JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

Published: February 05, 2022
doi:
10.3791/62235
, , , , ,
1Physical Sciences Platform,Sunnybrook Research Institute, 2Institute of Biomedical Engineering,University of Toronto, 3Department of Physics,Norwegian University of Science and Technology, 4Department of Clinical Medicine,University of Bergen, 5Exact Therapeutics AS, 6Department of Medical Biophysics,University of Toronto

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם – מוח.

Abstract

מחסום הדם – מוח (BBB) הוא אתגר מרכזי עבור משלוח מוצלח של תרופות למוח. חשיפה לאולטרה סאונד בנוכחות microbubbles הופיע כשיטה יעילה כדי להגדיל באופן חולף ומקומי את החדורות של BBB, להקל על הובלה para-ו transcellular של תרופות ברחבי BBB. הדמיית כלי הים במהלך טיפול אולטרסאונד-microbubble יספק תובנות יקרות וחדשות על המנגנונים והדינמיקה של טיפולים אולטרסאונד-microbubble במוח.

כאן, אנו מציגים הליך ניסיוני למיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית באמצעות חלון גולגולתי מיושר עם מתמר טבעת ועדשה אובייקטיבית פי 20. הגדרת זה מאפשר הדמיה ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה של המוח במהלך טיפולים אולטרסאונד-microbubble. גישה אופטית למוח מתקבלת דרך חלון גולגולת פתוח. בקצרה, חתיכה בקוטר 3-4 מ”מ של הגולגולת מוסרת, והאזור החשוף של המוח אטום עם כיסוי זכוכית. מתמר טבעת 0.82 MHz, המחובר לכיסוי זכוכית שני, מותקן למעלה. Agarose (1% w / v) משמש בין כיסוי של מתמר ואת כיסוי המכסה את החלון הגולגולתי כדי למנוע בועות אוויר, אשר לעכב התפשטות אולטרסאונד. כאשר ננקטים ניתוחים סטריליים ואמצעים אנטי דלקתיים, ניתן לבצע שוב ושוב טיפולים באולטרסאונד-מיקרו-חלוק ומפגשי הדמיה במשך מספר שבועות. מצומדים דקסטרן פלואורסצנטי מוזרקים תוך ורידי כדי לדמיין את כלי הדם ולכומת אפקטים המושרים באולטרסאונד-מיקרו-יבל (למשל, קינטיקה של דליפה, שינויים בכלי הדם). מאמר זה מתאר את מיקום חלון הגולגולת, מיקום מתמר הטבעת, הליך ההדמיה, שלבי פתרון הבעיות הנפוצים, כמו גם את היתרונות והמגבלות של השיטה.

Introduction

אתגר מרכזי לטיפול בהפרעות נוירולוגיות הוא נוכחות מחסום הדם – מוח (BBB). ה- BBB מגביל מולקולות הידרופיליות, טעונות, קוטביות וגדולות (> 400 Da) מלהיכנס למוח parenchyma1. שיטה אחת המשמשת כיום כדי לספק טיפולית על פני BBB לתוך parenchyma המוח היא להשתמש זריקות תוך גולגולת סטריאוטקאט 2. שיטות פחות פולשניות אחרות הנחקרות מעוכבות על ידי המורכבות של הטכניקות המשמשות, כגון תכנון תרופות לאספקה בתיווך קולטן ברחבי BBB3, או מוגבלות בדיוק המרחבי של אזורים ממוקדים, כגון זריקות תוך נאוי4 או ניהול פתרונות היפרוסמוטיים5.

השימוש באולטרסאונד בשילוב עם microbubbles מוזרק באופן שיטתי, סוכן ניגוד אולטרסאונד, פותח כאמצעי לא פולשני כדי להגדיל באופן חולף את החדורות של BBB6. באמצעות מתמר ממוקד7 או מערך שלבים היגוי של מתמרים8,9, אולטרסאונד יכול להיות ממוקד לאזורים נבחרים במוח עם דיוק ברמה מילימטרית, מזעור אפקטים מחוץ למטרה. טיפולים אולטרסאונד-microbubble ניתן להתאים אישית לאנטומיה המוחית של כל נושא באמצעות הדרכת הדמיית תהודה מגנטית7,10,11,12,13,14 או מסגרות סטריאוטקסטיות15. יתר על כן, ניתן לשלוט בזמן אמת בהיקף העלייה בחדירת BBB על ידי ניטור פליטות אקוסטיות ממיקרו-טבלים16,17,18. ניסויים קליניים החוקרים את הבטיחות וההיתכנות של טיפולים אולטרסאונד-microbubble נמצאים כעת בעיצומו ברחבי העולם (למשל, מזהה ClinicalTrials.gov NCT04118764).

טיפולים BBB אולטרסאונד-microbubble מוערכים בדרך כלל על ידי אישור טיפול המושרה עליות חדורות BBB, הדמיה תהודה מגנטית משופרת בניגוד, או על ידי בזבזנות צבע בהדמיית vivo או היסתולוגיה ex vivo. עם זאת, רוב הניתוחים המיקרוסקופיים בוצעו ex vivo, לאחר השלמת טיפולים microbubble אולטרסאונד11,19, ובכך חסר את התגובות הביולוגיות הדינמיות במהלך, ומיד לאחר מכן, חשיפה אולטרסאונד. הדמיה בזמן אמת שנערכה במהלך חשיפה לאולטרסאונד עשויה לסייע בהבנת המנגנונים המניעים טיפולי BBB אולטרסאונד-microbubble כמו גם תגובות במורד הזרם, אשר עשוי להגביר את ההבנה שלנו של היישומים הטיפוליים שלה. יתר על כן, השימוש בחלונות גולגולת כרוניים עם טכניקות הדמיה in vivo יאפשר מחקרים אורך כדי להעריך היבטים זמניים של טיפולים microbubble אולטרסאונד.

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את ההליכים הכירורגיים והטכניים הנדרשים לביצוע הדמיה מולטיפוטית בזמן אמת של טיפולים באולטרסאונד-מיקרו-יבלים למחקרים חריפים וכרוניים במכרסמים (איור 1). זה מושג בשני חלקים: הראשון, כדי ליצור חלון גולגולת כדי לאפשר הדמיית vivo, ושנית, להרכיב מתמר טבעת על גבי כדי לאפשר sonication בו זמנית והדמיה. חלונות גולגולת שימשו בהרחבה על ידי מדעני מוח עבור הדמיה in vivo של צימוד נוירווסקולרי20, β עמילואיד פתוגנזה21, נוירואימונולוגיה22, בין היתר. בפרוטוקול זה, מתוארים הליכים כירורגיים ליצירת חלונות גולגולתיים חריפים (ללא התאוששות) וכרוניים (התאוששות) בעכבר ובגולגולת החולדה. מתודולוגיות חלון הגולגולת, במיוחד עבור ניסויים כרוניים, תועדו היטב23,24,25. כדי יתאים לספרות הקיימת, המונחים ‘חריפה’ ו’כרונית’ ישמשו לאורך פרוטוקול זה. העיצוב של מתמרים טבעת עבור הדמיה in vivo תואר גם בעבר26. למרות הזמינות של טכניקות אלה והתובנות שניתן להשיג מהדמיה בזמן אמת של טיפולים אולטרסאונד-microbubble, יש מעט מאוד מעבדות מחקר שפרסמו בהצלחה ספרות באמצעות טכניקה זו26,27,28,29,30,31,32 . ככזה, בפרוטוקול זה, הפרטים הכירורגיים והטכניים של ביצוע ניסויי אולטרסאונד-microbubble בזמן אמת אלה מתוארים. בעוד הפרמטרים sonication והדמיה שצוינו כבר אופטימיזציה לניסויים BBB, השפעות אחרות של חשיפה אולטרסאונד למוח, כגון neuromodulation33,34, ניטור פלאק β עמילואיד31, ותגובות תאי החיסון32, ניתן לחקור גם באמצעות טכניקה זו.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים הבאים אושרו על ידי ונערך בהתאם לרשות המזון והבטיחות הנורבגית, הוועדה לטיפול בבעלי חיים של מכון המחקר סאניברוק והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. 1. הכנה חומרית הכן את החומרים הדרושים לניתוח חלון הגולגולת וטיפולי אולטרסאונד-microbubble. עבור חלונות גולגולת כרוניים, כלים וחומרים מעוקרים, מרחב כירורגי סטרילי, וניהול תרופות לפני ניתוח נדרשים 23,24,25. הכנת מתמר וכיסוי בדוק את השלמות הפיזית של המתמר: לחפש סדקים שקעים. ודא שהאלקטרודות בחלק העליון והצד של המתמר לא נפגעו. הפקדת דבק ציאנואקרילט לצלחת קטנה. השתמש אפליקטור כדי להפיץ שכבה דקה של דבק על פני השטח של המתמר. מניחים את המתמר על מכסה הזכוכית. לחץ למטה בחוזקה במשך 20-30 s.הערה: ניתן להשתמש בתבנית בהדפסה תלת-ממדית כדי להקל על היישור של כיסוי הזכוכית עם מתמר הטבעת, מה שמבטיח לחץ מוצק ואפילו על כיסוי ומתמר הטבעת (איור 2). בדוק אם יש בועות בין המתמר לכיסוי. אם יש בועות, לקחת את כיסוי ולחזור על שלב 1.2.3., כמו אוויר מונע התפשטות אולטרסאונד. לרפא לילה בטמפרטורת החדר. לאחר דבקות בכיסוי זכוכית, התאימו את המתמר (איור 3).הערה: פרוטוקול זה משתמש במתמר טבעת טיטאנאט עופרת מתוצרת הבית (קוטר חיצוני של 10 מ”מ, עובי 1.4 מ”מ, גובה 1.2 מ”מ)35, המותאם ל-50 Ω עבלה ועומס פאזה של 0° עם מעגל התאמה מותאם אישית. המתמר מונע במצב עובי של 0.82 מגה-הרץ, ומייצר נקודת מוקד מעגלית כ-1 מ”מ מתחת לכיסוי. מתמרים טבעת של תכונות דומות (קוטר חיצוני 10 מ”מ, עובי 1.5 מ”מ, 1.1 מ”מ גובה) התאפיינו26 בשימוש נרחב עבור ניסויים מיקרוסקופיים מולטי פוטון27,28,29,31,32,36. מתמר שימוש חוזר והחלפה של כיסוי החלף את כיסוי אם הוא סדוק או יש פסולת (למשל, פרווה, דבק) מהניסוי הקודם. כדי להסיר את כיסוי, להמיס את הדבק על ידי טביעת המתמר וכיסוי אצטון במשך 20 דקות.הערה: אצטון עשוי להשפיע על שלמות המתמר ו/או האלקטרודות. פנה ליצרן לפני שתמשיך בשלב זה. בדוק אם האצטון מומס הדבק על ידי משיכה בעדינות על כיסוי עם מלקחיים. יש לבדוק אחת לעשר דקות כדי להימנע מחשיפה ממושכת לאצטלון. 2. הכנת בעלי חיים מרדים את החיה באמצעות תערובת של אוויר רפואי, חמצן ואיזופלוראן בתא אינדוקציה.הערה: השימוש בחמצן כגז נושא דווח להשפיע על מחצית החיים של microbubbles37,38 ולהפחית את הגודל של אולטרסאונד-microbubble המושרה עליות חדור BBB27, אבל עשוי גם להפחית את הסיכון של היפוקסיה ותמותה39. בחר גזי נושא על סמך מטרות הפרויקט וייעוץ וטרינרי. הרדמה להזרקה כגון קוקטייל קטמין / קסילסין ניתן להשתמש גם; עם זאת, קל יותר לשלוט במישור של הרדמה ורמות חמצן בדם בעת שימוש בהרדמה בשאיפה. בדוק כי החיה השיגה מישור מספיק של הרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן. שקול את החיה כדי לקבוע את המינון של dextran, microbubbles, ותרופות לנהל. מוציאים את הפרווה מראש החיה ומניחים את החיה על מסגרת סטריאו-אקטית. עבור ניסויים חריפים, יש להקים גישה למחזור המערכתי עבור זריקות דקסטרן ומיקרו-יבל. כדי להשיג זאת, הכנס קטטר 27 גרם לתוך וריד זנב.הערה: בעוד זריקות רטרו-מסלולית אפשריות גם, ורידים זנב מומלץ בשל מרחב העבודה המוגבל באזור הראש במהלך הדמיה multiphoton. מעבירים את החיה למסגרת הסטריאו-טסטרואטקטית ומעבירים את ההרדמה לקונוס האף. שמור על טמפרטורת הליבה של החיה של 37 °C (37 °F) באמצעות מקור חום, כגון כרית חימום או כפפה מלאה במים חמים. נטר את טמפרטורת בעלי החיים באמצעות בדיקה רקטלית, ופיזיולוגיה של בעלי חיים באמצעות אוקסימטר דופק. יש למרוח משחה עיניים. הזרק תרופות מתאימות למכיכת מעיים לפני הניתוח ו/או אנטי דלקתיות (ראה טבלת חומרים). לפני תחילת ניתוח חלון הגולגולת, בדוק את מישור ההרדמה ואת קצב הלב של החיה, רוויית O2 , קצב הנשימה והטמפרטורה. כדי להתחיל את ניתוח חלון הגולגולת, להסיר את הפרווה על הראש על ידי החלת קרם depilatory ו / או באמצעות קוצץ פרווה. הסירו את הפרווה בין העיניים לחצי האחורי של הצוואר (איור 4A).הערה: מגע ממושך עם קרם depilatory ישרוף את העור. לניתוחי חלון גולגולת כרוניים, יש לשטוף את הקרקפת עם מגבונים מתחלפים של בטדין ו-70% EtOH לאחר הסרת פרווה. הכן את המרחב הכירורגי לניתוח סטרילי. סטריליות חייבת להישמר עד שלב 2.15. כדי להסיר את הקרקפת, להרים את העור בין העיניים באמצעות מלקחיים המוחזקים ביד הלא דומיננטית, לאורך התבל הקשת. בעזרת מספריים מעוקלות, הסירו את העור כדי לחשוף את העצמות הקודקודיות (איור 4B). החל לחץ מוצק עם צמר גפן אם יש דימום מהגולגולת או הקרקפת; יש לעצור את הדימום לפני התקדמות לשלב הבא.הערה: עבור ניתוחים חריפים, העור יכול להיות דחף בחזרה ודבק בגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט נוזלי או דבק רקמה. הסר את periosteum המכסה את פני השטח החיצוניים של הגולגולת באמצעות צמר גפן. באמצעות מיקרוסקופ הפעלה (6-25x) ומקדחה דנטלית (0.5 מ”מ מקדחה בר, מהירות בינונית), קווי המתאר עיגול על עצם הקודקוד כדי לסמן את המיקום הרצוי של החלון הגולגולתי על הגולגולת (איור 5). הימנעו מתבל הקשת, למבדה וברזמה, שכן אזורים אלה דקים יותר ומשטחים כלי דם גדולים.הערה: כדי להקל על הקידוח, ניתן לצייר קו מיתאר של חלון הגולגולת על הגולגולת באמצעות סמן וסטנסיל (איור 5A). עבור חולדות, זה עשוי להיות קל יותר לקדוח מלבני, במקום חלון עגול, גולגולתי. בשל עובי עצם גולגולת החולדה, השתמש במקדחה של 0.7 מ”מ כדי לתאר את החלון הגולגולתי בעצם הקומפקטית לפני השימוש במקדח 0.5 מ”מ כדי להשלים את תהליך הקידוח. החל לחץ עדין עם מקדחה; לחץ מוגזם מגביר את הסיכון לגרימת נזק לרקמת המוח. כדי למנוע מהגולגולת להתחמם יתר על המידה במהלך הקידוח, טפטפו תמיסת מלח על הגולגולת באמצעות מזרק, או החל פיסת ספוג כירורגי ספוג מלוח. לסירוגין בין קידוח וקירור הגולגולת עד אי העצמות וכתוצאה מכך נפרד משאר הגולגולת. בדוק את התקדמות הקידוח על ידי הפעלת לחץ עדין על אי העצם באמצעות מלקחיים או מקדחה. המשיכו לקדוח עד שאי העצמות ייפרד משאר הגולגולת.הערה: סדקים קטנים באזורים הדקים ביותר של הגולגולת הם אינדיקציה טובה לכך שהקידוח כמעט הושלם. ניסיון להסיר את אי העצם בטרם עת יכול לגרום לחתיכות עצם לחדור לתוך רקמת המוח, לפגוע בדורה ולגרום לדלקת ודימום. הסר את אי העצמות באמצעות זוג מלקחיים עדינים כדי לתפוס את הקצוות, או את שכבת העצם הקומפקטית העליונה, של אי העצמות (איור 6A). ודא כי המוח נשמר לח על ידי החלת חתיכת ספוג כירורגי כי כבר ספוג מראש מלוחים. אם נצפתה דימום, הנח את הספוג הכירורגי על האזור המדמם. אל תמשיך לשלב הבא עד שהדמם ייפסק.הערה: אם הדימום נמשך לאחר 5 דקות, לא ניתן להשתמש בחיה לניסויי הדמיה רב-פוטונים. עבור חולדות, ייתכן שיהיה צורך להסיר את הדורה אם הוא עבה. כדי להסיר את הדורה, השתמש בהגדלה גבוהה על המיקרוסקופ התפעולי וזוג מלקחיים עדינים. כדי למקם חלון גולגולתי, להרים כיסוי זכוכית עם זוג מלקחיים, מניחים טיפת תמיסת מלח על צד אחד, ולתמרן אותו מעל החור בגולגולת. ודא שאין בועות אוויר מתחת לכיסוי.הערה: השתמש כיסוי זכוכית 5 מ”מ לעכברים, ו 8 מ”מ עבור חולדות. עבור חולדות, בשל עובי עצם הגולגולת, להשתמש בתמיסת agarose במקום מלוחים כדי למלא את החלל בין כיסוי למוח. ניתן גם לדבוק ישירות בגולגולת במתמר ובכיסוי שלו, במקום להשתמש בכיסוי נפרד לחלון הגולגולת. עבור אפשרות זו, המשך לשלב 3.1. עיין באיור 1 לקבלת פרטים. פזירי שכבה של דבק ציאנואקרילט סביב היקף כיסוי הכיסוי (איור 6B) כדי לחבר אותה לגולגולת. ודא שאין דבק מתחת לכיסוי. יש להפעיל לחץ על כיסוי כדי להבטיח שהדבק לא בא במגע עם המוח. ברגע שהדבק יבש לחלוטין, אפילו מחוץ לפני השטח של הדבק באמצעות המקדחה הדנטלית. ודא שכל פסולת הדבק מוסרת מהאזור הכירורגי.הערה: עבור חלונות גולגולת כרוניים, הזריקו את התרופות הפוסט-כירורגיות הדרושות (ראו טבלה של חומרים), ספקו משחה לטיפול בפצעים ומזון רך, ושחזרו את החיה תחת מנורת חום. 3. מיקום מתמר הטבעת הכן את פתרון אגרוז 1% (w/v). בבקבוק קטן או ארלנמאייר, מוסיפים 0.1 גרם של אגרוז ו-10 מל של PBS (1x) או תמיסת מלח. מרתיחים את התמיסה עד שהאגורוז נמס לחלוטין על ידי הנחת הכוס על כיריים או חימום התמיסה במיקרוגל (30-45 s). שלבים 3.2-3.5 רגישים לזמן כאשר תמיסת אגרוז מתקררת במהירות. לסגת ~ 0.5 מ”ל של אגרוז לתוך מזרק 1 מ”ל.הערה: כדי להגן על שלמות המוח, ודא כי הטמפרטורה של agarose משוער טמפרטורת הגוף לפני השימוש. הפקד את האגרה בנדיבות על כיסוי החלון הגולגולתי.הערה: אם הרקמה בוערת, הטמפרטורה של האגרוז הייתה גבוהה מדי; החיה חייבת להיות מורדמת. אם אין כיסויים נפרדים המכסים את המוח (כלומר, המתמר וכיסוייו ממוקמים ישירות על המוח, ראה שלב 2.14), אז agarose צריך להיות מופקד על פני השטח של המוח בשלב זה. הניחו את המתמר מעל חלון הגולגולת (איור 6C). החל לחץ מוצק כך שיש אגרוז מינימלי בין המתמר לחלון הגולגולת. ודא כי המתמר מרוכז (XY-plane) ומקביל (Z-plane) לחלון הגולגולת, וכי אין בועות אוויר באגרוז. כאשר האגורוז התקרר לעקביות דמוית ג’לי, חתוך עודף אגרוז מהיקף כיסוי המתמר באמצעות מרית או אזמל. ודא שאין בועות אוויר מתחת לכיסוי של המתמר. באמצעות מרית, להפיץ שכבה של דבק ציאנואקרילט על היקף כיסוי המתמר, המשתרע על הגולגולת, כך המתמר הוא דבק בחוזקה בגולגולת. לשמור על לחץ מוצק על המתמר עד הדבק התייבש לחלוטין (10-15 דקות). 4. הדמיית מיקרוסקופיה מולטיפוטנית מקם את החיה מתחת לעדשה האובייקטיבית (איור 7A). ודאו שהעדשה האובייקטיבית מרוכזת במתמר הטבעת, ובמקביל עם המתמר (איור 7B). אם נעשה שימוש בעדשה אובייקטיבית של טבילת מים, מלאו את מרכז מתמר הטבעת במים דה-תיוניים ומנוטרלים.הערה: מים ללא גיסות חשובים להפצת אולטרסאונד נכונה. התחל עם העדשה האובייקטיבית במקומה הגבוה ביותר, ולאחר מכן הנמך לאט לאט את העדשה האובייקטיבית עד שהיא נמצאת בתוך מתמר הטבעת (איור 7A, B). ודא כי עדשה אובייקטיבית אינה מתנגשת עם מתמר או כיסוי.הערה: החליפו בין העין כדי לבדוק אם מיקום Z של העדשה האובייקטיבית הוא בתוך המישור עם פני השטח של המוח, ועל ידי העין כדי להבטיח כי העדשה האובייקטיבית אינה מתנגשת עם מתמר או כיסוי. ייתכן שיהיה קל יותר לדמיין את כלי הפיאל דרך העין לאחר הזרקת דקסטרן פלואורסצנטי דרך וריד הזנב (איור 7C). הכן את המיקרוסקופ המולטי-פוטוני להדמיה.הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ מולטי-פוטוני זקוף ועדשה אובייקטיבית של 20-25x בעלת מרחק עבודה של 2 מ”מ, אשר מספיק כדי להתמקד מעבר לכיסויים( ים), לתוך פרנשימה במוח. הכן את ההסתה. הוסף את הכמות המתאימה של PBS למבצע של dextran, בהתאם להוראות היצרן. מערבולת את פתרון dextran במשך 1-3 דקות כדי להבטיח כי אבקת dextran מומס לחלוטין. הזריקו את תמיסה דקסטרן לתוך הווריד הזנב. הגדרת סריקת תמונה באמצעות העינים, ודא כי העדשה האובייקטיבית מקבילה למוח. הטה את החיה כדי לתקן עבור XZ ו YZ אי התאמה. בחר שדה תצוגה במיקרוסקופ מולטי-פוטוני. הגדר סריקת XYZ לפני חשיפה לאולטרסאונד כדי לקבל תמונה בסיסית של כלי ההשחתה לפני חשיפה לאולטרסאונד.הערה: פרמטרי הדמיה אופייניים הם כדלקמן: 300-800 מיקרומטר לעומק, 2-5 מיקרומטר גודל צעד, ו 10-20 ערימות זמן. ודא כי העדשה האובייקטיבית אינה באה במגע עם המתמר או כיסוי בנקודה הנמוכה ביותר שלה במהלך רצף ההדמיה. 5. חשיפה לאולטרה סאונד ודא שכל כבלי ה-BNC מחוברים כראוי (איור 3). הגדר סריקת תמונה XYZT כי הוא מספיק זמן כדי ללכוד ערימות תמונה לפני, במהלך, ואחרי טיפולים microbubble אולטרסאונד. הכן את המיקרו-בועות על-ידי ביצוע הוראות היצרן. הזריקו את המיקרו-יבלים לווריד הזנב והתחילו בהדמיה.הערה: זריקות Microbubble ניתן לעשות עם משאבת עירוי כדי להבטיח קצב הזרקה עקבי כדי לאפשר הזרקת microbubble בו זמנית והדמיה. אם יש להזריק מיקרו-יבלות במהלך ההדמיה, ודא שניתן לגשת לווריד הזנב בקלות מבלי לחשוף את הגלאים לאור הסביבה. התחל sonication.הערה: פרמטרי sonication טיפוסי הם כדלקמן: מחזורי 10 ms, אינדקס מכני של 0.2-0.4, ותדרי חזרה דופק בין 1-4 הרץ. Sonication ו microbubble פרמטרים המשמשים מחקרים פרה-קליניים אולטרסאונד-microbubble נחקרו בהרחבה מתועדים היטב בספרות (למשל. ראה 40 לסקירה). המשך הדמיה מולטיפוטנית לאורך כל sonication ולאחר סיום sonication. להיות שומר מצוות עבור דקסטרן extravasation מכלי הדם, כמו זה מעיד על עליות חמינות BBB.הערה: אם dextran מזוהה בחלל החוץ כלי הדם, אבל בשולי שדה הראייה, אז ייתכנו כלי דם מושפעים מחוץ לשדה הראייה. זה יכול לנבוע מאי-התאמה של המתמר עם המוקד של העדשה האובייקטיבית. בתרחיש זה, קל יותר להתאים את שדה הראייה על ידי הזזת העדשה האובייקטיבית או על ידי מיקום מחדש של החיה, מאשר ליישר מחדש את המתמר. לאחר השלמת ההדמיה, להרדים את נקע צוואר הרחם של בעלי החיים תחת הרדמה עמוקה או חנק CO2 . עבור חלונות גולגולת כרוניים, להפיץ שכבה של מלט דנטלי על הגולגולת החשופה.הערה: עבור חלונות גולגולת כרוניים, העור המקיף את החלון יכול להיות תפירה, אם כי זה לא הכרחי, בשל הסרת הקרקפת בשלב 2.8. 6. ניתוח תמונה יצא ערימות תמונה. לנתח תמונות עם תוכנת ניתוח תמונה (למשל, אולימפוס פלואווויו, ImageJ / FIJI, ביטפלן אימריס, תרמופישר מדעי אמירה) ו / או כלי תכנות (למשל, פייתון, MATLAB).

Representative Results

ניתן לזהות טיפולים מוצלחים באולטרסאונד-מיקרו-חלוק על ידי ההרחבה של דקסטרן פלואורסצנטי מהרחם התוך-וסקולרי לחלל החוץ-וסקולרי (איור 8), מה שמצביע על עלייה בחדירה ל-BBB. בהתאם לשדה הלחץ של מתמר הטבעת, כלי pial ו / או נימים יושפעו. כדי להעריך את השינויים בכלי הדם הנגרמים על ידי טיפולים אולטרסאונד-microbubble, הקוטר של כלי העניין ניתן למדוד לפני, במהלך, ואחרי טיפול microbubble אולטרסאונד (איור 9). ניתן לעשות זאת באופן ידני בתוכנה זמינה מסחרית (למשל, תוכנת אולימפוס פלווויו). במהלך רכישת תמונה, זריקות בולוס דקסטרן וסריקות קו יכול לשמש גם כדי להעריך את זרימת הדם30,41. כדי להעריך את הקינטיקה של דליפה dextran כמודל מייצג לאספקת תרופות, ניתן להעריך את עוצמת האות בין החללים התוך-וסקולריים באמצעות כלים כגון MATLAB26,27,29,41 (איור 10). עיבוד תמונה נוסף ניתן להשיג באמצעות ImageJ / FIJI. ImageJ/FIJI היא תוכנת קוד פתוח התואמת ל- MATLAB ומתאימה היטב לביצוע ניתוחים נפוצים בניתוח תמונה ביולוגית, כגון מדידת שינויים בכלי הדם, או אורך או מרחק בין אובייקטים פלואורסצנטיים (למשל, לוחות β עמילואיד לכלי הדם). צינורות עיבוד תמונה שנוצרו ב- ImageJ/FIJI ניתנים לאוטומטיים על-ידי כתיבת פקודות מאקרו מותאמות אישית. ניתן להשיג ניתוחים מורכבים יותר, כגון פילוח תלת-ממדי של כלי דם ומעקב אחר תאים, באמצעות תוכנה מתקדמת ואוטומטית למחצה (איור 11). לאחר פילוח, ניתוחים ספציפיים יותר יכולים להתבצע, כגון סיווג כלי הדם כמו arterioles, venules, או נימים, בהתבסס על קוטר, הסתעפות, דפוסי טורטואוזיות, כיוון זרימה42,43. אלגוריתמים של למידת מכונה פותחו גם כדי להפוך את פילוח כלי הדם לאוטומטי22,44. איור 1: זרימת עבודה כללית של ניסויים מוחיים אולטרסאונד-microbubble מולטי-ויטמין תוך-ויאטוני. זרימת עבודה כללית של ניסויי המוח המולטי-אופן המולטי-אופן-מיקרו-נבל המתוארים בפרוטוקול זה מוצגת. ישנם 6 שלבים: (א) הכנה לבעלי חיים עבור (A1) עכברים ו-(A2) חולדות, (B) הזרקת דקסטרן, (C) הזרקת Microbubble, (D) הדמיה טרום טיפול, (E) טיפול והדמיה, (F) הדמיה לאחר טיפול וניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: חתך רוחב ותצוגה עליונה של תבנית בהדפסה תלת-ממדית. (א) חתך רוחב של התבנית. שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט מוחלת על המשטח העליון של מתמר הטבעת, וכיסוי מונח על גבי. חותמת עשויה לשמש כדי להחיל מוצק, אפילו לחץ על כיסוי מתמר טבעת. (ב) מבט עליון של התבנית. חריץ ניתן להוסיף בתבנית כדי להקל על הסרת מתמר מוכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הגדרת אולטראסאונד. חומרה אופיינית לניסויי אולטרסאונד מוצגים. פרמטרי אולטרסאונד מוגדרים ומופעלים על ידי מחולל האות ומוגברים על ידי המגבר. ניתן להשתמש במד כוח כדי להקליט קדימה ולשקף כוחות לפני שליחת האות לתיבה התואמת, המותאמת למתמר. כל החיבורים מושגים באמצעות כבלי BNC אלא אם צוין אחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: אזור הסרת הפרווה והסרת הקרקפת. (א) הסרת פרווה צריכה להתחיל בין העיניים ולהשתרע עד לחצי הצוואר. (B) הסרת הקרקפת צריכה להספיק כדי לחשוף את העצמות הקודקודיות. יש לעצור את הדימום לפני שתמשיך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: קווי המתאר של חלון הגולגולת. חלון הגולגולת ממוקם על עצם הקודקודית. (א) ניתן לצייר קו מתאר של חלון הגולגולת על הגולגולת כדי לסייע בתהליך הקידוח. (B) ניתן לראות את קווי המתאר של חלון הגולגולת לאחר קידוח דרך העצם הקומפקטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: חלון הגולגולת ויישור המתמר. (א) החלון הגולגולתי נוצר על עצם הקודקודית. אי העצמות הוסר, חושף את המוח מתחת. (B) חלון הגולגולת הושלם כאשר כיסוי זכוכית אטום על הגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט. (ג) המתמר מרוכז בחלון הגולגולת ודבק באמצעות דבק ציאנואקרילט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: מיקום עדשה אובייקטיבית ומתמר. (A,B) העדשה האובייקטיבית מרוכזת במתמר הטבעת. (C) כלי דם מלאים בדקסטרן פלואורסצנטי נראים דרך העינים, תחת אפיפלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: תמונות מולטי-פוטוניות הקרנה מקסימליות של אולטרסאונד-microbubble המושרה עליות חדורות BBB. תמונות הקרנה מקסימליות של כלי כלי נווה (A) לפני ו-(B) לאחר טיפולים אולטרסאונד-microbubble. טיפולים מוצלחים אולטרסאונד-microbubble ניתן לאשר על ידי התבוננות בעליות חדור BBB לאחר הטיפול, הדמיה כמו אקסטרציה dextran פלואורסצנטי (חצים). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: ניתוח של vasomodulation המושרה על ידי טיפולים אולטרסאונד-microbubble. תמונות הקרנה מקסימליות של כלי דם מוחיים לפני, במהלך ואחרי טיפולים microbubble אולטרסאונד. מיקרו-יבלים נמצאים בכל התמונות. בהשוואה (A) תנאי טרום טיפול, vasomodulation ברור ניתן לראות (B) במהלך טיפולים אולטרסאונד-microbubble (חצים אדומים). עליות אולטרסאונד-microbubble בתיווך חמיצות BBB ניכרים גם בעקבות טיפול מדליפת דקסטרן פלואורסצנטי מן כלי הדם אל החלל החוץ כלי הדם (חצים צהובים). (C) כאשר אולטרסאונד כבוי, קטרי כלי הדם לחזור טרום טיפול, גדלים בסיסיים. (D) ניתן לנתח שינויים בכלי הדם על ידי התוויית הקוטר של כלי העניין לפני, במהלך ואחרי טיפול אולטרסאונד-microbubble. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר (עבודה שלא פורסמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 10: ניתוח של קינטיקה דליפה בעקבות טיפולים אולטרסאונד-microbubble. עלייה בחמיצות BBB הוא דמיון כמו דליפה של dextran פלואורסצנטי מן תוך כלי הדם למרחב החוץ וסקולרי. שינויים חדור BBB ניכרים בעת השוואת ערימות תמונה שנרכשו (A) לפני ו (B) לאחר טיפולים אולטרסאונד-microbubble. (C) ניתן לנתח קינטיקה של דליפה על ידי מעקב אחר העוצמה, הנפח והמהירות של דקסטרן בתאים חוץ-וסקולריים (מלבן צהוב). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר (עבודה שלא פורסמה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 11: פילוח כלי הדם של ערימת XYZ מיקרוסקופית מולטי-פוטונית. (A) ערימת עומק (XYZ) של כלי דם בחולדה מהונדסת EGFP. כלי הדם דמיינו באמצעות הזרקה תוך ורידי של פלורסנט טקסס אדום 70 kDa dextran (אדום). הערוץ הירוק מראה תאים פלואורסצנטיים ופלואורספלציה של רקמות. (B) שחזורים תלת-ממדיים של כלי הדם נוצרים, ולאחר מכן מקודדים בצבע בהתאם לסוג כלי הדם כדי להקל על ניתוחים ספציפיים לסוג. ורידים/venules הם כחולים, עורקים / arterioles הם אדומים, נימים הם ציאן. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. שחזורים שנוצרו באמצעות ביטפלן אימריס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ניטור מיקרוסקופיה מולטיפוטונית תוך-וינטלית של המוח הוא כלי בעל ערך לחקר תגובות המוח במהלך חשיפה לאולטרסאונד. למיטב ידיעתנו, הפרוטוקול המתואר כאן הוא השיטה היחידה לניהול הדמיה מיקרוסקופית מולטיפוטנית של פרנשימה במוח במהלך טיפולים אולטרסאונד-microbubble. יצירת חלונות גולגולתיים ושימוש במתמרים טבעתיים מאפשרים ניטור בזמן אמת של כלי דם, תאיים ותגובות אחרות במורד הזרם לטיפולי אולטרסאונד-microbubble ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. קבוצות אחרות ביצעו הדמיה מיקרוסקופית מולטי-פוטונית לאחר השלמת טיפולי אולטרסאונד-microbubble, ובכך חסר את התגובה בזמן אמת של פרנשימה המוח לטיפולים19. ההליך המתואר מציע שליטה זמנית משופרת, המאפשר איסוף נתונים שעשויים לסייע להאיר את המנגנונים החריפים מאחורי טיפולים אולטרסאונד-microbubble. נתונים כמותיים ואיכותיים ניתן לחלץ ולנתח מערימות התמונה שנרכשו, כגון קינטיקה extravasation27,29,30, שינויים β עמילואיד פלאק volume31, ודינמיקת תאים32.

מספר שלבים לפתרון בעיות הודגשו לאורך הפרוטוקול. ראשית, הודגשו צעדים כירורגיים רגישים במיוחד לשגיאת מפעיל, כגון שימוש באגרוז במהלך ניתוח חלון הגולגולת ומיקום המתמר. כמו כן, סופקו צעדים למניעת אי נוחות ומוות של בעלי חיים, לרבות ניטור פיזיולוגיה של בעלי חיים במהלך הניתוח, ומערבולת יסודית של ה- dextran לפני ההזרקה. שנית, מפרטים פיזיים של המתמר, ויישור העדשה האובייקטיבית, מתמר וחלון הגולגולת, הודגשו גם הם. המפרט של מתמר הטבעת ומאפייניו האקוסטיים חייב להיקבע בהתחשב בעדשה האובייקטיבית המשמשת כמו גם את מודל החיה. באופן ספציפי, הקוטר הפנימי של מתמר הטבעת חייב להיות גדול מספיק כדי להקיף את העדשה האובייקטיבית, אבל קטן מספיק כדי להיות מותקן בבטחה על הגולגולת של החיה. בנוסף, אזור המוקד של המתמר חייב ליישר קו עם טווח העדשה האובייקטיבית המשמשת.

אתגר נפוץ הוא כי החלון הגולגולתי מתמר הטבעת הם בזווית יחסית לעדשה האובייקטיבית. מיקוד נכון (XY) ויישור (Z) של העדשה האובייקטיבית עם חלון הגולגולת והמתמר מבטיחים שאזור המוקד של המתמר, וכך אזור רקמת המוח המטופלת, יתיישר עם שדה הראייה של ההדמיה, ויפחית את הסיכון להתנגשות בין העדשה האובייקטיבית לבין המתמר במהלך ההדמיה. יישור ניתן להשיג על ידי התאמת מיקום הראש של החיה ו / או על ידי סיבוב המסגרת סטריאוטקטית שבה הוא קבוע.

יש לבחור רכיבי מיקרוסקופ (למשל, גלאים, מפצלי קרן) ופרמטרים של רכישת תמונה על בסיס מטרת המחקר. כאן, עדשה אובייקטיבית עם אורך מוקד ארוך (> 2 מ”מ) משמשת בשל נוכחותם של כיסויים(ים) ומתמר טבעת הממוקם בין העדשה האובייקטיבית למוח. מיקרוסקופ זקוף מומלץ גם מכיוון שהוא מאפשר יותר מקום לתמרן את החיה, במיוחד לניסויים במוח. כדי ללכוד את הקינטיקה של אולטרסאונד-microbubble המושרה דליפה של צבע תוך כלי דם, רזולוציה זמנית גבוהה היא חיובית, אשר ניתן להשיג באמצעות מערכת סריקת תהודה. שילוב זה עם מערכת זיהוי רגישות גבוהה, כגון גלאי פוספיד ארסניד גליום (GaAsP), יביא גם תמונות חיוביות יותר.

להליך הניסיוני שהוצג יש מספר מגבלות. ראשית, ההליך הכירורגי הוא פולשני למדי, ודווח כי הוא גורם לדלקת45, אם כי ניתן למזער את הדלקת46. יתר על כן, תגובות חיסוניות הנגרמות על ידי ניתוחי חלון הגולגולת נצפו לפתור על ידי 2-4 שבועות לאחר ניתוח23,24,25. בנוסף, תהליך הקידוח, במיוחד כאשר הוא מתנהל בעוצמה או במהירות מופרזת, עלול לגרום נזק לרקמה הבסיסית עקב יצירת חום, רטט ולחץ המופעלים. ניתוחי חלונות גולגולתיים והדמיה מולטי-פוטונית נצפו גם להשפיע על טמפרטורת המוח47. מגבלות אלה ניתן להפחית במידה מסוימת באמצעות יצירה זהירה של חלונות גולגולת בתוליים, התאוששות נכונה של בעלי חיים עם חלונות גולגולת כרוניים, ותחזוקה של טמפרטורת הגוף נורמוטי באמצעות מקור חימום עם בקרת משוב. שנית, עומק ההדמיה מוגבל על ידי המיקרוסקופ והעדשה האובייקטיבית המשמשת. לדוגמה, ההשפעה של טיפול microbubble אולטרסאונד במבנים מוחיים עמוקים יותר, כגון ההיפוקמפוס, לא ניתן ללמוד ללא אמצעים פולשניים יותר, כגון הסרת רקמה קליפת המוח overlying48, או שימוש microlenses בשילוב עם חדירה קליפת המוח49. שימוש בעדשה אובייקטיבית עם מרחק עבודה ארוך יכול לפתור בעיה זו במידה מסוימת, אך חדירת אור מוגבלת גם בעומקים גדולים יותר.

בעוד התמונות המייצגות של פרוטוקול זה נרכשו מכרסמים מסוג בר, ההליך הניסיוני המוצג יכול להיות מיושם גם על בעלי חיים מהונדסים ומודלים למחלות, כגון מחלת אלצהיימר31. ניסויי אולטרסאונד שאינם קשורים אפנון BBB, כגון neuromodulation המושרה אולטרסאונד, ניתן גם לפקח באמצעות פרוטוקול זה33,34. ניתן להשיג יישומים אפשריים אחרים באמצעות הגדרות מיקרוסקופ או גלאי שונות, כגון שיוך מיקרוסקופ קונפוקלי למצלמה במהירות גבוהה במיוחד50. בעוד פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיה גרועות יחסית במיקרוסקופים קונפוקליים בשל נפח העירור הגדול, הדמיה במהירות גבוהה במיוחד עשויה לאפשר הדמיה חזותית של אינטראקציות תא-מיקרו-נבל נימי במוח עם רזולוציה זמנית גבוהה, אשר יכול להאיר עוד יותר את המנגנונים המניעים טיפולי BBB אולטרסאונד-microbubble. לסיכום, הפרוטוקול המתואר מספק שיטה לניטור השפעות כלי דם ותאיות הנגרמות על ידי ניסויי BBB אולטרסאונד-microbubble בזמן אמת, מתן כלי כדי לקבוע עוד יותר את המנגנונים המניעים טיפולים אלה, כמו גם מאיר את התגובות במורד הזרם של פרנצ’ימה המוח לטיפולים אולטרסאונד-microbubble.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

דיור של בעלי החיים סופק על ידי מתקן הליבה לרפואה השוואתית (CoMed, NTNU). איור 3 נוצר בשנת BioRender.com. הקלטת וידאו ועריכה נעשתה על ידי פר הנינג, מנהל אתר בפקולטה למדעי הטבע ב NTNU. הפרויקט מומן על ידי האוניברסיטה הנורבגית למדע וטכנולוגיה (NTNU, טרונדהיים, נורבגיה), מועצת המחקר של נורבגיה (RCN 262228), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (FDN 154272), המכון הלאומי לבריאות (R01 EB003268) ויו”ר טמרטי במחקר אולטראסאונד ממוקד במרכז מדעי הבריאות סאניברוק.

Materials

Ring transducer placement
Agarose (powder) Sigma-Aldrich A9539
Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml) VWR 213-0462 or 214-1130
Cyanoacrylate glue (gel) Loctite 1363589
Glass coverslips (13 mm) Thermo Fisher Scientific CB00130RA120MNT0 Coverslip for ring transducer.
Hot plate or microwave Corning PC-400D To heat agarose solution.
PBS (1X) Sigma-Aldrich P4417
Ring transducer Custom-made Custom-made Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518
Rubber stopper VWR 217-0867
Animal preparation and drugs
Bupivacaine*A Aspen 169912 Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site.
Buprenorphine*A Indivior 521634 Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery.
Buprenorphine*A Indivior 521634 Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c..
Carprofen*C Pfizer DIN 02255693 Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery.
Depilatory cream Veet N/A For complete fur removal after trimming.
Dexamethasone*C Sandoz DIN 00664227, 2301 Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery.
Enrofloxacin*C Bayer DIN: 02249243 Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery.
Fur clippers Aesculap 90200714 Exacta/Isis.
Heating pad Physitemp Instruments INC HP-1M
Isoflurane Baxter ESDG9623C Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic.
Meloxicam*A Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH 25388 Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery.
Meloxicam*A Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH 25388 Dose rat: 1 mg/kg, s.c.
Pulse oximeter STARR Life Sciences Corp N/A MouseOx.
Stereotaxic frame Kopf Kopf 900
Sterile ophthalmic ointment Théa 597562 Viscotears.
Tail vein catheter (24 G) BD Neoflon 391350
* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified.
Material and equipment for cranial window placement
Alcohol swabs BD 326895
Curved fine surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Cotton or fibreless swabs Chemtronics CX50
Cyanoacrylate glue (gel) Loctite 1594457 (gel), 230992 (liquid) If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder.
Dental cement Lang Dental Jet Set-4 Denture Repair Package
Dental micromotor hand drill FOREDOM K.1070-2 High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet.
Forceps Fine Science Tools 11152-10, 11370-40
Glass coverslips Thermo Fisher Scientific CB00050RA120MNT0 (5 mm) Mouse cranial windows.
Glass coverslips Thermo Fisher Scientific CB00080RA120MNT0 (8 mm) Rat cranial windows.
Micro drill burrs (0.5 mm) Meisinger HM71005 (0.5 mm)
Micro drill burrs (0.7 mm) Meisinger HM71007 (0.7 mm)
Stereo microscope Nikon SMZ645
Surgical gelatin sponge Ethicon MS0005
Vetbond Tissue adhesive 3M 1469SB
Weigh boats / trays VWR 10803-148
* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries.
Multiphoton microscopy
20x water immersion objective Olympus XLUMPLFLN20 XW Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm.
Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa) Sigma Aldrich 46945 Recommended 10 kDa-2 MDa.
MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator Spectra-Physics N/A
SliceScope microscope Scientifica N/A
Ultrasound treatment
50 dB RF Amplifier E&I 2100L
Matching circuit Custom-made Custom-made Custom-made.
Microbubbles Bracco Imaging N/A SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.
Microbubbles Lantheus N/A Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg.
Signal generator Agilent Technologies 33500B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Kalladka, D., et al. Human neural stem cells in patients with chronic ischaemic stroke (PISCES): a phase 1, first-in-man study. Lancet. 388 (10046), 787-796 (2016).
  3. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: Bottleneck in brain drug development. the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 12 (2005).
  4. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2012).
  5. Nagy, Z., Pappius, H. M., Mathieson, G., Hüttner, I. Opening of tight junctions in cerebral endothelium. I. Effect of hyperosmolar mannitol infused through the internal carotid artery. The Journal of Comparative Neurology. 185 (3), 569-578 (1979).
  6. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  7. Burgess, A., et al. Alzheimer disease in a mouse model: MR imaging-guided focused ultrasound targeted to the hippocampus opens the blood-brain barrier and improves pathologic abnormalities and behavior. Radiology. 273 (3), 736-745 (2014).
  8. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373 (2019).
  9. Hynynen, K., Jones, R. M. Image-guided ultrasound phased arrays are a disruptive technology for non-invasive therapy. Physics in Medicine and Biology. 61 (17), 206-248 (2016).
  10. Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
  11. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  12. Downs, M. E., et al. Long-term safety of repeated blood-brain barrier opening via focused ultrasound with microbubbles in non-human primates performing a cognitive task. PLOS One. 10 (5), 0125911 (2015).
  13. Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102 (2018).
  14. Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103-112 (2019).
  15. Bing, C., et al. Transcranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using a stereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2, 13 (2014).
  16. O’Reilly, M. A., Hynynen, K. Blood-brain barrier: Real-time feedback-controlled focused ultrasound disruption by using an acoustic emissions-based controller. Radiology. 263 (1), 96-106 (2012).
  17. Jones, R. M., Deng, L., Leung, K., McMahon, D., O’Reilly, M. A., Hynynen, K. Three-dimensional transcranial microbubble imaging for guiding volumetric ultrasound-mediated blood-brain barrier opening. Theranostics. 8 (11), 2909-2926 (2018).
  18. Jones, R. M., McMahon, D., Hynynen, K. Ultrafast three-dimensional microbubble imaging in vivo predicts tissue damage volume distributions during nonthermal brain ablation. Theranostics. 10 (16), 7211-7230 (2020).
  19. Arvanitis, C. D., et al. Mechanisms of enhanced drug delivery in brain metastases with focused ultrasound-induced blood-tumor barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (37), 8717-8726 (2018).
  20. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, (2012).
  21. McCarter, J. F., et al. Clustering of plaques contributes to plaque growth in a mouse model of Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 126 (2), 179-188 (2013).
  22. Cruz Hernández, J. C., et al. Neutrophil adhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memory function in Alzheimer’s disease mouse models. Nature Neuroscience. 22 (3), 413-420 (2019).
  23. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  24. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  25. Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (71), e50148 (2013).
  26. Nhan, T., Burgess, A., Hynynen, K. Transducer design and characterization for dorsal-based ultrasound exposure and two-photon imaging of in vivo blood-brain barrier disruption in a rat model. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 60 (7), 1376-1385 (2013).
  27. Cho, E. E., Drazic, J., Ganguly, M., Stefanovic, B., Hynynen, K. Two-photon fluorescence microscopy study of cerebrovascular dynamics in ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (9), 1852-1862 (2011).
  28. Burgess, A., Nhan, T., Moffatt, C., Klibanov, A. L., Hynynen, K. Analysis of focused ultrasound-induced blood-brain barrier permeability in a mouse model of Alzheimer’s disease using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 192, 243-248 (2014).
  29. Nhan, T., et al. Drug delivery to the brain by focused ultrasound induced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhanced permeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 172 (1), 274-280 (2013).
  30. Nhan, T., Burgess, A., Lilge, L., Hynynen, K. Modeling localized delivery of Doxorubicin to the brain following focused ultrasound enhanced blood-brain barrier permeability. Physics in Medicine and Biology. 59 (20), 5987-6004 (2014).
  31. Poon, C. T., et al. Time course of focused ultrasound effects on β-amyloid plaque pathology in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer’s disease. Scientific Reports. 8 (1), 14061 (2018).
  32. Poon, C., Pellow, C., Hynynen, K. Neutrophil recruitment and leukocyte response following focused ultrasound and microbubble mediated blood-brain barrier treatments. Theranostics. 11 (4), 1655-1671 (2021).
  33. Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
  34. Chu, P. -. C., et al. Neuromodulation accompanying focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 5 (1), 15477 (2015).
  35. Yddal, T., Kotopoulis, S., Gilja, O. H., Cochran, S., Postema, M. . Transparent glass-windowed ultrasound transducers. , 2079-2082 (2014).
  36. Santos, M. A., Goertz, D. E., Hynynen, K. Focused ultrasound hyperthermia mediated drug delivery using thermosensitive liposomes and visualized with in vivo two-photon microscopy. Theranostics. 7 (10), 2718-2731 (2017).
  37. Mullin, L., et al. Effect of anesthesia carrier gas on in vivo circulation times of ultrasound microbubble contrast agents in rats. Contrast Media & Molecular Imaging. 6 (3), 126-131 (2011).
  38. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Molecular Imaging and Biology. 14 (1), 40-46 (2012).
  39. Baum, J. A. The carrier gas in anaesthesia: Nitrous oxide/oxygen, medical air/oxygen and pure oxygen. Current Opinion in Anaesthesiology. 17 (6), 513-516 (2004).
  40. Poon, C., McMahon, D., Hynynen, K. Noninvasive and targeted delivery of therapeutics to the brain using focused ultrasound. Neuropharmacology. , 20-37 (2017).
  41. Joo, I. L., et al. Early neurovascular dysfunction in a transgenic rat model of Alzheimer’s disease. Scientific Reports. 7, 46427 (2017).
  42. Dorr, A., et al. Amyloid-β-dependent compromise of microvascular structure and function in a model of Alzheimer’s disease. Brain: A Journal of Neurology. 135, 3039-3050 (2012).
  43. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: An optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLOS One. 7 (6), 38590 (2012).
  44. Teikari, P., Santos, M., Poon, C., Hynynen, K. Deep learning convolutional networks for multiphoton microscopy vasculature segmentation. arXiv. , (2016).
  45. Denes, A., et al. Surgical manipulation compromises leukocyte mobilization responses and inflammation after experimental cerebral ischemia in mice. Frontiers in Neuroscience. 7, 00271 (2014).
  46. Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9 (1), 5499 (2019).
  47. Podgorski, K., Ranganathan, G. Brain heating induced by near-infrared lasers during multiphoton microscopy. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1012-1023 (2016).
  48. Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59598 (2019).
  49. Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
  50. Beekers, I., et al. Combined confocal microscope and Brandaris 128 ultra-high-speed camera. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2575-2582 (2019).

Tags

Artificial IntelligenceBlood-brain BarrierMicrobubblesMultiphoton MicroscopyUltrasound

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Poon, C., Mühlenpfordt, M., Olsman, M., Kotopoulis, S., de Lange Davies, C., Hynynen, K. Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (180), e62235, doi:10.3791/62235 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image