ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabiditis elegans מוכר באופן נרחב כמודל יוצא מן הכלל במדעי המוח המבוססים על כך שיש לו 302 נוירונים המתאמים את כל התנהגויות התולעת, כולל הזדווגות, האכלה, הטלת ביצים, צואה, שחייה וקטר על מדיה מוצקה¹. נמטודות הרמפרודיטיות אלה משמשות גם הן להבנת מגוון רחב של מנגנוני מחלות אנושיות, המתאפשרות על ידי הגנום המאופיין היטב שלה והומולוגיה גבוהה של ~ 80% גנים בין C. elegans ובני אדם^2,3,4. C. elegans שימשו זמן רב לחקור מחלה מיטוכונדריאלית אנושית^5,6^,7,8,9,10, שהיא קבוצה הטרוגנית גנטית ופנוטיפית מאוד של הפרעות מטבוליות תורשתיות החולקות יכולת לקויה לייצר^אנרגיהתאית ולעתים קרובות נוכחת קלינית עם תפקוד עצבי שרירי לקוי באופן משמעותי, חוסר סובלנות לפעילות גופנית ועייפות^{11 ,12,13,14}. לכך, השימוש במודלים C. elegans מאפשר מידול פרה-אקליני של היבטים כמותיים של פעילות בעלי חיים ותפקוד עצבי-שרירי בתת-סוגים גנטיים שונים של מחלה מיטוכונדריאלית, כמו גם את תגובתם לטיפולים מועמדים שעשויים לשפר את תפקודם הנוירו-שרירי ואת הפעילות הכוללת שלהם.

פעילות עצבית-שרירית ב- C. elegans ניתנת למדידה אובייקטיבית על ידי מגוון מתודולוגיות ניסיוניות, כולל גישות ידניות והן גישות אוטומטיות למחצה המאפשרות ניתוחים פונקציונליים במדיה מוצקה או נוזלית (טבלה 1)^1,15. כמות מדויקת של פעילות C. elegans הוכיחה חשיבות כדי לאפשר תגליות הקשורות לתפקוד ופיתוח של מערכת השרירים והעצבים^16,17,18. מחקר זה מסכם ומשווה דרישות ניסיוניות, יתרונות ומגבלות של 17 בדיקות שונות שניתן לבצע במעבדות מחקר להערכת תפקוד ופעילות נוירו-שרירית בארבע תוצאות מרכזיות במודלים של מחלות C. elegans, הן בבסיס במגוון שלבים וגילאים התפתחותיים והן בתגובה על ניתוחי המועמדים (טבלה 1 ). ואכן, המחקר מספק סקירה מפורטת של מגוון הגישות הניסיוניות הזמינות לאפיון שיעורי החבטות של C. elegans (כיפופי גוף לדקה), פעילות לוקומוטור, שאיבת הלוע, וכימיה – בכל מקרה המציין את המתודולוגיה הניסיונית והאנליטית שבה נעשה שימוש, את היתרונות והמגבלות של כל שיטה, את הציוד והתוכנה הדרושים לביצוע ולנתח כל בדיקת ערך, ויכולת התפוקה של כל שיטה לתמיכה בשימוש בה למטרות הקרנה גנטית או סמים בעלת תפוקה גבוהה. קיבולת התפוקה של כל בדיקת אסאי מתוארת כנמוכה, בינונית או גבוהה בהתבסס על מורכבות הפרוטוקול הניסיוני, כולל תחזוקת תולעים, זמן עיבוד, שימוש בלוחות יחידים או רב-באריים ו/או זמן ההתנסות הדרוש להשלמת ההגדרה הניסיונית וניתוחי הנתונים.

ניתוחים ידניים של^{חבטות 19}, פעילות לוקומוטור²⁰, שאיבת הלוע^17,21, ו chemotaxis^22,23 הם מתודולוגיות מבוססות היטב להערכת פעילות תולעת הדורשות סטריאומיקוסקופ²⁴. בעוד מדידת פעילות חבטות של תולעים דורש ניתוח במדיה נוזלית כדי לקבוע את תדירות כיפופי הגוף לדקה, פעילות locomotor תולעת ניתן למדוד או על מדיה מוצקה או במדיה נוזלית. עם זאת, ניתוחים ידניים של פעילות תולעת בודדת גוזלים זמן מהדורת ומערבים הטיה בלתי נמנעת שנוצרה על ידי המשתמש. אוטומציה של ניתוחי פעילות תולעים ממזערת הטיה שנוצרה על ידי המשתמש ויכולה להגדיל מאוד את התפוקה הניסיונית²⁵. הקלטות וידאו של פעילות חבטות תולעת במדיה נוזלית ניתן לנתח באמצעות wrMTrck, תוסף ImageJ²⁶. עם זאת, ההגדרות הניסיוניות המקוריות שפותחו עבור wrMTrck הגבילו את השירות שלה, שכן תולעים רבות מדי בטיפת נוזל אחת הובילו לחפיפה של תולעים שהקשו על מעקב מדויק. בעוד מגבלה ניסיונית זו נפתרה²⁷, שיטת wrMTrck אינה מסוגלת לתמוך הקרנה בתפוקה גבוהה.

קיימות מגוון שיטות לכימות פעילות לוקומוטור תולעת בבסיס ובתגובה טיפולים מועמדים במודלים של מחלות מיטוכונדריאליות C. elegans. אלה כוללים ZebraLab (ViewPoint מדעי החיים), מעקב Tierpsy²⁸, פלטפורמת מעקב נמטודה רחבה של שדה הראייה (WF-NTP)²⁹, WormMotel, WormWatcher³⁰, WormLab³¹, צ’יפ אינפיניטי³², ו- WMicrotracker One³³ (טבלה 1). שיטות אלה מאפשרות ניתוח בו-זמני של קטר בזני תולעים מרובים או בתנאים מרובים, בדרך כלל על לוחות מרובי בארות, ובכך תומכים ביישומי הקרנת סמים בעלי תפוקה גבוהה יותר. לחלק משיטות אלה יש שיקולים ייחודיים שעשויים להגביל או לשפר את השירות הכללי שלהן, כגון הצורך בציוד יקר לעומת תוכנה לגישה פתוחה, וקלות משתנה של ביצוע פרוטוקולים ניסיוניים. בסך הכל, אין מערכת ניסיונית אחת או פרוטוקול מתאים באופן אידיאלי לכל ניסויי פעילות locomotor C. elegans. במקום זאת, חשוב לבחור בקפידה איזו שיטה מתאימה ביותר למטרות ולדרישות הניסיוניות של החוקר הספציפי.

שאיבת הלוע מייצגת תוצאה חשובה נוספת להערכת הפעילות הנוירו-שרירית ב- C. elegans. הלוע C. elegans מורכב מ -20 תאי שריר, 20 נוירונים, ו -20 תאים אחרים המאפשרים בליעה של Escherichia coli (E. coli) בקצה האחורי של דרכי העלייה של התולעת^34,35,36. מספר שיטות ידניות הוקמו כדי לקבוע את שיעורי שאיבת הלוע^17,21,37,38. רוב השיטות מבוססות על שימוש סטריאומיקוסקופ ומצלמה לדמיין ולהקליט תדירות שאיבת הלוע עם ספירה ישירה על ידי הצופה הניסיוני²¹. ניתוח אוטומטי של קצב שאיבת הלוע אפשרי על ידי ביצוע הקלטה חוץ-תאית המכונה electropharyngeogram (EPG), המספקת מידע נוסף על משך כל משאבה³⁹. ניתוח קצב שאיבת הלוע אפשרי גם במערכת מיקרופלואידית, WormSpa, שבה תולעים בודדות מוגבלות בתאים^40,41. שיטה מסחרית הזמינה כדי להקל על ניתוח קצב משאבת הלוע היא מערכת ScreenChip (InVivo Biosystems), המודדת, מדמה ומנתחת את ההיבטים הנוירו-שריריים של התנהגות האכלה בתולעת אחת משותקת בשבב מותאם אישית. גישה זו של כמות שאיבה הלוע יכולה לשמש להערכת תגובות עצביות ופיזיולוגיות לתרופות, הזדקנות וגורמים אחרים^42,43,44,45.

Chemotaxis מתאר את התנועה של C. elegans בתגובה ריח שהונח הרחק התולעים באזור מוגדר של צלחת מדיה צמיחה נמטודה (NGM). הערכת תגובת הכימוטקסיס מספקת מדד משולב של פעילות עצבית ונוירו-שרירית תולעת הניתנת לכימות על ידי התבוננות ומדידת המרחק הפיזי שעברו תולעים לכיוון הריח בפרק זמן מוגדר⁴⁶. מעקב תולעים מרובות היא שיטה אוטומטית שניתן להשתמש בה כדי לשפר את היעילות הניסיונית של כימות המרחק שעברו תולעים לכיוון מושך או מדוחה⁴⁷.

כאן, הפרוטוקול המפורט עבור שתי שיטות חדשניות, חצי אוטומטיות שנקבעו לכימות פעילות תולעת מתואר. הגישה הראשונה משתמשת ב-ZebraLab תוכנה מסחרית שפותחה במקור כדי לחקור את פעילות השחייה של דניו ריו (דג זברה), עבור יישום חדשני בעל תפוקה בינונית כדי לכמת את פעילות הלוקומוטור הכוללת במדיה נוזלית של C. elegans בהתבסס על שינויי פיקסלים במהלך התנועה(טבלה 1, איור 1). פלט נתונים מתקבל במהירות ממספר רב של תנאים ודגימות בו-זמנית המנותחים בשקופית זכוכית, אם כי שיטה זו אינה מתאימה לתבנית צלחת מרובת בארות. הגישה השנייה היא עיבוד חדשני למתודולוגיית WormScan^48,49 (איור 2),המשתמש בסורק שטוח כדי ליצור תמונה דיפרנציאלית של שתי סריקות רציפות שניתן להשתמש בהן באופן שונה עם תוכנת קוד פתוח כדי לאפשר ניתוח כמותי אוטומטי למחצה של תוצאות פיזיולוגיות משולבות כגון פוריות והישרדות. כאן, עיבוד חדשני בעל תפוקה גבוהה למתודולוגיית WormScan כדי לכמת את פעילות לוקומוטור התולעת במדיה נוזלית באוכלוסיות של 15 תולעים בשלב זחל 4 (L4) לכל באר של צלחת שטוחה 96 היטב פותחה. מתודולוגיה זו של WormScan חצי אוטומטית ובעלות נמוכה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה, כמו גם לנתחים של שלבים שונים של בעלי חיים וגילאי^48,49.

כאן, הפרוטוקול והיעילות של ניתוח פעילות לוקומוטור C. elegans באמצעות זברהלאב ו- WormScan שיטות חצי אוטומטיות מודגמת במודל C. elegans מבוסס היטב עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי I, גז-1(fc21). גז-1 (באנגלית: gas-1) הוא גן אורתולוגיה של NDUFS2 אנושי (NADH: ליבת אוקסידורדוקטאז אוביקינון) (חלבון ברזל-גופרית) 2)(איור 3). זן מוטציה C. elegans gas-1(fc21)נושא מוטציה של homozygous p.R290K באורתולוגיה האנושית של NDUFS2⁵⁰, מה שגורם לירידה משמעותית בפרוות ובתוחלת החיים, שרשרת זרחן חמצונית לקויה (OXPHOS)^{קיבולת 51}, כמו גם ירידה במסה המיטוכונדריאלית ובפוטנציאל הממברנה עם לחץ חמצוני מוגבר^5,8 . למרות השימוש המבוסס שלה בשני העשורים האחרונים כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות, פעילות לוקומוטור של מוטציות גז-1(fc21)לא דווחה בעבר. כאן, זברהלאב ושיטות WormScan הוחלו כדי לכמת באופן עצמאי את פעילות locomotor של גז-1(fc21) בהשוואה תולעים מסוג פראי (WT, N2 בריסטול), הן כדרך לאמת את השיטות, כמו גם כדי להפגין את התועלת ההשוואתית שלהם ואת היעילות של פרוטוקולים ניסיוניים וניתוחים אינפורמטיקה. תוכנת ZebraLab אפשרה כמות מהירה של מספר תנאים בו-זמנית של פעילות לוקומוטור תולעת במודלים של מחלות מיטוכונדריאליות C. elegans, עם יישום פוטנציאלי לבדיקת תרופות ממוקדות או מחקרי אימות. ניתוח WormScan, בפרט, מתאים היטב כדי לאפשר בקלות מסכי סמים בעלי תפוקה גבוהה של ספריות מורכבות ולתעדף לידים המשפרים את התפקוד הנוירו-שרירי של בעלי החיים ואת פעילות הלוקומוטור במודלים פרה-קליניים C. elegans של מחלה מיטוכונדריאלית ראשונית.