Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Caenorhabiditis elegans ist weithin als herausragendes Modell in den Neurowissenschaften anerkannt, basierend auf 302 Neuronen, die alle Wurmverhaltensweisen koordinieren, einschließlich Paarung, Fütterung, Eiablage, Defäkation, Schwimmen und Fortbewegung auf festen Medien¹. Diese hermaphroditischen Nematoden werden auch häufig verwendet, um eine breite Palette von menschlichen Krankheitsmechanismen zu verstehen, die durch ihr gut charakterisiertes Genom und ihre hohe Homologie von ~ 80% Genen zwischen C. elegans und Menschen ermöglicht werden^2,3,4. C. elegans wird seit langem verwendet, um die menschliche mitochondriale Krankheit^5,6, 7^,8,9,10zuuntersuchen, die eine hochgradig genetisch und phänotypisch heterogene Gruppe von erblichen Stoffwechselstörungen ist, die eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Erzeugung von Zellenergie teilen und oft klinisch mit erheblich beeinträchtigter neuromuskulärer Funktion, Belastungsintoleranz und Müdigkeit vorliegen^{11 ,12,13,14}. Zu diesem Zweck ermöglicht die Verwendung von C. elegans-Modellen die präklinische Modellierung quantitativer Aspekte der tierischen Aktivität und der neuromuskulären Funktion in verschiedenen genetischen Subtypen mitochondrialer Erkrankungen sowie deren Reaktion auf Therapiekandidaten, die ihre neuromuskuläre Funktion und Gesamtaktivität verbessern können.

Die neuromuskuläre Aktivität bei C. elegans ist objektiv messbar durch eine Reihe experimenteller Methoden, einschließlich manueller und halbautomatischer Ansätze, die funktionelle Analysen in festen oder flüssigen Medien ermöglichen (Tabelle 1)^1,15. Die genaue Quantifizierung der Aktivität von C. elegans hat sich als wichtig erwiesen, um Entdeckungen im Zusammenhang mit der Funktion und Entwicklung des Muskel- und Nervensystems zu ermöglichen^16,17,18. Diese Studie fasst die experimentellen Anforderungen, Vorteile und Einschränkungen von 17 verschiedenen Assays zusammen und vergleicht sie, die in Forschungslabors durchgeführt werden können, um die neuromuskuläre Funktion und Aktivität an vier Schlüsselergebnissen in C. elegans-Krankheitsmodellen zu bewerten, sowohl zu Studienbeginn in einer Reihe von Entwicklungsstadien und Im alter als auch als Reaktion auf Kandidatentherapien (Tabelle 1 ). In der Tat bietet die Studie einen detaillierten Überblick über die Palette der verfügbaren experimentellen Ansätze zur Charakterisierung der Raten von C. elegans Thrashing (Körperbiegungen pro Minute), Bewegungsaktivität, Pharynxpumpen und Chemotaxis – jeweils unter Angabe der verwendeten experimentellen und analytischen Methodik, der Vorteile und Grenzen jeder Methode, der Ausrüstung und Software, die für die Durchführung und Analyse jedes Assays erforderlich sind. und die Durchsatzkapazität jeder Methode, um ihre Verwendung für genetische Hochdurchsatz- oder Arzneimittelscreening-Zwecke zu unterstützen. Die Durchsatzkapazität jedes Assays wird basierend auf der Komplexität des experimentellen Protokolls als niedrig, mittel oder hoch beschrieben, einschließlich der Wurmwartung, der Verarbeitungszeit, der Verwendung von Einzel- oder Mehrplatzplatten und/oder der Experimentatorzeit, die für die Fertigstellung der experimentellen Einstellung und der Datenanalysen erforderlich ist.

Manuelle Analysen von Thrashing¹⁹, Bewegungsaktivität²⁰, Pharynxpumpen^17,21und Chemotaxis^22,23 sind etablierte Methoden zur Bewertung der Wurmaktivität, die ein Stereomikroskop erfordern²⁴. Während die Messung der Schlagaktivität von Würmern eine Analyse in flüssigen Medien erfordert, um die Häufigkeit von Körperbiegungen pro Minute zu bestimmen, kann die Wurmlokomotoraktivität entweder auf festen Medien oder in flüssigen Medien gemessen werden. Manuelle Analysen der individuellen Wurmaktivität sind jedoch von Natur aus zeitaufwendig und beinhalten unvermeidliche benutzergenerierte Verzerrungen. Die Automatisierung von Wurmaktivitätsanalysen minimiert benutzergenerierte Verzerrungen und kann den experimentellen Durchsatz erheblich erhöhen²⁵. Videoaufnahmen von Wurm-Thrashing-Aktivitäten in flüssigen Medien können mit wrMTrck, einem ImageJ-Plugin^26,analysiert werden. Die ursprünglichen experimentellen Einstellungen, die für wrMTrck entwickelt wurden, schränkten jedoch seinen Nutzen ein, da zu viele Würmer in einem einzigen Flüssigkeitstropfen zu überlappenden Würmern führten, die eine genaue Verfolgung erschwerten. Während diese experimentelle Einschränkung aufgelöst wurde^27,ist die wrMTrck-Methode nicht in der Lage, hochdurchsatziges Screening zu unterstützen.

Es gibt eine Reihe von Methoden zur Quantifizierung der Aktivität des Wurmlokomotors zu Studienbeginn und als Reaktion auf Mögliche Therapien in modellen der mitochondrialen Erkrankungen von C. elegans. Dazu gehören ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker²⁸, Wide Field-of-View Nematode Tracking Platform (WF-NTP)²⁹, WormMotel, WormWatcher³⁰, WormLab³¹, Infinity Chip³²und WMicrotracker One³³ (Tabelle 1). Diese Methoden ermöglichen die gleichzeitige Analyse der Fortbewegung in mehreren Wurmstämmen oder -bedingungen, typischerweise auf Multi-Well-Platten, wodurch Arzneimittel-Screening-Anwendungen mit höherem Durchsatz unterstützt werden. Einige dieser Methoden haben einzigartige Überlegungen, die ihren allgemeinen Nutzen einschränken oder verbessern können, z. B. die Notwendigkeit teurer Geräte im Vergleich zu Open-Access-Software und die unterschiedliche Leichtigkeit der Durchführung experimenteller Protokolle. Insgesamt ist kein einzelnes experimentelles System oder Protokoll ideal für alle C. elegans Bewegungsaktivitätsexperimente geeignet. Vielmehr ist es wichtig, sorgfältig auszuwählen, welche Methode für die experimentellen Ziele und Anforderungen des jeweiligen Prüfers am besten geeignet ist.

Das Pharynxpumpen stellt ein weiteres wichtiges Ergebnis zur Beurteilung der neuromuskulären Aktivität bei C. elegansdar. Der C. elegans pharynx besteht aus 20 Muskelzellen, 20 Neuronen und 20 weiteren Zellen, die die Einnahme von Escherichia coli (E. coli) am vorderen Ende des Verdauungstraktes des Wurms ermöglichen^34,35,36. Es wurden mehrere manuelle Methoden zur Bestimmung der Pharynxpumpraten^17,21,37,38etabliert. Die meisten Methoden basieren auf der Verwendung eines Stereomikroskops und einer Kamera zur Visualisierung und Aufzeichnung der pharyngealen Pumpfrequenz mit direkter Zählung durch den experimentellen Beobachter²¹. Eine automatisierte Pharynxpumpenratenanalyse ist durch die Durchführung einer extrazellulären Aufzeichnung des so bezeichneten Elektropharyngeogramms (EPG) möglich, die zusätzliche Informationen über die Dauer jeder^{Pumpe liefert 39}. Die Analyse der Pharynxpumprate ist auch in einem mikrofluidischen System, WormSpa, möglich, bei dem einzelne Würmer in den Kammern^40,41eingeschlossen sind. Eine kommerzielle Methode, um die Analyse der Pharynxpumpenrate zu erleichtern, ist das ScreenChip System (InVivo Biosystems), das die neuromuskulären Aspekte des Fütterungsverhaltens in einem einzelnen Wurm misst, visualisiert und analysiert, der in einem benutzerdefinierten Chip immobilisiert wird. Dieser Pharynxpumpen-Quantifizierungsansatz kann verwendet werden, um sowohl neuronale als auch physiologische Reaktionen auf Medikamente, Alterung und andere Faktoren zu bewerten^42,43,44,45.

Chemotaxis beschreibt die Bewegung von C. elegans als Reaktion auf ein Geruchsmittel, das von den Würmern in einem definierten Bereich der Nematodenwachstumsmedienplatte (NGM) entfernt ist. Die Beurteilung der Chemotaxis-Reaktion liefert ein integriertes Maß für die neuronale und neuromuskuläre Aktivität von Würmern, das quantifizierbar ist, indem die physische Entfernung, die Würmer in einem definierten Zeitraum zum Geruchsstoff zurücklegen, beobachtet und gemessen wird⁴⁶. Der Multi-Worm Tracker ist eine automatische Methode, mit der die experimentelle Effizienz der Quantifizierung der von Würmern zurückgelegten Entfernung zu einem Lockstoff oder von einem Abwehrmittel verbessert werden kann⁴⁷.

Hier wird das detaillierte Protokoll für zwei neuartige, halbautomatische Methoden zur Quantifizierung der Wurmaktivität beschrieben. Der erste Ansatz verwendet ZebraLab, eine kommerzielle Software, die ursprünglich entwickelt wurde, um die Schwimmaktivität von Danio rerio (Zebrafisch) für eine neuartige Anwendung mit mittlerem Durchsatz zu untersuchen, um die Gesamtaktivität des Bewegungsapparates in flüssigen Medien von C. elegans basierend auf Pixeländerungen während der Bewegung zu quantifizieren (Tabelle 1, Abbildung 1). Die Datenausgabe wird schnell aus einer großen Anzahl von gleichzeitigen Bedingungen und Proben gewonnen, die auf einem Glasobjektträger analysiert werden, obwohl diese Methode nicht für ein Multi-Well-Plattenformat geeignet ist. Der zweite Ansatz ist eine neuartige Adaption der WormScan-Methodik^48,49 ( Abbildung2), die einen Flachbettscanner verwendet, um ein differenzielles Bild von zwei sequenziellen Scans zu erstellen, die variabel mit Open-Source-Software verwendet werden können, um eine halbautomatische quantitative Analyse integrierter physiologischer Ergebnisse wie Fruchtbarkeit und Überleben zu ermöglichen. Hier wurde eine neuartige Hochdurchsatzadaption der WormScan-Methodik zur Quantifizierung der Wurmlokomotoraktivität in flüssigen Medien in Populationen von fünfzehn Larven-Würmern im Stadium 4 (L4) pro Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte entwickelt. Diese halbautomatische und kostengünstige WormScan-Methodik kann leicht an Hochdurchsatz-Arzneimittel-Screens sowie an Analysen verschiedener Tierstadien und im Alter von^48,49Jahren angepasst werden.

Hier wird das Protokoll und die Wirksamkeit der Analyse der Bewegungsaktivität von C. elegans mit halbautomatischen Methoden zebraLab und WormScan in einem gut etablierten C. elegans-Modell für die mitochondriale Komplex-I-Krankheit, Gas-1(fc21) demonstriert. Gas-1 (K09A9.5-Gen) ist ein Ortholog des humanen NDUFS2 (NADH: Ubichinonoxidoreduktase-Kern (Eisen-Schwefel-Protein) Untereinheit 2) (Abbildung 3). Der mutierte C. elegans Gas-1(fc21) -Mutantenstamm trägt eine homozygote p.R290K-Missense-Mutation im menschlichen Ortholog von NDUFS2⁵⁰, was zu einer signifikant verminderten Fruchtbarkeit und Lebensdauer, einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierungskapazität der Atmungskette (OXPHOS)⁵¹sowie einer verminderten mitochondrialen Masse und Membranpotenzial mit erhöhtem oxidativem Stress führt^5,8 . Trotz seiner in den letzten zwei Jahrzehnten gut etablierten Verwendung zur Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen wurde die motorische Aktivität von Gas-1 (fc21) -Mutanten bisher nicht berichtet. Hier wurden ZebraLab- und WormScan-Methoden eingesetzt, um die Bewegungsaktivität von Gas-1(fc21) im Vergleich zu Wildtyp-Würmern (WT, N2 Bristol) unabhängig zu quantifizieren, sowohl um die Methoden zu validieren als auch um ihren vergleichenden Nutzen und ihre Effizienz der experimentellen Protokolle und Informatikanalysen zu demonstrieren. Die ZebraLab-Software ermöglichte die schnelle Quantifizierung mehrerer gleichzeitiger Zustände der Wurmlokomotoraktivität in modellen der mitochondrialen Erkrankung von C. elegans mit potenzieller Anwendung für gezielte Arzneimittelscreening- oder Validierungsstudien. Insbesondere die WormScan-Analyse ist gut geeignet, um Schnelldurchsatz-Wirkstoff-Screens von Wirkstoffbibliotheken zu ermöglichen und Leads zu priorisieren, die die neuromuskuläre Funktion des Tieres und die Bewegungsaktivität in präklinischen C. elegans-Modellen primärer mitochondrialer Erkrankungen verbessern.