Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Caenorhabiditis elegans wordt algemeen erkend als een uitstekend model in de neurowetenschappen op basis van het hebben van 302 neuronen die alle wormgedrag coördineren, inclusief paring, voeding, eieren leggen, ontlasting, zwemmen en voortbeweging op vaste media¹. Deze hermafrodiete nematoden worden ook veel gebruikt om een breed scala aan menselijke ziektemechanismen te begrijpen, mogelijk gemaakt door het goed gekarakteriseerde genoom en de hoge homologie van ~ 80% genen tussen C. elegans en mensen^2,3,4. C. elegans worden al lang gebruikt om de menselijke mitochondriale ziekte^5,6,7,8,9,10te ondervragen, wat een zeer genetisch en fenotypisch heterogene groep van erfelijke metabole stoornissen is die een verminderd vermogen delen om cellulaire energie te genereren en vaak klinisch aanwezig zijn met een aanzienlijk verminderde neuromusculaire functie, inspanningsintolerantie en vermoeidheid^{11 ,12,13,14}. Hiertoe maakt het gebruik van C. elegans-modellen preklinische modellering mogelijk van kwantitatieve aspecten van dierlijke activiteit en neuromusculaire functie in verschillende genetische subtypen van mitochondriale ziekte, evenals hun reactie op kandidaat-therapieën die hun neuromusculaire functie en algehele activiteit kunnen verbeteren.

Neuromusculaire activiteit in C. elegans is objectief meetbaar door een reeks experimentele methodologieën, waaronder zowel handmatige als semi-geautomatiseerde benaderingen die functionele analyses in vaste of vloeibare media mogelijk maken (Tabel 1)^1,15. Nauwkeurige kwantificering van C. elegans-activiteit is belangrijk gebleken om ontdekkingen mogelijk te maken met betrekking tot de functie en ontwikkeling van het spier- en zenuwstelsel^16,17,18. Deze studie vat de experimentele vereisten, voordelen en beperkingen van 17 verschillende assays samen die kunnen worden uitgevoerd in onderzoekslaboratoria om de neuromusculaire functie en activiteit te evalueren op vier belangrijke uitkomsten in C. elegans-ziektemodellen, zowel bij de baseline in een reeks ontwikkelingsstadia en leeftijden als als reactie op kandidaattherapieën (tabel 1 ). Inderdaad, de studie biedt een gedetailleerd overzicht van het scala aan beschikbare experimentele benaderingen om de snelheid van C. elegans thrashing (lichaamsbuigingen per minuut), locomotorische activiteit, faryngeaal pompen en chemotaxis te karakteriseren – in elk geval met vermelding van de gebruikte experimentele en analytische methodologie, de voordelen en beperkingen van elke methode, de apparatuur en software die nodig is om elke test uit te voeren en te analyseren, en de doorvoercapaciteit van elke methode ter ondersteuning van het gebruik ervan voor genetische of drugsscreening met hoge doorvoer. De doorvoercapaciteit van elke test wordt beschreven als laag, gemiddeld of hoog op basis van de complexiteit van het experimentele protocol, inclusief wormonderhoud, verwerkingstijd, het gebruik van enkele of multi-well platen en / of experimenteertijd die nodig is om de experimentele setting en gegevensanalyses te voltooien.

Handmatige analyses van thrashing¹⁹, locomotorische activiteit²⁰, faryngeale^{pompen 17,21}en chemotaxis^22,23 zijn gevestigde methodologieën om wormactiviteit te evalueren die een stereomicroscoop vereisen²⁴. Terwijl het meten van de thrashing-activiteit van wormen analyse in vloeibare media vereist om de frequentie van lichaamsbuigingen per minuut te bepalen, kan de locomotorische activiteit van de worm worden gemeten op vaste media of in vloeibare media. Handmatige analyses van individuele wormactiviteit zijn echter inherent tijdrovend en brengen onvermijdelijke door de gebruiker gegenereerde vooringenomenheid met zich mee. Automatisering van wormactiviteitsanalyses minimaliseert door gebruikers gegenereerde bias en kan de experimentele doorvoer aanzienlijk verhogen²⁵. Video-opnames van worm thrashing activiteit in vloeibare media kunnen worden geanalyseerd met behulp van wrMTrck, een ImageJ plugin²⁶. De oorspronkelijke experimentele instellingen die voor wrMTrck werden ontwikkeld, beperkten echter het nut ervan, omdat te veel wormen in een enkele vloeistofdruppel leidden tot overlapping van wormen die nauwkeurige tracking moeilijk maakten. Hoewel deze experimentele beperking is opgelost²⁷, is de wrMTrck-methode niet in staat om screening met hoge doorvoer te ondersteunen.

Er bestaat een reeks methoden om de locomotorische activiteit van wormen bij baseline en als reactie op kandidaat-therapieën in C. elegans mitochondriale ziektemodellen te kwantificeren. Deze omvatten ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker^28,wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)^29,WormMotel, WormWatcher^30,WormLab^31,Infinity Chip³²en WMicrotracker One³³ (Tabel 1). Deze methoden maken gelijktijdige analyse van voortbeweging in meerdere wormstammen of -omstandigheden mogelijk, meestal op platen met meerdere putten, waardoor screeningstoepassingen voor geneesmiddelen met een hogere doorvoer worden ondersteund. Sommige van deze methoden hebben unieke overwegingen die hun algemene nut kunnen beperken of verbeteren, zoals de behoefte aan dure apparatuur versus open-access software en het variërende gemak van het uitvoeren van experimentele protocollen. Over het algemeen is geen enkel experimenteel systeem of protocol bij uitstek geschikt voor alle experimenten met locomotorische activiteit van C. elegans. Het is eerder belangrijk om zorgvuldig te kiezen welke methode het meest geschikt is voor de experimentele doelen en vereisten van de specifieke onderzoeker.

Faryngeaal pompen vertegenwoordigt een andere belangrijke uitkomst om neuromusculaire activiteit bij C. eleganste beoordelen . De C. elegans farynx bestaat uit 20 spiercellen, 20 neuronen en 20 andere cellen die inname van Escherichia coli (E. coli) aan het voorste uiteinde van het spijsverteringskanaal van de worm mogelijk maken^34,35,36. Er zijn verschillende handmatige methoden vastgesteld om faryngeale pompsnelheden^17,21,37,38te bepalen. De meeste methoden zijn gebaseerd op het gebruik van een stereomicroscoop en camera om de faryngeale pompfrequentie te visualiseren en vast te leggen met directe telling door de experimentele waarnemer²¹. Geautomatiseerde faryngeale pompsnelheidsanalyse is mogelijk door een extracellulaire registratie uit te voeren die elektrofaryngeogram (EPG) wordt genoemd, die aanvullende informatie biedt over de duur van elke pomp³⁹. Faryngeale pompsnelheidsanalyse is ook mogelijk in een microfluïdisch systeem, WormSpa, waar individuele wormen worden opgesloten in kamers^40,41. Een commerciële methode die beschikbaar is om de analyse van de faryngeale pompsnelheid te vergemakkelijken, is het ScreenChip System (InVivo Biosystems), dat de neuromusculaire aspecten van voedingsgedrag meet, visualiseert en analyseert in een enkele worm die is geïmmobiliseerd in een aangepaste chip. Deze faryngeale pompkwantificeringsbenadering kan worden gebruikt om zowel neuronale als fysiologische reacties op geneesmiddelen, veroudering en andere factoren te beoordelen^42,43,44,45.

Chemotaxis beschrijft de beweging van C. elegans als reactie op een geurstof die weg van de wormen wordt geplaatst in een bepaald gebied van de nematode groeimedia (NGM) plaat. Het beoordelen van de chemotaxisrespons biedt een geïntegreerde maat voor neuronale en neuromusculaire activiteit van de worm die kwantificeerbaar is door het observeren en meten van de fysieke afstand die wormen in een bepaalde periode tot de odorant afleggen⁴⁶. De Multi-Worm Tracker is een automatische methode die kan worden gebruikt om de experimentele efficiëntie te verbeteren van het kwantificeren van de afstand die wormen afleggen tot een lokstof of van een afweermiddel⁴⁷.

Hier wordt het gedetailleerde protocol beschreven voor twee nieuwe, semi-geautomatiseerde methoden die zijn vastgesteld voor het kwantificeren van wormactiviteit. De eerste benadering maakt gebruik van ZebraLab, een commerciële software die oorspronkelijk werd ontwikkeld om de zwemactiviteit van Danio rerio (zebravis) te bestuderen, voor een nieuwe toepassing met gemiddelde doorvoer om de totale locomotorische activiteit in vloeibare media van C. elegans te kwantificeren op basis van pixelveranderingen tijdens beweging(tabel 1, figuur 1). Gegevensuitvoer wordt snel verkregen uit een groot aantal gelijktijdige omstandigheden en monsters geanalyseerd op een glasplaat, hoewel deze methode niet geschikt is voor een plaatformaat met meerdere putten. De tweede benadering is een nieuwe aanpassing van de WormScan-methodologie^48,49 ( Figuur2), die een flatbedscanner gebruikt om een differentieel beeld te maken van twee sequentiële scans die variabel kunnen worden gebruikt met open-source software om semi-geautomatiseerde kwantitatieve analyse van geïntegreerde fysiologische uitkomsten zoals vruchtbaarheid en overleving mogelijk te maken. Hier werd een nieuwe high-throughput aanpassing van de WormScan-methodologie ontwikkeld om de locomotorische activiteit van wormen in vloeibare media te kwantificeren in populaties van vijftien larvale stadium 4 (L4) wormen per put van een 96-well, platbodemplaat. Deze semi-geautomatiseerde en goedkope WormScan-methodologie kan gemakkelijk worden aangepast aan geneesmiddelenschermen met een hoge doorvoer, evenals aan analyses van verschillende dierstadia en leeftijden^{van 48,49}jaar.

Hier wordt het protocol en de werkzaamheid van het analyseren van C. elegans locomotorische activiteit met behulp van zowel ZebraLab als WormScan semi-geautomatiseerde methoden aangetoond in een gevestigde C. elegans-model voor mitochondriale complex I-ziekte, gas-1(fc21). gas-1 (gen K09A9.5) is een ortholoog van humane NDUFS2 (NADH: ubiquinon oxidoreductase core (ijzer-zwavel eiwit) subeenheid 2) (Figuur 3). De C. elegans gas-1(fc21) mutante stam draagt een homozygote p.R290K missense mutatie in de menselijke ortholoog van NDUFS2⁵⁰, waardoor de vruchtbaarheid en levensduur aanzienlijk afnemen, verminderde respiratoire keten oxidatieve fosforylering (OXPHOS) capaciteit⁵¹, evenals verminderde mitochondriale massa en membraan potentieel met verhoogde oxidatieve stress^5,8 . Ondanks het gevestigde gebruik in de afgelopen twee decennia om mitochondriale ziekten te bestuderen, werd locomotorische activiteit van gas-1(fc21) mutanten niet eerder gemeld. Hier werden ZebraLab- en WormScan-methoden toegepast om de locomotorische activiteit van gas-1(fc21) onafhankelijk te kwantificeren in vergelijking met wild-type (WT, N2 Bristol) wormen, zowel als een manier om de methoden te valideren als om hun vergelijkende nut en efficiëntie van de experimentele protocollen en informatica-analyses aan te tonen. ZebraLab-software maakte een snelle kwantificering mogelijk van verschillende gelijktijdige omstandigheden van wormlocomotorische activiteit in C. elegans mitochondriale ziektemodellen, met mogelijke toepassing voor gerichte screening of validatiestudies van geneesmiddelen. WormScan-analyse, in het bijzonder, is zeer geschikt om gemakkelijk high-throughput medicijnscreenings van samengestelde bibliotheken mogelijk te maken en prioriteit te geven aan leads die de neuromusculaire functie van dieren en de locomotorische activiteit in preklinische C. elegans-modellen van primaire mitochondriale ziekte verbeteren.