הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

לפני תחילת פרוטוקול זה, יש צורך לסנתז HPMC-C12 ו PEG-PLA באמצעות שיטות שפורסמו בעבר27,28,29,30,31,36,37,38. 1. סינתזת ננו-חלקיקים (NP) על ידי ננו-פרציפציה הערה: סעיף זה מתאר סינתזה של אצווה אחת של NPs, הפקת 250 μL של 20 wt% NPs בתמיסת מאגר (50 מ”ג של פולימר PEG-PLA יבש לכל אצווה). הערות לשינוי קנה מידה של מספר האצוות מסופקות בשלבים הרלוונטיים. למדוד 50 מ”ג של פולימר PEG-PLA לתוך בקבוקון זכוכית 8 מ”ל נצנוץ ולהוסיף 1 מ”ל של אצטוניטריל. וורטקס להתמוסס לחלוטין.הערה: כדי להגדיל את מספר האצוות, בקנה מידה ליניארי שלב זה ולהוסיף את הסכום הכולל של פולימר ממס הדרושים בקבוקון אחד. הוסיפו 10 מ”ל של מים אולטרה-דקים לבקבוקון זכוכית 20 מ”ל עם בר ערבוב קטן. שים על צלחת ערבוב להגדיר 600 סל”ד.הערה: אם קנה המידה של שלב 1.1 השתנה, עדיין יש צורך בבקבוקון נצנצים בודד כדי לזרז אותו עבור כל אצווה שוות ערך. לדוגמה, עבור 200 מ”ג של פולימר מומס ב 4 מ”ל של אצטוניטריל, להכין 4 x 20 בקבוקונים מ”ל. כדי ליצור NPs על ידי nanoprecipitation, להוסיף 1 מ”ל של פתרון ממס פולימר dropwise לתוך המים באמצעות פיפטה μL 200. מערבבים במשך 2 דקות. בלוק PLA של PEG-PLA אינו מסיס במים, וכתוצאה מכך, NPs מעטפת הליבה יהיה להרכיב את עצמו עם בלוקים PLA הידרופובי כמו הליבה ואת בלוקים PEG הידרופילי כמו הקליפה. אמת את גודל החלקיקים על-ידי פיזור אור דינאמי (DLS).הערה: הליך זה נכתב במיוחד עבור קורא לוחות זמין מסחרית עם חבילת התוכנה המשויכת (ראה טבלת חומרים). לשימוש במכשירים חלופיים, עיין בשיטות ההכנה לדוגמה המתוארות על ידי יצרן המכשיר. לדלל 20 μL של פתרון NP עם 80 μL של מים אולטרה סגולים (ריכוז ניתוח: 1 מ”ג / מ”ל PEG-PLA NPs). הוסף 30 μL לבאר לצלחת שחורה 384-באר שחורה ברורה (לנתח משולש). למדוד את הרדיוס ההידרודינמי ואת polydispersity של כל מדגם עם קורא לוחות DLS באמצעות אפשרויות פרוטוקול מוגדרות מראש בחבילת התוכנה. כדוגמה לפרוטוקול טיפוסי, הגדר את הפרמטרים לאיסוף נתונים כדי לרכוש מדידות DLS 5-10 של משך של 2-5 שניות לכל רכישה ולאחר מכן דווח על גודל החלקיקים הממוצע והתפלגות לכל באר, מחושב ממודל חלבונים כדוריים. כדי ליצור הידרוג’לים עם תכונות ראולוגיות עקביות, החלקיקים וכתוצאה מכך צריך להיות 30-50 ננומטר בקוטר הידרודינמי עם polydispersity (PD) < 0.2.הערה: אם NPs הם קטנים יותר הרצוי, להשתמש בתמיסה של 75% אצטוניטריל / 25% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בשלב 1.1. הגדלת אחוז DMSO בתמיסת הממס בדרך כלל להגדיל את גודל החלקיקים. העבר את פתרון NP מבקבוקון הנצנצים של 20 מ”ל ליחידת סינון צנטריפוגלית. צנטריפוגה ב 4500 x g עבור 1 שעות כדי לרכז את פתרון NP כדי <250 μL. השהה מחדש במאגר הרצוי, כגון מלוחים עם אגירת פוספט (PBS), ל- 20 wt% NPs. Pipette את התוכן של יחידת הסינון הצנטריפוגלית לצינור מיקרוצנטריפוגה מוכתם או בקבוקון נצנוץ זכוכית על איזון מסה. השתמש בכמות קטנה (50-100 μL) של מאגר כדי לשטוף את המסנן ולהבטיח איסוף של כל NPs. הוסף מאגר כדי להגיע למסה כוללת של 250 מ”ג.הערה: ניתן לאגד אצוות במהלך ההשעיה החוזרת. פתרונות מלאי NP ניתן לאחסן ב 4 °C (69 °F) במשך כ 1 חודש. אל תקפיא. לאחסון ארוך יותר, ודא את הגודל והפולי-דיספריזנטיות של DLS לפני השימוש. 2. ניסוח הידרוג’ל ואנקפסולציה של תרופות או תאים הערה: סעיף זה מתאר הכנה של 1 מ”ל של ניסוח הידרוג’ל PNP 2:10, עם 2:10 מציין 2 wt% HPMC-C12 ו 10 wt% NPs (12 wt% פולימר מוצק הכולל) ו 88 wt% פתרון חיץ, פתרון מטען סמים, או השעיית תאים. אחוזי הניסוח יכולים להיות מגוונים להניב הידרוג’לים עם מגוון תכונות מכניות. לדוגמה, הידרוג’לים של PNP 1:5 שימשו לתוצאות הניסוי של יישוב התאים וכדאיות הראו. הכן פתרון מלאי של 6 wt% HPMC-C12 ב- PBS (או מאגר אחר של בחירה). להתמוסס במשך 48 שעות כדי להבטיח את הפולימר הוא מפוזר לחלוטין.הערה: פתרון המלאי HPMC-C12 יציב במשך חודשים בטמפרטורת החדר. עם זאת, אחסון ב 4 מעלות צלזיוס מומלץ לעכב צמיחה מיקרוביאלית. הוסף 333 מ”ג של 6 wt% HPMC-C12 פתרון מניות לתוך מזרק מנעול לואר 1 מ”ל. הוסף 500 μL של 20 wt% NP פתרון המניה צינור microcentrifuge. הוסף 167 μL של PBS ופיפט לערבב. באמצעות מחט, למלא עוד 1 מ”ל לואר לנעול מזרק עם פתרון NP מדולל.הערה: כדי לטעון מטען סמים, לחשב את הריכוז הסופי הרצוי של התרופה הידרוג’ל ולהעמיס את הסכום המתאים לתוך 167 μL של PBS מעורבב עם NPs. אם בדיקה מולקולרית נחוצה לבדיקת in situ, כגון לניטור יציבות התרופה, לטעון את החללית באופן דומה כמתואר לעיל עבור טעינת מטען סמים. כדי לטעון תאים, לחשב את ריכוז התא הסופי הרצוי הידרוג’ל לטעון את המספר המתאים של תאים לתוך 167 μL של PBS מעורבב עם NPs. ערבבו את שני רכיבי ההידרוגל (HPMC-C12 ו-NPs) בשיטת ערבוב מרפקים35. חבר את מחבר מרפק הלואר למזרק המכיל פתרון NP (באופן אופציונלי מכיל גם מטען או תאים של תרופות). לדחוף את פתרון NP דרך המרפק עד המניסקוס גלוי בקצה הפתוח. משוך מעט לאחור וחבר את המזרק המכיל פתרון HPMC-C12. הערה: חשוב למזער את האוויר בחיבור המרפק כדי למנוע היווצרות ופיזור של בועות לאורך ההידרוגל במהלך תהליך הערבוב. כאשר מערבבים תאים עם מערבל המרפקים, יש להקפיד לערבב בעדינות רבה יותר כאשר ערבוב מהיר מדי עלול לחשוף את התאים לכוחות גזירה גבוהים, מה שמוביל למוות של תאים. לשאוב את שני הפתרונות הלוך ושוב דרך מערבל המרפק במשך כ 60 מחזורים עד חומר הומוגני, אטום הידרוג’ל לבן נוצר. לדחוף את כל נפח הידרוג’ל לתוך מזרק אחד. הסר את המזרק הריק ומשוך את הכוכנה בחזרה על המזרק טעון הג’ל כדי לשחזר חומר ממחבר המרפק. כובע עם מחט או תקע.הערה: יש צורך להסביר ~ 300 μL של נפח הידרוג’ל אבוד בשל שטח מת בתהליך ערבוב. לדוגמה, אם 700 μL של נפח הידרוג’ל הסופי רצוי, 1 מ”ל של הידרוג’ל צריך להיות מוכן. ניתן לשנות את תהליך ניסוח ההידרוגל באמצעות מזרקים גדולים יותר. עם זאת, עבור ניסוחים הידרוג’ל נוקשה, כגון 2:10, זה יכול להיות קשה לערבב ולהזריק מזרקים גדולים מ 3 מ”ל בנפח בשל היחס הגובר של חבית מזרק לקוטר מרפק או מחט. אחסן את ההידרוגל במזרק בטמפרטורת החדר. עם זאת, אם התרופות הם encapsulated, אחסון ב 4 מעלות צלזיוס מומלץ אלא אם כן יצרן התרופה מציין אחרת. אין להקפיא את החומר. 3. מדידת תכונות ראולוגיות של ניסוחים הידרוג’ל הערה: פרוטוקול זה משמש במיוחד עם קנה המידה המסחרי המוזכר בטבלת החומרים עם גיאומטריית לוח משוננת של 20 מ”מ. לשימוש במכשירים אחרים, עיין בהוראות היצרן להכנת מדגם. יש לגבש לפחות 700 μL של הידרוג’ל PNP לאפיון ראולוגי. הזרקת חומר במרכז צלחת קנה המידה המשוננת. הסכום ישתנה בהתאם לפער הגיאומטריה שנבחר. לעיון, פער של 700 מיקרומטר דורש ~ 400-500 μL של חומר. מנמיכים את הרומטר לפער הקיצוץ (500-1000 מיקרומטר) ומסובבים לאט את צלחת הגרמטר העליונה כשהיא יוצרת מגע עם הידרוג’ל PNP כדי להבטיח שהפער יתמלא באופן שווה ומלא. בדוק את הטעינה של הידרוג’ל PNP כך שהוא מכסה את כל משטח צלחת rheometer. השתמש מרית או גוזם פלסטיק לקצץ בעדינות ולהסיר כל חומר עודף, כך שיש לו בליטה קלה מאוד מתוך הצלחת. מנמיכים את הרומטר לפער הגיאומטריה הסופי ומוודאים שהדגימה טעונה בצורה נקייה. למדוד את התכונות המכאניות של המדגם באמצעות בדיקות תנודה, כגון משרעת או מטאטא תדר, או בדיקות זרימה, כגון מטאטא זרימה או בדיקות צעד.הערה: בנתונים הייצוגיים המוצגים, בדיקות משרעת מתנדנדות מופעלות בתדירות קבועה של 10 rad/s. מטאטא תדרים מתנדים מופעלים במתח קבוע של 1%, בתוך המשטר הוויסקואלסטי הליניארי של מטאטא משרעת. מטאטא זרימה נוהלו משיעורי גזירה גבוהים לשיעורי גזירה נמוכים39. כל הבדיקות הושלמו עם 10 נקודות לעשור של נתונים שנאספו בטמפרטורת החדר. ייתכן שיהיה צורך להתאים את פרמטרי הבדיקה בהתאם למאפייני הניסוח. חומרים נוקשים PNP כגון ניסוחים 2:10 לשיעורי גזירה גבוהים יכול לגרום החומר להיפלט מלוחות rheometer, וכתוצאה מכך אפיון מכני לא מדויק, ודורש טעינה מחדש של המדגם בין הבדיקות הבאות. ניתן להשתמש בנתוני הייצוג המוצגים להלן להשוואה במהלך בדיקות בקרת איכות. 4. אפיון שחרור תרופות במבחנה הכן צינורות נימי על ידי חיתוך צינורות נימי זכוכית לאורך הרצוי. לאטום קצה אחד של כל צינור באמצעות מרית חד פעמית או קצה פיפטה לדחוף כמות קטנה של אפוקסי לתוך קצה הצינור כדי ליצור תקע. אפשר לאפוקסי להגדיר את הזמן המומלץ של היצרן.הערה: הצינור חייב להיות קצר יותר מאורך מחט ההזרקה. צינורות בקוטר פנימי של 2-3 מיקרומטר מומלץ כך שאורך של 2.5 אינץ’ יכיל לפחות 300 μL של נפח כולל. לגבש לפחות 500 μL של חומר הידרוג’ל PNP במזרק המכיל את התרופה של עניין. הכינו כל קבוצת מדגם במזרק נפרד. להזריק 100-200 μL של הידרוג’ל PNP בחלק התחתון של כל צינור נימי באמצעות מחט תת מזרק ארוך (22G, 4 אינץ ‘). הכינו לפחות שלושה צינורות (משולשים) לכל קבוצת מדגם. (אופציונלי) לחצו על הלחצן ‘קביעות’ מניחים צינורות נימי מלאים בצינור צנטריפוגה חרוט וצנטריפוגה במשך דקה ב 1000 x גרם כדי להבטיח את פני השטח של הידרוג’ל הוא אחיד. ייתכן שיהיה צורך לחזור על צעד זה, לשנות את הזמן והמהירות לפי הצורך כדי להחליק את פני השטח של החומר.התראה: ודא שצנטריפוגה מאוזנת היטב. בזהירות למלא 200-300 μL של PBS על גבי הידרוג’ל בצינור נימי באמצעות מזרק ומחט או פיפטה. אין ליצור קשר או להפריע לפני השטח של ההידרוגל. לאטום את הצינור עם כובע או תקע או לכסות עם לפחות שתי שכבות של סרט פרפין. (אופציונלי) לחצו על הלחצן ‘קביעות’ דגירה דגימות ב 37 °C (69 °F) כדי לדמות בתנאי vivo. בזהירות להסיר לחלוטין את PBS מכל נימי, מבלי להפריע משטח הידרוג’ל, באמצעות מזרק ומחט בנקודות זמן שנבחרו בהתאם לסולם הזמן הצפוי של שחרור סמים. החלף את אמצעי האחסון שהוסר ב- PBS טרי. לאחסן aliquots בתנאים מתאימים.הערה: ניתן למטב את הכרכים המומלצים ונקודות הזמן בשלבים 4.3, 4.5 ו- 4.7 כדי ללכוד שחרור תרופות במבחנה לאורך טווח של צירי זמן, תלוי כמה סמים נטענים בחומר וכמה מהר הוא משחרר לתוך supernatant. מדגם של נקודות זמן נבחרות יכול להיות 6 שעות, 1 יום, 3 ימים, 1 שבוע ו 2 שבועות עבור תרופה משחררת לאט. Aliquots ניתן גם לנתח כפי שהם נרכשים ולא מאוחסנים. בסיום המחקר, לנתח aliquots עם שיטה מתאימה כגון ELISA, HPLC או בדיקת פלואורסצנטיות כדי לכמת את כמות התרופה שוחרר בכל נקודה בכל נקודה40,41,42. שיטת הגילוי המתאימה תשתנה בהתאם לתרופה המעניינת.הערה: מחקרי שחרור במבחנה שימושיים להשוואת שחרור בין ניסוחים הידרוג’ל שונים או מטען סמים. ציר הזמן לשחרור במבחנה אינו מציין לעתים קרובות ישירות סרגל זמן צפוי של שחרור ב- vivo. 5. אפיון היציבות התרמית של אינסולין עטוף ג’ל יש לגבש לפחות 1.2 מ”ל של הידרוג’ל PNP לכל קבוצת מדגם. בעקבות ההליך המתואר בסעיף 2.3, לטעון הן אינסולין (מטען סמים) ו thioflavin T (ThT) (בדיקה מולקולרית) לתוך הידרוג’ל PNP.הערה: המנגנון העיקרי של צבירה, ולכן, השבתה של אינסולין היא באמצעות היווצרות של סיבי עמילואיד. ThT הוא בדיקה מולקולרית מתאימה כי זה מייצר אות פלואורסצנטיות חזק בנוכחות סיבים עמילואיד, המאפשר ניטור באתרו של צבירת אינסולין. בהתאם למטען התרופה של עניין, צבירה עשויה להיות במעקב באמצעות שיטות שונות. עבור הנתונים הייצוגיים המוצגים, אינסולין נטען לריכוז סופי של 6.7 או 10 מ”ג / מ”ל ו- ThT לריכוז סופי של 25 מיקרומטר. באמצעות מחט 21 G, להזריק 200 μL של הידרוג’ל PNP לכל באר לתוך צלחת שחורה 96-באר. יש למדוד כל קבוצת מדגם לפחות משולשת. צלחת חותם עם חותם צלחת דבק אופטי ברור כדי למנוע אידוי. הכנס צלחת לקורא לוח המצויד בבקרת טמפרטורה, טלטול ותכנות קריאה קינטי והתחל לקרוא פרוטוקול. נתונים מייצגים נרכשו באמצעות קורא לוחות זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) באמצעות התנאים הבאים: תנאי הזדקנות לחוצים: טלטול ליניארי מתמשך (410 סל”ד, 5 מ”מ) ב-37 מעלות צלזיוס. רכישת נתונים: עירור/פליטה 450 ננומטר/482 ננומטר במרווחים של 20 דקותהערה: אם קורא צלחות עם בקרת טמפרטורה, שייקר ויכולות קריאה קינטית אינו זמין, ניתן להניח את הצלחת על צלחת שייקר באינקובטור ולקרוא ידנית באורך גל מעל בנקודות זמן נבחרות. התווה נתונים כאות פלואורסצנטי ממוצע לאורך זמן עבור כל קבוצה. ניתן לכמת זמן לצבירה על ידי הגדרת סף אות שרירותי43.הערה: עבור הנתונים הייצוגיים המוצגים להלן, הסף הוגדר כ- 750,000 יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות (AFU). ערך זה נבחר להיות מעל לקו הבסיס הנמדד ועדיין ללכוד מספיק את תחילת הצבירה המצוינת על ידי עלייה חדה באות פלואורסצנטי. סיים את ההסתעפויה כאשר דגימות צוברות או מתחילות להתייבש באופן חזותי. 6. הערכת כדאיות התא לנסח לפחות 2 מ”ל של הידרוג’ל PNP המכיל את ריכוז התא הרצוי בעקבות הפרוטוקולים לעיל (בדרך כלל 1 – 5 x 106 תאים / מ”ל). הכינו כל קבוצת מדגם במזרק נפרד. באמצעות מחט 21G, להזריק 150 μL PNP הידרוג’ל לתוך כל באר בצלחת 96-באר תחתונה ברורה; כל באר היא שכפול אחד. לכל קבוצה לדוגמה צריכים להיות 3-5 שכפולים לכל נקודת זמן. צנטריפוגה הצלחת ב 50 x גרם במשך 2 דקות כדי להפיץ את הידרוג’ל באופן שווה בבאר. הוסף 100 μL של מדיית התא המתאימה על גבי הידרוג’ל. הסר מדיה זו מדי יום והוסף מדיה חדשה של 100 μL. ביום 1, הסר את המדיה מעל ההידרוגל עבור השכפולים המיועדים עבור נקודת זמן זו עבור כל קבוצת מדגם. הוסף 50 μL של 2 מ”מ קלצ’ין AM פתרון על גבי הידרוג’לים. דגירה במשך 30 דקות.הערה: ניתן להשתמש ב- Calcein AM כדי לזהות ולתייג תאים חיים. בתאים חיים, הקלצין AM שאינו פלואורסצנטי מומר לקלצין פלואורסצנטי ירוק, על ידי אסטראזות תאיות לאחר אצטוקסימתיל אסתר הידרוליזה. צלם את מרכז כל באר בצלחת של 96 באר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. סקר שטח של לפחות 300 מיקרומטר2 עם מחסנית z פורש לפחות 150 מיקרומטר. השתמש בהגדרות אורך גל confocal כדי ללכוד את הפלואורסצנטיות של calcein (עירור / פליטה: 495 ננומטר / 515 ננומטר). חזור על שלב 6.4 ו- 6.5 עבור כל נקודת זמן עוקבת לפי הצורך. כדי לנתח כל תמונה, כווץ את כל תמונות הערימה z לתמונת עוצמה מרבית של מישור יחיד באמצעות FIJI או תוכנה דומה. כימתו את מספר התאים הפלואורסצנטיים בכל תמונה. היחס בין מספר התאים הפלואורסצנטיים בכל נקודת זמן בהשוואה למספר התאים הפלואורסצנטיים ביום הראשון הוא כדאיות התאים היחסית בהידרוגלים של PNP. 7. הערכת יישוב תאים לחשב את מספר התאים הדרושים כדי לנסח 500-700 μL של הידרוג’ל PNP בריכוז הסופי של 5 x 106 תאים / מ”ל. להשעות תאים 1 מ”ל של PBS בריכוז של 1 x 106 תאים / מ”ל. תאי כתם על ידי הוספת 50 μL של 2 מ”מ calcein AM. דגירה התאים עם הצבע במשך 10 דקות. תאי צנטריפוגה בתנאים המתאימים, להסיר את PBS ו resuspend התאים בנפח של PBS צורך ליצור 500-700 μL של הידרוג’ל PNP הרצוי.הערה: המהירות ומשך הזמן המומלצים לצנטריפוגה של כל סוג תא ספציפי מסופקים בדרך כלל בתיעוד המוצר. לנסח 500-700 μL של הידרוג’ל PNP עם תאים מוכתמים (5 x 106 תאים / מ”ל) בעקבות סעיף פרוטוקול 2. באמצעות מחט 21G, להזריק 100-200 μL של הידרוג’ל PNP המכיל את התאים המוכתמים בתחתית cuvette. יש לבצע שלושה שכפולים עבור כל דגימה. להזיז את המחט קדימה ואחורה בתוך cuvette תוך הזרקת כדי למנוע היווצרות בועה. מיד (זמן t = 0), תמונה cuvettes שוכב על הצד שלהם על כל אזור מלבן cuvette שטוח בבסיס cuvette. השתמשו ביכולות סריקת האריחים הקונפוקלית כדי לדמות את כל אזור הבאר ולצלם מחסנית z בתלת-ממד בעומק של 100 מיקרומטר. להדמיה מאוחרת יותר, או להשתמש בתוכנת מיקרוסקופ confocal לתפור יחד את כל האריחים בודדים ולבצע הקרנה בעוצמה מקסימלית כדי ליצור תמונה אחת של השטח הגדול או להשתמש בתוכנת FIJI במחשב אישי44,45. לאחר ההדמיה, לעמוד cuvettes זקוף. תמונה ב 1 שעה ו 4 שעות כדי לבחון אם התאים התיישבו הידרוג’ל או אם הם נשארים מושעים.הערה: נקודות זמן אלה הן הצעות וניתן לשנות אותן לפי הצורך. כדי לנתח כל תמונה, כווץ את כל תמונות הערימה z לתמונת עוצמה מרבית של מישור יחיד. באמצעות FIJI או תוכנה דומה, לכמת את התפלגות התא על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך הפרופיל האנכי המרכזי של cuvette כדי לקבוע את מידת ההתיישבות.