細胞および薬物送達用途のための注射可能な高分子ポリマーナノ粒子ヒドロゲル

このプロトコルを開始する前に、以前に公開された方法27、28、29、30、31、36、37、38を使用してHPMC-C12とPEG-PLAを合成する必要があります。 1. ナノ沈降によるナノ粒子(NP)合成 注:このセクションでは、1つのNPの合成について説明し、バッファ溶液(1バッチあたり50mgのドライPEG-PLAポリマー)で20重量%のNPを250 μL生成します。バッチ数のスケールアップに関する注意事項は、関連する手順で提供されています。 PEG-PLAポリマーの50mgを8mLガラスシンチレーションバイアルに測定し、1 mLのアセトニトリルを加えます。完全に溶解する渦。注: バッチ数を増やすには、このステップを線形的にスケールし、必要なポリマーと溶媒の総量を単一のバイアルに追加します。 小さな攪拌バーで20 mLガラスシンチレーションバイアルに10mLの超純水を加えます。600rpmにセットした攪拌板に置きます。注:ステップ1.1がスケーリングされている場合、同等のバッチごとに沈殿させるために個々のシンチレーションバイアルを持っている必要があります。例えば、アセトニトリルの4 mLに溶解したポリマーの200mgについて、4 x 20 mLシンチレーションバイアルを調製する。 ナノ沈降法によってNPを形成するには、200 μLピペットを使用して1mLのポリマー溶媒溶液を水中に滴下して添加します。2分間かき混ぜます。PEG-PLAのPLAブロックは水に溶けなくて、その結果、コアシェルNPは、コアとして疎水性PLAブロックと親水性PEGブロックをシェルとして自己組み立てます。 ダイナミックライト散乱(DLS)で粒子サイズを確認します。注: この手順は、関連するソフトウェア パッケージを使用して市販のプレート リーダー用に記述されています ( 資料一覧を参照)。代替機器の使用については、機器の製造元が説明するサンプル調製方法を参照してください。 80 μLの超純水(分析濃度:1 mg/mL PEG-PLA NPs)で20 μLのNP溶液を希釈します。透明なボトムブラックの384ウェルプレートにウェルあたり30μLを加えます(三重化分析)。 ソフトウェアパッケージのプリセットプロトコルオプションを使用して、DLSプレートリーダーを使用して、各サンプルの流体力学半径と多分散を測定します。典型的なプロトコルの例として、取得ごとに2〜5秒のDLS測定値を取得し、球状タンパク質モデルから計算されたウェル当たりの平均粒子径と分布を報告するようにデータ収集パラメータを設定します。一貫したレオロジー特性を有するハイドロゲルを形成するために、得られる粒子は、0.2<多分散性(PD)を有する流体力学的直径で30〜50nmであるべきである。注:NPが所望より小さい場合は、ステップ1.1で75%アセトニトリル/25%ジメチルスルホキシド(DMSO)の溶液を使用してください。溶媒溶液中のDMSOの割合を大きくすると、一般に粒子サイズが大きくなる。 20 mL シンチレーションバイアルから遠心フィルターユニットにNP溶液を移します。遠心分離機は4500 x g で1時間、NP溶液を<250 μLに濃縮する。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの所望の緩衝液中で再懸濁し、20重量%のNPsにピペットを用いて、遠心フィルターユニットの内容物をタール型マイクロ遠心チューブまたはガラスシンチレーションバイアルに質量バランスで浸す。少量(50~100 μL)のバッファを使用してフィルタをすすい、すべてのNPsの収集を確実にします。注: バッチは、再中断中にプールすることができます。NPストックソリューションは、約1ヶ月間4°Cで保存することができます。フリーズしないでください。より長い保管のために、使用前にDLSによってサイズおよび多分散性を確認してください。 2. ヒドロゲル製剤および薬物または細胞のカプセル化 注:このセクションでは、2:10 PNP ヒドロゲル製剤の 1 mL の調製について説明しますが、2:10 は 2 重量% HPMC-C12 および 10 重量% NP (12 重量% 全固体ポリマー) および 88 重量% バッファー溶液、薬物貨物溶液、または細胞懸濁液を示します。製剤のパーセンテージは、機械的特性の範囲を有するヒドロゲルを得るために変化させることができる。例えば、1:5 PNPヒドロゲルを細胞沈降及び生存率実験結果に使用した。 PBS(または選択した他のバッファー)で6重量%HPMC-C12 のストック溶液を調製する。ポリマーが十分に分散されていることを確認するために48時間溶解する。注意:HPMC-C12 ストックソリューションは室温で数ヶ月間安定しています。しかし、微生物の増殖を阻害するために4°Cでの貯蔵が推奨される。 6重量%HPMC-C12 ストック溶液の333mgを1 mLルアーロックシリンジに加えます。 マイクロ遠心チューブに20重量%のNPストック溶液の500 μLを加えます。167 μLのPBSとピペットを混ぜます。針を使用して、希釈されたNP溶液で別の1 mLルアーロックシリンジを充填します。注:薬物貨物をロードするには、ヒドロゲル中の薬物の所望の最終濃度を計算し、NPと混合されたPBSの167 μLに適切な量をロードします。薬物安定性を監視する場合など、in situアッセイに分子プローブが必要な場合は、薬物貨物を積み込むために上記と同様の方法でプローブをロードする。細胞をロードするには、ヒドロゲル内の望ましい最終細胞濃度を計算し、適切な数の細胞を、NPと混合したPBSの167 μLにロードします。 エルボミキシング法35を用いて、2つのヒドロゲル成分(HPMC-C12およびNPs)を混合する。 NP溶液を含むシリンジにLuerエルボードコネクタを取り付けます(オプションで薬物貨物またはセルも含みます)。開いた端に半月板が見えるまで、NP溶液を肘に押し込みます。少し引き戻して、HPMC-C12 溶液を含むシリンジを接続します。注: 混合プロセス中にヒドロゲル全体の気泡の形成と分散を防ぐために、肘の接続の空気を最小限に抑えることが重要です。セルを肘ミキサーと混合する場合は、あまりにも急速に混合すると細胞が高い剪断力を受け、細胞死につながる可能性があるため、より穏やかに混合するように注意してください。 均質で不透明な白いヒドロゲル材料が形成されるまで、2つの溶液を約60サイクル、エルボーミキサーを通して前後にポンプで送ります。 ヒドロゲルの全容を1つのシリンジに押し込みます。空のシリンジを取り外し、ゲルに詰めたシリンジにプランジャーを引き戻し、エルボーコネクタから材料を回収します。針またはプラグでキャップ。注:混合プロセスのデッドスペースのために失われたヒドロゲルの容積の300 μLを考慮する必要があります。例えば、最終的なヒドロゲル体積の700 μLが望まれる場合、1 mLのヒドロゲルを調製する必要があります。ヒドロゲル製剤プロセスは、より大きな注射器を使用してスケールアップすることができます。しかし、2:10のような硬質ヒドロゲル製剤の場合、シリンジバレルと肘または針の直径の比率が増加するため、体積が3mLを超える注射器から混合および注入することが困難になる可能性があります。 ヒドロゲルを注射器に室温で保存します。ただし、薬物がカプセル化されている場合は、薬剤メーカーが別途指定しない限り、4°Cでの保管をお勧めします。材料を凍結しないでください。 3. ヒドロゲル製剤のレオロジー特性の測定 注:このプロトコルは、特に20ミリメートルの鋸歯状プレートジオメトリで 材料表 に記載されている商業用のレオメータで使用されます。その他の機器の使用については、製造元の説明書を参照して、サンプルの準備を行ってください。 レオロジーの特性評価のために、PNPヒドロゲルの少なくとも700 μLを処方する。 鋸歯状の回転計プレートの中央に材料を注入します。この量は、選択したジオメトリギャップによって異なります。参考までに、700 μmのギャップは材料の約400-500 μLを必要とします。 トリムギャップ(500-1000 μm)にリメーターを下げ、PNPハイドロゲルと接触する際にゆっくりと上部のレオメータープレートを回して、ギャップが均等かつ完全に埋まるようにします。 PNPヒドロゲルの荷重を、全体のレオメータプレート表面を覆うよう点検します。スパチュラまたはプラスチックトリマーを使用して、余分な材料を優しくトリミングして取り除き、プレートから非常にわずかな膨らみを持つよう。 最終的なジオメトリギャップに対してレオメーターを下げ、サンプルがクリーンロードされていることを確認します。 振幅や周波数スイープなどの振動テストを使用してサンプルの機械的特性を測定するか、フロースイープやステップテストなどのフローテストを使用します。注: 示されている代表的なデータでは、振動振幅検定は一定の周波数 10 rad/s で実行されます。振動周波数スイープは、振幅スイープの線形粘弾性体の中で、一定の1%の歪みで実行されます。フロースイープは、高いせん断率から低いせん断率39に実行されました。すべてのテストは、収集されたデータの10年あたり10ポイントと室温で完了します。試験パラメータは、製剤の特性に応じて調整する必要がある場合があります。2:10製剤のような硬いPNP材料を高い剪断率に供すると、材料がロメータプレートから排出され、機械的特性が不正確になり、その後のテストの間にサンプルの再ロードが必要になります。以下に示す代表的なデータは、品質管理試験中の比較に使用できます。 4. インビトロ薬物放出の特徴付け 望ましい長さにガラスの毛管管を切断することによって毛細管管を準備する。使い捨てのスパチュラまたはピペットチップを使用して、少量のエポキシをチューブの端に押し込み、プラグを形成して各チューブの一端をシールします。エポキシは、メーカーの推奨時間ごとに設定することができます。メモ:チューブは注射針の長さよりも短くなければなりません。2~3 μmの内径のチューブは、2.5インチの長さに合計容積の少なくとも300 μLが含まれるようなことをお勧めします。 目的の薬物を含む注射器に少なくとも500μLのPNPヒドロゲル材料を配合する。各サンプルグループを別々のシリンジで準備します。 長い皮下注射針(22G、4インチ)を使用して、各毛管の底部にPNPヒドロゲル100-200 μLを注入します。サンプルグループごとに少なくとも3本のチューブ(三重)を用意します。 (オプション)充填されたキャピラリーチューブを円錐遠心管に入れ、遠心分離機を1000 x g で1分間配置し、ヒドロゲルの表面が均一であることを確認します。このステップは、材料の表面を滑らかにするために必要に応じて時間と速度を変更し、繰り返す必要があります。注意: 遠心分離機がバランスが取れていることを確認してください。 慎重に注射器と針またはピペットを使用してキャピラリーチューブのヒドロゲルの上にPBSの200〜300 μLを充填します。ヒドロゲルの表面に接触したり、邪魔したりしないでください。キャップまたはプラグでチューブを密封するか、パラフィンフィルムの少なくとも2つの層でカバーします。 (オプション)37°Cでサンプルをインキュベートし、インビボの状態をシミュレートします。 慎重に完全に各毛細血管からPBSを除去し、ヒドロゲル表面を乱すことなく、注射器と注射針を使用して、薬物放出の予想される時間スケールに応じて選択した時点で。取り外したボリュームを新しいPBSに置き換えます。適切な条件下でアリコートを保管してください。注:ステップ4.3、4.5、4.7の推奨されるボリュームとポイントは、材料にロードされる薬物の量と上清にどれだけ速く放出するかに応じて、さまざまなタイムスケールにわたってインビトロ薬物放出をキャプチャするように最適化することができます。選択した時点のサンプルは、徐放薬の6時間、1日、3日、1週間および2週間である可能性があります。アリコートは、保存されるのではなく、取得された時点で分析することもできます。 研究の完了時に、ELISA、HPLCまたは蛍光アッセイなどの適切な方法でアリコートを分析し、各時点40、41、42で放出される薬物の量を定量化する。適切な検出方法は、対象の薬剤によって異なります。注:インビトロ放出試験は、異なるヒドロゲル製剤または薬物貨物間の放出を比較するのに有用である。in vitroリリースタイムスケールは、生体内での放出の予想時間スケールを直接示すものではありません。 5. ゲルカプセル化インスリンの熱安定性の特徴 サンプル基あたり少なくとも1.2 mLのPNPヒドロゲルを配合する。セクション2.3に記載の手順に従って、インスリン(薬物貨物)およびチオフラビンT(ThT)(分子プローブ)の両方をPNPヒドロゲルにロードする。注:凝集の主なメカニズム、したがって、インスリンの不活性化はアミロイド線維の形成を通じてである。ThTはアミロイド線維の存在下で強い蛍光シグナルを生成し、インシュリン凝集のその場でのモニタリングを可能にするので、適切な分子プローブである。目的の薬物貨物に応じて、凝集は異なる方法で監視することができる。示された代表的なデータについては、インスリンを6.7または10mg/mLの最終濃度にロードし、ThTを最終濃度25μMにした。 21 G 針を使用して、1 ウェルあたり 200 μL の PNP ヒドロゲルを黒い 96 ウェル プレートに注入します。各サンプルグループは、少なくとも三重で測定する必要があります。蒸発を防ぐために光学的に透明な接着板シール付きシールプレート。 温度制御、揺れ、および運動読み取りプログラミングを備えたプレートリーダーにプレートを挿入し、読み取りプロトコルを開始します。代表的なデータは、次の条件を使用して、市販のプレートリーダー(資料表を参照)で取得されました。 ストレスエージング条件:37°Cで連続的な直線振動(410°C、5mm)。 データ取得:20分間隔で励起/放出450 nm/482 nm注:温度制御、シェーカー、および運動読み取り機能を備えたプレートリーダーが利用できない場合、プレートはインキュベーターのシェーカープレートに置き、選択した時点で波長以上で手動で読み取ることができます。 各グループの平均蛍光信号としてデータをプロットします。集約までの時間は、任意の信号閾値43を定義することによって定量化することができる。注: 下記の代表的なデータについては、しきい値は、750,000 任意の蛍光単位(AFU)として定義されました。この値は、急激な蛍光シグナル増加によって示される凝集の発症を十分に捉えながら、測定されたベースラインを上回るように選択した。 サンプルが凝集または視覚的に脱水を開始したときにアッセイを終了します。 6. 細胞の生存率の評価 上記のプロトコルに続く所望の細胞濃度を含有するPNPヒドロゲルの少なくとも2mLを処方する(通常1〜5 x 106 細胞/mL)。各サンプルグループを別々のシリンジで準備します。 21G針を使用して、150 μL PNP ヒドロゲルを透明な底96ウェルプレートの各ウェルに注入します。各井戸は1つの複製です。各サンプル グループには、タイム ポイントごとに 3 ~ 5 個のレプリケートが必要です。50 x g でプレートを 2 分間遠心し、ウェル内にヒドロゲルを均等に広げます。 ヒドロゲルの上に適切な細胞培地を100μL加えます。毎日このメディアを取り出し、100 μLの新しいメディアを追加します。 1日目に、各サンプルグループのそのタイムポイントの指定された反復のヒドロゲルの上にあるメディアを取り外します。ヒドロゲルの上に2 mMカルセインAM溶液の50 μLを加えます。30分間インキュベートします。注: Calcein AM は、ライブ セルを識別してラベル付けするために使用できます。生細胞において、非蛍光カルセインAMは、アセトキシメチルエステル加水分解後の細胞内エステラーゼによって緑色蛍光カルセインに変換される。 共焦点顕微鏡を使用して、96ウェルプレート内の各ウェルの中心を画像化します。少なくとも150 μmに及ぶzスタックを持つ少なくとも300 μm2 の領域を調査します。共焦点波長設定を使用して、カルセインの蛍光を捕捉します(励起/発光:495 nm/515 nm)。 必要に応じて、以降の各時点に対してステップ 6.4 と 6.5 を繰り返します。 各画像を解析するには、フィジーまたは同様のソフトウェアを使用して、すべてのZスタック画像を単一平面最大強度イメージに集約します。各画像の蛍光細胞数を定量化します。1日目の蛍光細胞数と比較した各時点における蛍光細胞数の比率は、PNPヒドロゲルにおける相対的な細胞生存率である。 7. 細胞のセトリングの評価 5 x 106 細胞/mLの最終濃度で500-700 μLのPNPヒドロゲルを処方するのに必要な細胞数を計算します。1 x 106 細胞/mLの濃度でPBSの1mLの細胞を懸濁させる。2 mMカルセインAMの50μLを加えて細胞を染色する。色素を10分間インキュベートします。 適切な条件で遠心分離細胞は、PBSを除去し、所望のPNPヒドロゲルの500〜700μLを形成するために必要なPBSの体積中の細胞を再懸濁する。注: 特定のセルタイプごとに遠心分離を行う場合の推奨速度と持続時間は、通常、製品マニュアルに記載されています。 500-700 μL の PNP ヒドロゲルを、次のプロトコルセクション 2 の染色セル (5 x 106 細胞/mL) で配合します。 21G針を使用して、染色された細胞を含むPNPヒドロゲルをキュベットの底に100〜200μL注入します。各サンプルに対して 3 つの反復を実行する必要があります。泡の形成を防ぐために注入しながら、キュベット内で針を前後に動かします。 すぐに(時間t = 0)、キュヴェットの基部にある平らなキュベット矩形領域全体にわたって彼らの側に横たわっているキュベットをイメージします。共焦点タイルスキャン機能を使用して、ウェル領域全体を画像化し、100 μmの深さにわたって3DでZスタックを画像化します。後で視覚化するために、コンフォーカル顕微鏡ソフトウェアを使用して個々のタイルをすべてつなぎ合わせ、最大強度投影を行って大面積の単一画像を形成するか、パーソナルコンピュータ44、45でFIJIソフトウェアを使用します。 イメージングの後、キュベットを直立して立ちます。 1時間および4時間の画像は、細胞がヒドロゲルに落ち着いたか、またはそれらが懸濁されたままであるかどうかを観察する。注: これらの時間ポイントは提案であり、必要に応じて変更できます。 各イメージを解析するには、すべての Z スタック イメージを 1 つの平面最大輝度イメージに集約します。FIJIまたは類似のソフトウェアを使用して、キュベットの中心垂直プロファイルの下の蛍光強度を測定して細胞分布を定量化し、沈降の程度を決定する。