individuais estão confinados nas câmaras^40,41. Um método comercial disponível para facilitar a análise da taxa de bomba faríneal é o ScreenChip System (InVivo Biosystems), que mede, visualiza e analisa os aspectos neuromusculares do comportamento alimentar em um único verme que é imobilizado em um chip personalizado. Essa abordagem de quantitação de bombeamento faringeal pode ser usada para avaliar tanto as respostas neuronais quanto fisiológicas às drogas, ao envelhecimento e a outros fatores^42,43,44,45.

A quimiotaxis descreve o movimento de C. elegans em resposta a um odorlante colocado longe dos vermes em uma área definida da placa de mídia de crescimento nematoide (NGM). Avaliar a resposta da quimiotaxis fornece uma medida integrada de atividade neuronal e neuromuscular de vermes que é quantificável observando e medindo a distância física percorrida por vermes em direção ao odorno em um período de tempo definido⁴⁶. O Multi-Worm Tracker é um método automático que pode ser usado para melhorar a eficiência experimental de quantificar a distância percorrida por worms em direção a um atrativo ou de um repelente⁴⁷.

Aqui, o protocolo detalhado para dois novos métodos semi-automatizados estabelecidos para quantificar a atividade do worm é descrito. A primeira abordagem utiliza o ZebraLab, um software comercial que foi originalmente desenvolvido para estudar a atividade de natação de Danio rerio (zebrafish), para um novo aplicativo de médio-rendimento para quantificar a atividade locomotor global em mídia líquida de C. elegans com base em mudanças de pixels durante o movimento(Tabela 1, Figura 1). A saída de dados é rapidamente obtida a partir de um grande número de condições simultâneas e amostras analisadas em um slide de vidro, embora este método não seja adequado para um formato de placa multi-poço. A segunda abordagem é uma nova adaptação da metodologia WormScan^48,49 ( Figura2), que usa um scanner de plataforma para criar uma imagem diferencial de dois scans sequenciais que podem ser variadamente utilizados com software de código aberto para permitir a análise quantitativa semi-automatizada de desfechos fisiológicos integrados, como fecundidade e sobrevivência. Aqui, foi desenvolvida uma nova adaptação de alto rendimento da metodologia WormScan para quantificar a atividade locomotor de vermes em mídia líquida em populações de quinze vermes larval estágio 4 (L4) por poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Esta metodologia wormScan semi-automatizada e de baixo custo pode ser prontamente adaptada a telas de drogas de alto rendimento, bem como a análises de vários estágios animais e idades^{de 48,49}anos .

Aqui, o protocolo e a eficácia da análise da atividade locomotor C. elegans utilizando métodos semi-automatizados ZebraLab e WormScan são demonstrados em um modelo C. elegans bem estabelecido para doença do complexo mitocondrial I, gas-1(fc21). gas-1 (gene K09A9.5) é uma ortopedia do NDUFS2 humano (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (proteína ferro-enxofre) subunita 2)(Figura 3). A cepa mutante C. elegans gas-1(fc21) carrega uma mutação homozigosa p.R290K missense no topiche humano de NDUFS2^50,causando significativamente diminuição da fecundidade e da vida útil, capacidade de fosforilação oxidativa da cadeia respiratória prejudicada (OXPHOS) capacidade⁵¹, bem como diminuição da massa mitocondrial e potencial de membrana com aumento do estresse oxidativo^5,8 . Apesar de seu uso bem estabelecido nas últimas duas décadas para estudar doença mitocondrial, a atividade locomotor de mutantes gas-1(fc21)não foi relatada anteriormente. Aqui, os métodos ZebraLab e WormScan foram aplicados para quantificar independentemente a atividade locomotor do gás-1(fc21) em comparação com vermes do tipo selvagem (WT, N2 Bristol), tanto como uma forma de validar os métodos quanto de demonstrar sua utilidade comparativa e eficiência dos protocolos experimentais e análises de informática. O software ZebraLab permitiu a rápida quantitação de várias condições simultâneas de atividade locomotor de vermes em modelos de doença mitocondrial C. elegans, com potencial aplicação para estudos de triagem ou validação de medicamentos direcionados. A análise do WormScan, em particular, é adequada para permitir prontamente telas de medicamentos de alto rendimento de bibliotecas compostas e priorizar leads que melhorem a função neuromuscular animal e a atividade locomotor em modelos pré-clínicos de C. elegans da doença mitocondrial primária.