JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

حقن فوق الجزيئية البوليمر نانوجسيمات هيدروجيلس لتطبيقات توصيل الخلايا والمخدرات

Published: February 07, 2021
doi:
10.3791/62234
, , ,
1Department of Materials Science & Engineering,Stanford University, 2Department of Chemical Engineering,Stanford University, 3Department of Bioengineering,Stanford University, 4Department of Pediatrics – Endocrinology,Stanford University

Summary

يصف هذا البروتوكول تركيب وصياغة المواد الحيوية الهيدروجيلة البوليمرية فوق الجزيئية القابلة للحقن ( PNP ). يتم عرض تطبيقات هذه المواد لتوصيل الأدوية ، وتثبيت الأدوية الحيوية ، وتغليف الخلايا وتسليمها.

Abstract

تصف هذه الطرق كيفية صياغة الهيدروجيلات البوليمرية النانوية فوق الجزيئية القابلة للحقن (PNP) لاستخدامها كمواقع حيوية. تتكون الهيدروجيلات PNP من عنصرين: السليلوز المعدل هيدروفوبيكيلي كما البوليمر الشبكة والجسيمات النانوية الأساسية قذيفة تجميعها الذاتي التي تعمل بمثابة وصلات عبر غير التكافؤ من خلال التفاعلات الديناميكية والمتعددة التكافؤ. تصف هذه الطرق كلا من تكوين هذه الجسيمات النانوية ذاتية التجميع من خلال التحلل النانوي وكذلك صياغة وخلط المكونين لتشكيل الهيدروجيلات ذات الخصائص الميكانيكية غير القادرة. كما يتم تفصيل استخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) والريومولوجيا لتوصيف جودة المواد المركبة. وأخيرا، فإن فائدة هذه الهيدروجيلات لتوصيل الأدوية، واستقرار الأدوية الحيوية، وتغليف الخلايا وتسليمها تظهر من خلال التجارب المختبرية لتوصيف إطلاق المخدرات، والاستقرار الحراري، وتسوية الخلايا وقابليتها للحياة. نظرا لتوافقه البيولوجي ، وحقنه ، وظروف تكوين هلام خفيفة ، فإن نظام الهيدروجيل هذا هو منصة غير قادرة بسهولة ومناسبة لمجموعة من التطبيقات الطبية الحيوية.

Introduction

هيدروجيلس عن طريق الحقن هي أداة ناشئة لتقديم الخلايا العلاجية والأدوية إلى الجسم بطريقة تسيطر عليها1. يمكن تحميل هذه المواد بالأدوية أو الخلايا ويمكن إعطاؤها بطريقة طفيفة التوغل من خلال الحقن المباشر للأنسجة السطحية أو عن طريق توصيل القسطرة إلى الأنسجة العميقة. بشكل عام، تتكون الهيدروجيلات القابلة للحقن من شبكات بوليمر منتفخة بالمياه ترتبط معا بتفاعلات جسدية عابرة. في بقية, هذه الروابط المتقاطعة توفير بنية صلبة مثل إلى المواد الهلامية, ولكن عند تطبيق قوة ميكانيكية كافية هذه الوصلات المتقاطعة تعطلت مؤقتا, تحويل المواد إلى حالة تشبه السائل التي يمكن أن تتدفق بسهولة2. ومن هذه الخصائص الريولوجية التي تسمح الهيدروجيلات المادية لقص رقيقة وتدفق من خلال أقطار إبرة صغيرة أثناء الحقن3. بعد الحقن ، شبكة البوليمر من الإصلاحات المادية ، مما يسمح لها بالشفاء الذاتي وتشكيل هلام يشبه الصلبة بسرعة في الموقع4،5. هذه الهياكل يمكن أن تكون بمثابة مستودعات بطيئة الإفراج عن المخدرات أو السقالات لتجديد الأنسجة6،7. وقد استخدمت هذه المواد في تطبيقات متنوعة تشمل تكنولوجيا توصيل الأدوية، والطب التجديدي، والهندسة المناعية1،8،9،10،11،12.

وقد تم تطوير كل من المواد الطبيعية (مثل الألجينات والكولاجين) والمواد الاصطناعية (مثل البولي (جلايكول الإيثيلين) (PEG) أو البوليمرات الهيدروفيلية المماثلة) كمواد هيدروجيل قابلة للكومبيكال الحيوي القابلة للحقن13و14و15. العديد من المواد الطبيعية معرض دفعة إلى دفعة الاختلاف التي تؤثر على استنساخ4،16. هذه المواد غالبا ما تكون حساسة لدرجة الحرارة، وعلاج عند الوصول إلى درجات الحرارة الفسيولوجية. وبالتالي، فإن التعامل مع هذه المواد يطرح تحديات تقنية ولوجستية إضافية17. المواد الاصطناعية تسمح لمراقبة كيميائية أكثر دقة والتكرار ممتازة، ولكن هذه المواد يمكن أن تكون في بعض الأحيان عرضة للاستجابات المناعية السلبية التي تحد من التوافق البيولوجي، وهي ميزة حاسمة للتطبيقات العلاجية في الجسم الحي6،18،19. وقد أظهرت الجهود الأخيرة أن هناك العديد من معايير التصميم المعقدة المشاركة في هندسة مادة هيدروجيل عن طريق الحقن ، بما في ذلك تحسين الخصائص الميكانيكية ، وحجم شبكة شبكة البوليمر ، والعظة الجزيئية النشطة بيولوجيا ، والتحلل الحيوي ، والمناعة للمادة20،21،22،23،24،25،26. يجب النظر في كل هذه العوامل اعتمادا على تطبيق الفائدة ، مما يعني أن منصة نمطية غير قادرة كيميائيا مثالية لتلبية اتساع نطاق واسع من التطبيقات.

تصف الأساليب الحالية تركيب واستخدام منصة هيدروجيل البوليمر النانوي القابلة للحقن (PNP) التي تعرض خصائص ميكانيكية غير قادرة ، ودرجة عالية من التوافق البيولوجي وانخفاض المناعة ، وتقدم مواقع اقتران الإشارات الجزيئية النشطة بيولوجيا27و28و29و30و31و32و33. وتتكون هذه الهيدروجيلات PNP من البوليمرات السليلوز المعدلة هيدروفوبيكيلي والتجميع الذاتي الأساسية قذيفة الجسيمات النانوية التي تتألف من بولي (الإيثيلين غليكول)-كتلة-poly(حمض اللبنيك) (PEG-PLA)27،34 التي تتفاعل لإنتاج شبكة فوق الجزيئية. وبشكل أكثر تحديدا، فإن دودسيل تعديل hydroxypropylmethyl السليلوز البوليمرات (HPMC-C12)تتفاعل بشكل حيوي مع سطح الجسيمات النانوية PEG-PLA والجسر بين هذه الجسيمات النانوية لتشكيل هذه الشبكة البوليمر27،34. هذه التفاعلات الديناميكية والمتعددة التكافؤ تسمح للمواد بالقص الرقيق أثناء الحقن والشفاء الذاتي بسرعة بعد الإدارة. مكونات هيدروجيل PNP هي ملفقة بسهولة من خلال ردود فعل بسيطة وعاء واحد ويتم تشكيل هيدروجيل PNP في ظل ظروف معتدلة عن طريق خلط بسيط من المكونين35. نظرا لسهولة التصنيع ، فإن منصة الهيدروجيل هذه قابلة للترجمة على نطاق واسع. يتم التحكم في الخصائص الميكانيكية وحجم الشبكة من الهيدروجيلات PNP عن طريق تغيير الوزن في المئة من مكونات البوليمر والجسيمات النانوية في التركيبة. تشير الدراسات السابقة مع هذه المنصة إلى أن الهيدروجيلات PNP متوافقة بيولوجيا للغاية وقابلة للتحلل الحيوي وغيرالمناعية 28و30و31. وعموما، تقدم هذه الهيدروجيلات فائدة واسعة في التطبيقات الطبية الحيوية التي تشمل الوقاية من التصاق بعد الجراحة، وهندسة الأنسجة وتجديدها، والتسليم المستدام للأدوية، والهندسة المناعية.

Protocol

قبل البدء في هذا البروتوكول، فمن الضروري لتوليف HPMC-C12 و PEG-PLA باستخدام الأساليب المنشورة سابقا27،28،29،30،31،36،37،38. 1. تخليق الجسيمات النانوية (NP) عن طريق النسيم النانوي ملاحظة: يصف هذا القسم توليف دفعة واحدة من NPs ، تنتج 250 ميكرولتر من 20 wt٪ NPs في محلول عازل (50 ملغ من بوليمر PEG-PLA الجاف لكل دفعة). يتم توفير ملاحظات لتوسيع عدد الدفعات في الخطوات ذات الصلة. قياس 50 ملغ من PEG-PLA البوليمر في قارورة 8 مل الزجاج التلألؤ وإضافة 1 مل من أسيتونيتريل. دوامة لتذوب تماما.ملاحظة: لزيادة عدد الدفعات، قم بتحجيم هذه الخطوة خطيا وأضف إجمالي كمية البوليمر والمذيبات اللازمة في قارورة واحدة. أضف 10 مل من المياه فائقة التبرير إلى قارورة تلألؤ زجاجية سعة 20 مل مع شريط تحريك صغير. يوضع على طبق من التقليب يحدد على 600 دورة في الدقيقة.ملاحظة: إذا تم تحجيم الخطوة 1.1، فإنه لا يزال من الضروري أن يكون قارورة التلألؤ الفردية لتسريع في كل دفعة مكافئة. على سبيل المثال، ل200 ملغ من البوليمر المذاب في 4 مل من أسيتونيتريل، وإعداد 4 × 20 مل قنينات التلألؤ. لتشكيل NPs عن طريق nanoprecipitation، إضافة 1 مل من محلول المذيبات البوليمر دروبيا في الماء باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. يحرك المزيج لمدة دقيقتين. كتلة جيش التحرير الشعبي من PEG-PLA ليست قابلة للذوبان في الماء، ونتيجة لذلك، فإن NPs قذيفة الأساسية الذاتي التجمع مع كتل PLA الكارهة للماء كما الأساسية وكتل PEG المائي كما قذيفة. تحقق من حجم الجسيمات عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS).ملاحظة: هذا الإجراء مكتوب خصيصا لقارئ لوحة متوفرة تجاريا مع حزمة البرامج المقترنة (راجع جدول المواد). لاستخدام أدوات بديلة، راجع أساليب إعداد العينة التي وصفتها الشركة المصنعة للجهاز. تمييع 20 ميكرولتر من محلول NP مع 80 ميكرولتر من المياه فائقة البور (تركيز التحليل: 1 ملغم / مل PEG-PLA NPs). إضافة 30 ميكرولتر لكل بئر إلى لوحة سوداء صافية 384-well (تحليل في ثلاثية). قياس نصف قطر الهيدروديناميكية وتعدد تشتت كل عينة مع قارئ لوحة DLS باستخدام خيارات بروتوكول مسبقا في حزمة البرامج. وكمثال على بروتوكول نموذجي، قم بتعيين معلمات جمع البيانات للحصول على قياسات 5-10 DLS لمدة 2-5 ق لكل عملية استحواذ ثم الإبلاغ عن متوسط حجم الجسيمات وتوزيعها لكل بئر، محسوبة من نموذج البروتينات الكروية. لتشكيل الهيدروجيلات ذات الخصائص الريولوجية المتسقة ، يجب أن تكون الجسيمات الناتجة 30-50 نانومتر في القطر الهيدروديناميكي مع تعدد الأضلاع (PD) < 0.2.ملاحظة: إذا كانت NPs أصغر من المطلوب، استخدم حلا من 75٪ أسيتونيتريل / 25٪ ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) في الخطوة 1.1. زيادة النسبة المئوية ل DMSO في المحلول المذيبات ستزيد بشكل عام حجم الجسيمات. نقل محلول NP من قارورة التلألؤ سعة 20 مل إلى وحدة فلتر طرد مركزي. جهاز طرد مركزي عند 4500 x g لمدة ساعة واحدة لتركيز محلول NP على <250 ميكرولتر. Resuspend في العازلة المطلوبة، مثل المالحة العازلة الفوسفات (PBS)، إلى 20 wt٪ NPs. Pipette محتويات وحدة تصفية الطرد المركزي في أنبوب الطرد المركزي المتقطر أو قارورة التلألؤ الزجاج على توازن الكتلة. استخدام كمية صغيرة (50-100 ميكرولتر) من العازلة لشطف مرشح وضمان جمع جميع NPs. إضافة العازلة للوصول إلى كتلة إجمالية قدرها 250 ملغ.ملاحظة: يمكن تجميع دفعات أثناء إعادة الإنفاق. يمكن تخزين حلول مخزون NP عند 4 درجة مئوية لمدة شهر تقريبا. لا تتجمد. للتخزين أطول، تحقق من حجم وتعدد الأضلاع بواسطة DLS قبل الاستخدام. 2. هيدروجيل صياغة وتغليف المخدرات أو الخلايا ملاحظة: يصف هذا القسم إعداد 1 مل من 2:10 PNP هيدروجيل صياغة, مع 2:10 تدل على 2 wt٪ HPMC-C12 و 10 wt٪ NPs (12 wt٪ مجموع البوليمر الصلب) و 88 wt٪ حل عازل, محلول شحن المخدرات, أو تعليق الخلية. يمكن أن تختلف النسب المئوية للصياغة لتسفر عن هيدروجيلات ذات مجموعة من الخصائص الميكانيكية. على سبيل المثال، استخدمت 1:5 هيدروجيلات PNP لتسوية الخلية والنتائج التجريبية الجدوى المبينة. إعداد حل المخزون من 6 wt٪ HPMC-C12 في برنامج تلفزيوني (أو المخزن المؤقت الأخرى من الاختيار). حل لمدة 48 ساعة لضمان البوليمر هو مشتتة تماما.ملاحظة: إن محلول مخزون HPMC-C12 مستقر لعدة أشهر عند درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، ينصح التخزين عند 4 درجة مئوية لمنع نمو الميكروبات. إضافة 333 ملغ من 6 wt٪ HPMC-C12 حل الأسهم في 1 مل لوير قفل حقنة. أضف 500 ميكرولتر من محلول مخزون NP 20 wt٪ إلى أنبوب طرد مركزي صغير. إضافة 167 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وماصة لخلط. باستخدام إبرة، وملء آخر 1 مل لوير قفل حقنة مع محلول NP المخفف.ملاحظة: لتحميل شحنة المخدرات، وحساب التركيز النهائي المطلوب من المخدرات في هيدروجيل وتحميل الكمية المناسبة في 167 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني التي يتم خلطها مع NPs. إذا كان المسبار الجزيئي ضروريا لإجراء فحص في الموقع ، مثل مراقبة استقرار الدواء ، قم بتحميل المسبار بطريقة مماثلة كما هو موضح أعلاه لتحميل شحنة الدواء. لتحميل الخلايا، حساب تركيز الخلية النهائي المطلوب في هيدروجيل وتحميل العدد المناسب من الخلايا في 167 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني التي يتم خلطها مع NPs. مزيج اثنين من مكونات هيدروجيل (HPMC-C12 وNPs) باستخدام طريقة خلطالكوع 35. إرفاق موصل الكوع لوير إلى المحقنة التي تحتوي على محلول NP (اختياريا تحتوي أيضا على شحنة المخدرات أو الخلايا). دفع حل NP من خلال الكوع حتى الغضروف المفصلي مرئيا في نهاية مفتوحة. تراجع قليلا وربط المحقنة التي تحتوي على حل HPMC-C12. ملاحظة: من المهم تقليل الهواء في اتصال الكوع لمنع تشكيل وتشتت الفقاعات في جميع أنحاء هيدروجيل أثناء عملية الخلط. عند خلط الخلايا مع خلاط الكوع، والحرص على خلط أكثر بلطف كما خلط بسرعة كبيرة جدا قد تخضع الخلايا لقوات القص عالية، مما يؤدي إلى موت الخلية. ضخ الحلين ذهابا وإيابا من خلال خلاط الكوع لمدة 60 دورة تقريبا حتى متجانسة، وقد شكلت المواد هيدروجيل الأبيض مبهمة. دفع الحجم الكامل من الهيدروجيل في حقنة واحدة. إزالة حقنة فارغة ورسم المكبس مرة أخرى على حقنة هلام محملة لاسترداد المواد من موصل الكوع. كاب مع إبرة أو قابس.ملاحظة: من الضروري حساب ~ 300 ميكرولتر من حجم الهيدروجيل المفقود بسبب المساحة الميتة في عملية الخلط. على سبيل المثال، إذا كان من المرغوب 700 ميكرولتر من حجم الهيدروجيل النهائي، ينبغي إعداد 1 مل من الهيدروجيل. ويمكن توسيع نطاق عملية تركيب الهيدروجيل باستخدام المحاقن الأكبر. ومع ذلك، بالنسبة لصياغات الهيدروجيل الصلبة، مثل 2:10، يمكن أن يصبح من الصعب خلط وحقن من المحاقن أكبر من 3 مل في الحجم بسبب زيادة نسبة برميل الحقنة إلى قطر الكوع أو الإبرة. تخزين الهيدروجيل في المحقنة في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، إذا تم تغليف الأدوية، ينصح التخزين عند 4 درجة مئوية ما لم يحدد الشركة المصنعة للدواء خلاف ذلك. لا تجمد المواد. 3. قياس الخصائص الريولوجية لصياغات الهيدروجيل ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول خصيصا مع مقياس الريمتر التجاري المذكور في جدول المواد مع هندسة لوحة مسننة 20 ملم. لاستخدام أدوات أخرى، راجع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد العينة. صياغة ما لا يقل عن 700 ميكرولتر من هيدروجيل PNP لتوصيف الريولوجي. حقن المواد في وسط لوحة الريمتر مسننة. يختلف المبلغ حسب الفجوة الهندسية المختارة. كمرجع، تتطلب الفجوة 700 ميكرومتر ~ 400-500 ميكرولتر من المواد. خفض الريمتر إلى الفجوة تقليم (500-1000 ميكرومتر) وتحويل ببطء لوحة الريمتر العلوي لأنها تجعل الاتصال مع هيدروجيل PNP لضمان سد الفجوة بالتساوي وتماما. فحص تحميل هيدروجيل PNP بحيث يغطي كامل سطح لوحة الريمتر. استخدام ملعقة أو أداة تشذيب البلاستيك لتقليم بلطف وإزالة أي مواد زائدة، بحيث يكون لديها انتفاخ طفيف جدا من لوحة. خفض الريمتر إلى الفجوة الهندسية النهائية والتحقق من تحميل العينة بشكل نظيف. قياس الخصائص الميكانيكية للعينة باستخدام اختبارات التذبذب، مثل السعة أو مسح التردد، أو اختبارات التدفق، مثل عمليات مسح التدفق أو اختبارات الخطوة.ملاحظة: في البيانات التمثيلية المعروضة، يتم تشغيل اختبارات السعة المتذبذبة بتردد ثابت قدره 10 راد/ثانية. يتم تشغيل عمليات تمشيط التردد المتذبذبة في سلالة ثابتة 1٪، داخل النظام اللزوجي الخطي لاكتساح السعة. تم تشغيل عمليات مسح التدفق من معدلات القص العالية إلى معدلات القص المنخفضة39. يتم الانتهاء من جميع الاختبارات مع 10 نقاط في العقد من البيانات التي تم جمعها وفي درجة حرارة الغرفة. قد تحتاج معلمات الاختبار إلى تعديل اعتمادا على خصائص التركيبة. يمكن أن يؤدي إخضاع مواد PNP الأكثر صلابة مثل تركيبات 2:10 إلى معدلات القص العالية إلى إخراج المادة من لوحات الريمتر ، مما يؤدي إلى توصيف ميكانيكي غير دقيق ، ويتطلب إعادة تحميل العينة بين الاختبارات اللاحقة. يمكن استخدام البيانات التمثيلية المبينة أدناه للمقارنة أثناء اختبار مراقبة الجودة. 4. وصف في المختبر إطلاق المخدرات إعداد أنابيب الشعرية عن طريق قطع أنابيب زجاجية الشعرية إلى الطول المطلوب. ختم نهاية واحدة من كل أنبوب باستخدام ملعقة المتاح أو تلميح ماصة لدفع كمية صغيرة من الايبوكسي في نهاية الأنبوب لتشكيل المكونات. السماح الايبوكسي لتعيين الوقت الموصى به لكل مصنع.ملاحظة: يجب أن يكون الأنبوب أقصر من طول إبرة الحقن. يوصى بالأنابيب ذات القطر الداخلي 2-3 ميكرومتر بحيث يحتوي طول 2.5 في على الأقل 300 ميكرولتر من الحجم الإجمالي. صياغة ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من مادة هيدروجيل PNP في حقنة تحتوي على الدواء المثير للاهتمام. إعداد كل مجموعة عينة في حقنة منفصلة. حقن 100-200 ميكرولتر من هيدروجيل PNP في الجزء السفلي من كل أنبوب الشعرية باستخدام إبرة تحت الجلد طويلة (22G، 4 بوصة). إعداد ثلاثة أنابيب على الأقل (ثلاثية القنوات) لكل مجموعة عينة. (اختياري) ضع أنابيب الشعرية المملوءة في أنبوب طرد مركزي مخروطي ومطرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1000 × ز لضمان أن يكون سطح الهيدروجيل موحدا. قد تحتاج هذه الخطوة إلى تكرارها ، وتغيير الوقت والسرعة حسب الضرورة لتنعيم سطح المادة.تنبيه: تأكد من أن جهاز الطرد المركزي متوازن بشكل جيد. ملء بعناية 200-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على رأس هيدروجيل في أنبوب الشعرية باستخدام حقنة وإبرة أو ماصة. لا تتصل أو تزعج سطح الهيدروجيل. ختم أنبوب مع غطاء أو سد أو تغطية مع ما لا يقل عن طبقتين من فيلم البارافين. (اختياري) احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمحاكاة في ظروف الجسم الحي. إزالة بعناية تماما برنامج تلفزيوني من كل الشعيرات الدموية، دون إزعاج سطح الهيدروجيل، وذلك باستخدام حقنة وإبرة في النقاط الزمنية المختارة اعتمادا على الجدول الزمني المتوقع لإطلاق المخدرات. استبدال وحدة التخزين التي تمت إزالتها مع برنامج تلفزيوني جديد. تخزين aliquots في ظل الظروف المناسبة.ملاحظة: يمكن تحسين الأحجام الموصى بها والنقاط الزمنية في الخطوات 4.3 و 4.5 و 4.7 لالتقاط إطلاق المخدرات في المختبر على مدى مجموعة من الجداول الزمنية ، اعتمادا على كمية الدواء التي يتم تحميلها في المواد ومدى سرعة إطلاقها في supernatant. يمكن أن تكون عينة من النقاط الزمنية المختارة 6 ساعة ويوم واحد و3 أيام وأسبوع واحد وأسبوعين لعقار بطيء الإطلاق. يمكن أيضا تحليل Aliquots كما يتم الحصول عليها بدلا من تخزينها. عند الانتهاء من الدراسة، تحليل aliquots مع طريقة مناسبة مثل ELISA، HPLC أو مضان المقايسة لتحديد كمية الدواء الصادرة في كل نقطة زمنية40،41،42. تختلف طريقة الكشف المناسبة اعتمادا على الدواء المثير للاهتمام.ملاحظة: دراسات إطلاق في المختبر مفيدة لمقارنة إطلاق بين تركيبات الهيدروجيل المختلفة أو شحن المخدرات. لا يشير مقياس وقت الإصدار في المختبر في كثير من الأحيان بشكل مباشر إلى مقياس زمني متوقع للافراج عنه في الجسم الحي. 5. توصيف الاستقرار الحراري للأنسولين هلام مغلفة صياغة ما لا يقل عن 1.2 مل من هيدروجيل PNP لكل مجموعة عينة. بعد الإجراء الموصوف في القسم 2.3، قم بتحميل كل من الأنسولين (شحنة الدواء) و thioflavin T (ThT) (المسبار الجزيئي) في هيدروجيل PNP.ملاحظة: الآلية الأساسية للتجميع، وبالتالي، تعطيل الأنسولين هو من خلال تشكيل الفيبريلات اميلويد. ThT هو مسبار جزيئي مناسب لأنه ينتج إشارة مضان قوية في وجود الفيبريلات الأميلويد ، مما يسمح بمراقبة تجميع الأنسولين في الموقع. اعتمادا على شحنة المخدرات ذات الأهمية، يمكن رصد التجميع من خلال طرق مختلفة. بالنسبة للبيانات التمثيلية المعروضة، تم تحميل الأنسولين إلى تركيز نهائي قدره 6.7 أو 10 ملغم/مل وThT إلى تركيز نهائي قدره 25 ميكرومتر. باستخدام إبرة 21 G، حقن 200 ميكروغرام من هيدروجيل PNP لكل بئر في لوحة سوداء 96 جيدا. وينبغي قياس كل مجموعة عينة في ثلاثة على الأقل. ختم لوحة مع ختم لوحة لاصقة واضحة بصريا لمنع التبخر. أدخل لوحة في قارئ لوحة مجهزة التحكم في درجة الحرارة، والهز، والبرمجة قراءة الحركية والبدء في قراءة البروتوكول. تم الحصول على بيانات تمثيلية باستخدام قارئ لوحات متاح تجاريا (انظر جدول المواد) باستخدام الشروط التالية: ظروف الشيخوخة المجهدة: اهتزاز خطي مستمر (410 cpm، 5 مم) عند 37 درجة مئوية. الحصول على البيانات: الإثارة/ الانبعاثات 450 نانومتر/482 نانومتر على فترات 20 دقيقةملاحظة: إذا كان قارئ لوحة مع التحكم في درجة الحرارة، شاكر، وقدرات القراءة الحركية غير متوفر، لوحة يمكن وضعها على لوحة شاكر في حاضنة وقراءتها يدويا في أعلى الأطوال الموجية في نقاط زمنية محددة. بيانات الرسم كإشارة مضان متوسطة بمرور الوقت لكل مجموعة. يمكن تحديد الوقت المحدد لتجميعها بتحديد عتبة الإشارة التعسفية43.ملاحظة: بالنسبة للبيانات التمثيلية المبينة أدناه، عرفت العتبة بأنها 000 750 وحدة مضانة تعسفية. وقد اختيرت هذه القيمة لتكون أعلى من خط الأساس المقاس بينما لا تزال تلتقط بشكل كاف بداية التجميع التي تشير إليها زيادة حادة في الإشارة الفلورية. إنهاء المقايسة عند تجميع العينات أو البدء بصريا في الجفاف. 6. تقييم قابلية الخلية للحياة صياغة ما لا يقل عن 2 مل من هيدروجيل PNP التي تحتوي على تركيز الخلية المطلوبة التالية فوق البروتوكولات (عادة 1 -5 × 106 خلايا / مل). إعداد كل مجموعة عينة في حقنة منفصلة. باستخدام إبرة 21G، حقن 150 ميكرولتر PNP هيدروجيل في كل بئر في لوحة صافية أسفل 96 جيدا. كل بئر هو تكرار واحد. يجب أن يكون لكل مجموعة عينة 3-5 نسخ متماثلة لكل نقطة زمنية. الطرد المركزي لوحة في 50 × ز لمدة 2 دقيقة لنشر هيدروجيل بالتساوي في البئر. إضافة 100 ميكرولتر من وسائط الخلية المناسبة على رأس هيدروجيل. إزالة هذه الوسائط كل يوم وإضافة وسائط جديدة 100 ميكرولتر. في اليوم الأول، قم بإزالة الوسائط الموجودة أعلى الهيدروجيل للنسخ المتماثلة المعينة لتلك النقطة الزمنية لكل مجموعة عينة. إضافة 50 ميكرولتر من محلول 2 mM calcein AM على رأس الهيدروجيلات. حضانة لمدة 30 دقيقة.ملاحظة: يمكن استخدام Calcein AM لتعريف وتسمية الخلايا الحية. في الخلايا الحية، يتم تحويل كالسين AM غير الفلورية إلى كالسين الأخضر الفلوري، عن طريق esterases داخل الخلايا بعد تحلل إستر أستر أسيتوكسي ميثيل. صورة مركز كل بئر في لوحة 96 جيدا باستخدام المجهر confocal. مسح مساحة لا تقل عن 300 ميكرومتر2 مع كومة z تمتد على الأقل 150 ميكرومتر. استخدام إعدادات الطول الموجي confocal لالتقاط مضان كالسين (الإثارة / الانبعاثات: 495 نانومتر/515 نانومتر). كرر الخطوة 6.4 و 6.5 لكل نقطة زمنية لاحقة كما هو مطلوب. لتحليل كل صورة، قم بطي جميع صور z-stack في صورة ذات كثافة قصوى على مستوى واحد باستخدام فيجي أو برامج مشابهة. تحديد عدد الخلايا الفلورية في كل صورة. نسبة عدد الخلايا الفلورية في كل نقطة زمنية مقارنة بعدد الخلايا الفلورية في اليوم الأول هي صلاحية الخلية النسبية في هيدروجيلس PNP. 7. تقييم تسوية الخلايا حساب عدد الخلايا المطلوبة لصياغة 500-700 ميكرولتر من هيدروجيل PNP بتركيز نهائي قدره 5 × 106 خلايا / مل. تعليق الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني بتركيز 1 × 106 خلايا / مل. خلايا وصمة عار بإضافة 50 ميكرولتر من 2 mM calcein AM. احتضان الخلايا مع صبغ لمدة 10 دقيقة. خلايا الطرد المركزي في الظروف المناسبة، وإزالة برنامج تلفزيوني وإعادة إنفاق الخلايا في حجم برنامج تلفزيوني اللازمة لتشكيل 500-700 ميكرولتر من هيدروجيل PNP المطلوب.ملاحظة: عادة ما يتم توفير السرعة والمدة الموصى بها للطرد المركزي لكل نوع خلية محددة في وثائق المنتج. صياغة 500-700 ميكرولتر من هيدروجيل PNP مع الخلايا الملطخة (5 × 106 خلايا / مل) بعد قسم البروتوكول 2. باستخدام إبرة 21G، حقن 100-200 ميكرولتر من هيدروجيل PNP التي تحتوي على الخلايا الملطخة في الجزء السفلي من cuvette. يجب إجراء ثلاث نسخ متماثلة لكل عينة. تحريك الإبرة ذهابا وإيابا داخل cuvette أثناء الحقن لمنع تشكيل فقاعة. على الفور (الوقت ر = 0) ، صورة cuvettes ملقاة على جانبهم على كامل منطقة مستطيل cuvette شقة في قاعدة cuvette. استخدم قدرات المسح الضوئي للبلاط البؤري لتصوير منطقة البئر بأكملها وصورة مكدس z في 3D عبر عمق 100 ميكرومتر. لتصور في وقت لاحق، إما استخدام برنامج المجهر confocal لغرزة معا كل من البلاط الفردية وأداء الإسقاط كثافة قصوى لتشكيل صورة واحدة من مساحة كبيرة أو استخدام برنامج فيجي على جهاز كمبيوتر شخصي44،45. بعد التصوير، والوقوف على cuvettes تستقيم. الصورة عند 1 ساعة و 4 ساعة لمراقبة ما إذا كانت الخلايا قد استقرت في الهيدروجيل أو ما إذا كانت لا تزال معلقة.ملاحظة: هذه النقاط الزمنية اقتراحات ويمكن تعديلها كما هو مطلوب. لتحليل كل صورة، قم بطي جميع صور z-stack في صورة ذات كثافة قصوى على مستوى واحد. باستخدام فيجي أو برامج مماثلة، حدد حجم توزيع الخلية عن طريق قياس كثافة الفلورسينس أسفل الملف العمودي المركزي للكوفيت لتحديد درجة الاستقرار.

Representative Results

تصنيع هيدروجيل PNP وتوصيفهاتتشكل الهيدروجيلات PNP من خلال خلط المكونين الأساسيين – البوليمرات HPMC المعدلة هيدروفوبيكيلي والجسيمات النانوية PEG-PLA (الشكل 1a). يتم دمج الشحنات العلاجية بسهولة أكبر في العازلة الإضافية المستخدمة لتخفيف مكون الجسيمات النانوية قبل إعداد الهيدروجيل. لتوصيف الطب الحيوي المصب، فمن المريح استخدام طريقة خلط الكوع التي تمكن خلط بسيطة وقابلة للاستنساخ من المكونين(الشكل 1ب). بعد خلط كافية، وينبغي أن يشعر هيدروجيل شركة في الحقنة، ولكن العائد تحت الضغط واستئصال من إبرة القياسية (21G هو مبين) (الشكل 1c). بعد الحقن ، يجب أن يتم تعيين الهيدروجيل بسرعة في مادة صلبة تشبه التي تقاوم التدفق من الجاذبية. لتوصيف الهيدروجيل بشكل كامل وضمان المنتجات المتسقة من دفعة إلى دفعة ، يجب تحليل العينات باستخدام العديد من التجارب المختلفة على الريمتر. وسيتم بسهولة رصد قدرات القص والشفاء الذاتي من هلام باستخدام بروتوكول الاجتياح تدفق وبروتوكول خطوة القص، على التوالي (الشكل 2a، ب). بالنسبة للجل الأكثر صلابة ، مثل تركيبة 2:10 ، يجب على المستخدم البحث عن اللزوجة لتقليل أمرين على الأقل من الحجم أثناء اكتساح التدفق حيث يتم زيادة معدل القص من 0.1 إلى 100 s-1، والذي يحاكي الظروف الميكانيكية أثناء الحقن. يجب أن يكشف بروتوكول القص خطوة انخفاض أوامر من الحجم في اللزوجة تحت الخطوات عالية القص، والعودة السريعة (<5 ق وقت الاسترداد) إلى لزوجة خط الأساس خلال خطوات القص منخفضة. يجب أن يكشف توصيف معامل التخزين والخسارة باستخدام تجربة اكتساح تردد القص المذبذب في النظام اللزوجي الخطي عن خصائص صلبة تشبه الترددات تتراوح من 0.1-100 راد s-1 (الشكل 2c). على وجه الخصوص، لا ينبغي أن يكون هناك عادة كروس من تخزين القص والخسارة moduli التي يمكن ملاحظتها في الترددات المنخفضة لصياغات أكثر صلابة مثل هيدروجيلس 2:10. قد يشير حدث الانتقال هذا إلى مشكلات في جودة مواد البدء ، إما HPMC المعدلة أو بوليمر PEG-PLA ، أو حجم وتشتت الجسيمات النانوية PEG-PLA. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن توقع حدوث انتقال لصياغات هيدروجيل أضعف، مثل الهيدروجيل 1:5. وتكشف عمليات تمشيط سعة القص المتذبذبة على الهيدروجيلات PNP أن المواد لا تنتج حتى يتم تطبيق قيم الإجهاد العالية ، مما يشير إلى أن هذه المواد تمتلك إجهادا في الغلة ، وهو مقدار عتبة من الإجهاد المطلوب لتدفق المواد. توصيف حركيات الإطلاق من الهيدروجيلات PNPخطوة أساسية في تصميم المواد الهلامية PNP لتسليم المخدرات هو توصيف الحركية إطلاق المخدرات من صياغة مختارة. هناك العديد من التقنيات لهذا، ولكن منهجية بسيطة في المختبر يوفر بيانات مفيدة خلال تطوير صياغة مبكرة(الشكل 3a). تغيير محتوى البوليمر من هيدروجيلس PNP من خلال تحوير كمية HPMC-C12 أو NPs هو الطريقة الأكثر مباشرة لضبط الخصائص الميكانيكية وحجم شبكة من هذه الهيدروجيلات، والتي يمكن أن يكون لها تأثير مباشر على نشر البضائع من خلال شبكة البوليمر ومعدل الإفراج عن المواد (الشكل 3ب). بالنسبة للبضائع التي هي أكبر من حجم الشبكة الديناميكية (أي الوزن الجزيئي العالي أو نصف القطر الهيدروديناميكي الكبير) ، يجب أن يتوقع الباحثون إطلاقا بطيئا بوساطة الانحلال للبضائع من مستودع الهيدروجيل. الصيغ ذات أحجام شبكة ديناميكية أكبر من أو مساوية لحجم الشحنة سوف تسمح للنشر بوساطة الإفراج التي يمكن وصفها باستخدام النماذج التقليدية لنشر البضائع وإطلاقسراح 46،47،48،49. واستنادا إلى شكل منحنى الإطلاق، يمكن للباحثين إعادة صياغة الهيدروجيل لضبطه نحو إطلاق أبطأ (على سبيل المثال، زيادة محتوى البوليمر) أو أسرع (على سبيل المثال، تقليل محتوى البوليمر). تقييم استقرار الشحن العلاجيتحديد استقرار البضائع العلاجية في تركيبة هيدروجيل أمر بالغ الأهمية قبل البدء في الدراسات قبل السريرية أو الخلوية. وبالمقارنة مع الأساليب الاصطناعية الأخرى لتغليف المخدرات، تدمج الهيدروجيلات PNP البضائع بطريقة لطيفة عن طريق الاختلاط في المواد السائبة، ومن غير المرجح أن التغليف سيضر الشحنة. وتشير هذه الدراسات إلى أن الهيدروجيلات PNP يمكن أيضا استقرار البضائع التي هي عرضة لعدم الاستقرار الحراري، مثل الأنسولين، وإطالة العمر الافتراضي إلى حد كبير والحد من الاعتماد على التخزين البارد والتوزيع (الشكل 4). من المهم تقييم حالة الشحنة مباشرة بعد التغليف في الهيدروجيل وكذلك بعد فترات طويلة من التخزين. تظهر هذه البيانات أن الأنسولين لا يزال مستقرا في الهيدروجيلات بعد 28 يوما من التخزين تحت الإجهاد الحراري والميكاني المستمر ، باستخدام اختبار مضان بسيط لقياس تجميع الأنسولين. ومن الأساليب البديلة للحالات التي لا يتوفر فيها فحص مناسب للصفائح إجراء قياسات دائرية للديكروزم للشحنة، وهو أمر مفيد بشكل خاص لتحديد الهيكل الثانوي لأدوية البروتين. تحديد صلاحية الخلية وتشتتها في الهيدروجيلات PNPتتطلب العديد من الخلايا العلاجية زخارف التصاق لتبقى قابلة للحياة ، وبالتالي فإن إدراج زخارف integrin مثل الببتيدات حمض أرجينين الجليسين الأسبارتيك (RGD) هو خطوة مهمة في تكييف الهيدروجيل PNP للعلاجات الخلوية50. وحدات PEG-البوليمر جيش التحرير الشعبي تتألف من NPs تمكن الوظيفية الكيميائية من هالة PEG من خلال كيمياء “انقر” بسيطة28،51. في هذا المثال، تم إرفاق الببتيدات RGD لاصقة الخلية إلى البوليمر PEG-PLA لتعزيز مشاركة الخلية مع هيكل هيدروجيل PNP. التركيبات التي تفتقر إلى مواقع الالتصاق سيكون لها قابلية منخفضة للخلايا حيث تفشل الخلايا المغلفة في الانتشار مقارنة بالخلايا المغلفة في تركيبات مع هذه الزخارف التصاق (الشكل 5a، ب). يمكن تسمية الخلايا المغلفة بالكالسين AM أو صبغة فلورية مناسبة أخرى (على سبيل المثال ، CFSE) لتسهيل عد الخلايا بمجهر مضان. أثناء التحسين ، ينبغي مقارنة الجدوى مع الهيدروجيلات PNP غير المعدلة لضمان التركيبات الوظيفية integrin توفر تعزيز الجدوى والانتشار. إذا كانت التركيبات الوظيفية integrin توفر فعالية مماثلة للهيدروجلز غير المعدلة ، فقد يشير هذا إلى فشل في كيمياء التضمين المستخدمة لدمج زخارف الالتصاق. يجب أن يتوقع الباحثون أن تكون الخلايا المغلفة موزعة بالتساوي من خلال وسيط الهيدروجيل عند استخدام تركيبة هيدروجيل مناسبة. وهذا سيسمح بال دوس الخلايا بشكل متسق ويمكن التنبؤ به أثناء إدارة الهيدروجيل وينبغي أن يترجم إلى الاحتفاظ المحلي بالخلايا في الهيدروجيل بعد الإدارة. يمكن تحديد توزيع الخلايا بسهولة باستخدام تقنيات المجهر الفلوري. يمكن تسمية الخلايا بصبغة مناسبة ثم تصويرها باستخدام المجهر البؤري. ويمكن تقييم الصور بصريا(الشكل 5C)وأيضا كميا(الشكل 5D)باستخدام برنامج ImageJ لقياس متوسط كثافة الفلورسينس على طول المحور الرأسي للصورة (أو على طول أي محور الخلية تسوية بسبب الجاذبية ومن المتوقع أن يحدث). إذا كانت تركيبة الهيدروجيل ضعيفة جدا لدعم الخلايا في التعليق على مدى أطر زمنية طويلة ، فإن تسوية الخلايا ستحدث ، كما لوحظ في صياغة 1:1 في الشكل 5. زيادة محتوى البوليمر يمكن حل القضايا مع تشتت الخلايا غير متجانسة بسبب تسوية. الشكل 1:تتشكل الجسيمات النانوية البوليمرية (PNP) هيدروجيلس بسهولة عن طريق خلط مكونين. (أ ) المكون الأول هو حل السليلوز الهيدروكسي بروبليميثيل المعدلة دوديسيل (HPMC-C12)،والمكون الثاني هو حل البولي (الإيثيلين غليكول)-كتلة-poly(حمض اللبنيك) (PEG-PLA) الجسيمات النانوية جنبا إلى جنب مع أي البضائع العلاجية. خلط لطيف من هذين العنصرين تسفر عن هيدروجيل عن طريق الحقن، حيث يتم ربط البوليمرات HPMC-C12 جسديا من خلال التفاعلات الديناميكية والمتعددة التكافؤ مع الجسيمات النانوية PEG-PLA. (ب) صورة فوتوغرافية تثبت تركيبة الجل عن طريق الخلط مع حقنتين، كل واحدة تحتوي على مكون واحد من هيدروجيل PNP. من خلال ربط المحاقن اثنين مع موصل الكوع لوير قفل، يمكن خلط المكونين بسهولة في ظل ظروف معقمة لتسفر عن هيدروجيل خالية من فقاعة محملة مسبقا في حقنة للاستخدام الفوري. مصبوغ حل NP الأزرق لغرض العرض التوضيحي. (ج)عرض عملي لحقن الهيدروجيلات PNP وإعادة تماسكها. ‘1’ هيدروجيل PNP في حقنة مع إبرة 21G المرفقة. ‘2’ يضع الحقن الهيدروجيل تحت القص الذي يكسر مؤقتا التفاعلات بين البوليمر والجسيمات النانوية، مما يخلق اتساقا يشبه السوائل. ‘3’ بعد الحقن، فإن التفاعلات الدينامية بين البوليمر والجسيمات النانوية تتسارع في الإصلاح، مما يسمح للهيدرجيل بالشفاء الذاتي في مادة صلبة. ‘4’ لا يتدفق الهيدروجيل الصلب تحت قوى أضعف من إجهاد الغلة، مثل الجاذبية. هيدروجيل PNP مصبوغ باللون الأزرق لغرض المظاهرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2:التوصيف الريولوجي لصياغات هيدروجيل PNP. ويشار إلى تركيبات كما wt.٪: NP wt.٪. (أ) تدفق القص ثابت يكتسح من معدل القص المنخفض إلى العالي من هيدروجيلس PNP. اللزوجة كدالة لمعدل القص يميز خصائص القص رقيق. (ب)اللزوجة كدالة لتذبذب معدلات القص بين معدلات القص المنخفضة (الخلفية البيضاء؛ 0.1 s−1)إلى معدلات القص العالية (الخلفية الحمراء؛ 10 s−1)مما يدل على خصائص الشفاء الذاتي من الهيدروجيل PNP. يتم فرض معدلات القص لمدة 30 s لكل منهما. (ج) مرنة معامل التخزين G′ ولزجة فقدان المغير G” كدالة التردد في سلالة ثابتة 1٪ لمختلف الصياغات هيدروجيل PNP. (د)السعة يكتسح على تردد ثابت من 10 راد / ثانية لتوصيف معامل التخزين المرن G′ وزهاء فقدان المغير G” من هيدروجيلس PNP كدالة الإجهاد. ويمكن استخدام هذا الوصف الريولوجي كمقارنة لمراقبة الجودة. وقد تم اقتباس هذا الرقم من Grosskopf وآخرون28يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: الافراج في المختبر من الألبومين مصل البقري (جيش تحرير الشعبة) من هيدروجيلس PNP. ويشار إلى تركيبات كما wt.٪: NP wt.٪. (أ)التخطيطي واصفا التجريبية في المختبر بروتوكول الافراج. تتم إزالة Aliquots من أنابيب الشعيرات الدموية المحملة ب PNP مع مرور الوقت. (ب)الإفراج في المختبر من BSA من 1:10 PNP، 2:5 PNP و 2:10 PNP ذكرت كما كتلة التي تم جمعها من قبل نقطة زمنية محددة مقسوما على مجموع الكتلة التي تم جمعها خلال المقايسة (البيانات المبينة على أنها متوسط ± SD؛ ن = 3). تم الكشف عن BSA من خلال قياسات الامتصاص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: الاستقرار الحراري للأنسولين مغلفة في هيدروجيلس PNP بواسطة المقايسة ThT. ويشار إلى تركيبات كما wt.٪: NP wt.٪. الأنسولين مغلفة في كل من 1:5 و 2:10 ظلت هيدروجيل PNP unaggregated لأكثر من 28 يوما في ظروف الشيخوخة وشدد من 37 درجة مئوية والهياج المستمر. وكان الوقت لتجميع للأنسولين وضعت في برنامج تلفزيوني 20 ± 4 ساعة (متوسط ± SD، عتبة التجميع 750،000 AFU). البيانات المقدمة كمتوسط n = 4 نسخ تجريبية (AFU، وحدات مضان تعسفية). تم اقتباس هذا الرقم من ميس وآخرون38الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5:صلاحية الخلية واستقر الخلية في هيدروجيلس PNP. (أ، ب) دراسات جدوى الخلية في هيدروجيلس PNP مع الخلايا الجذعية المتوسطة البشرية (hMSCs). (أ)صور تمثيلية من hMSCs قابلة للحياة في 1:5 PNP هيدروجيلس مع وبدون الخلية لاصقة أرجينين-الجليسين-الأسبارتيك حمض (RGD) عزر المقترنة PEG-PLA NPs. hMSCs كانت ملطخة كالسين لمدة 30 دقيقة قبل التصوير الكونفوجال. يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر (ب) صلاحية الخلية في اليوم السادس المعرف بعدد الخلايا الفلورية في الصورة بالنسبة لعدد الخلايا الفلورية في اليوم الأول (البيانات المعروضة على أنها متوسط ± SD؛ ن = 3). (ج, د) تغليف الخلية وتسوية التجارب مع hMSCs. (ج) صور الكثافة القصوى للكالسين AM-الملون hMSCs مغلفة في 1:1 PNP هيدروجيل (الصف العلوي) و 1:5 PNP هيدروجيل (الصف السفلي) عبر 4 ساعة لتحديد خلية تسوية. يمثل شريط المقياس 1 مم (د) متوسط كثافة البكسل الأفقي ل hMSCs على طول الملف العمودي للهيدرجيل. وقد تم اقتباس هذا الرقم من Grosskopf وآخرون28يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يتم تصنيع هيدروجيل البوليمر النانوي (PNP) بسهولة وتمكين التسليم المحلي طويل الأجل للخلايا العلاجية والأدوية من خلال الإدارة طفيفة التوغل عن طريق الحقن المباشر أو توصيل القسطرة. وتصف هذه البروتوكولات صياغة الهيدروجيلات من الشرطة الوطنية الفلبينية وطرق توصيف ضمان جودة المواد الناتجة. الهيدروجيلات PNP فوق الجزيئية قابلة للتطوير لتصنيعها ويتم تشكيلها من خلال الخلط البسيط لبوليمرات السليلوز المعدلة والجسيمات النانوية البوليمرية الأساسية القشرية. تصف الأساليب الحالية الإجراءات السهلة لتشكيل المواد الهلامية المحملة مسبقا في المحاقن من خلال بروتوكولات خلط الكوع البسيطة. من خلال مقاييس مراقبة الجودة لكل جزء من الأجزاء المكونة ، مثل DLS لرصد حجم وتوزيع NP ، يمكن للمرء أن يصوغ مواد هيدروجيل PNP بشكل مستنسخ مع خصائص ريولوجية متسقة. من خلال تغيير كمية HPMC-C12 أو NPs ، يمكن للمرء تعديل حجم الشبكة وتصلب هيدروجيل PNP الناتج. يمكن ضبط هذه الخصائص لتناسب تطبيق الطب الحيوي خاصة، ومع أساليب الريولوجية مفصلة هنا يمكن للباحثين توصيف خصائص القص رقيق والشفاء الذاتي من الهيدروجيلات PNP لأنها تحسين منصة لتطبيقاتها المحددة. كما تم وصف طرق دراسات الإطلاق في المختبر؛ يمكن للباحثين استخدام هذه الدراسات لتوصيف النطاق الزمني النسبي لإطلاق الأدوية ذات الأهمية ، وإبلاغ المستقبل في دراسات الجسم الحي. باستخدام دراسات الاستقرار، يمكن للباحثين أيضا تقييم قدرة هذه المواد للمساعدة في الحفاظ على البنية البيولوجية والاستقرار من العلاج الحيوي الحساسة مع مرور الوقت ودرجات الحرارة القصوى، مع تطبيقات محتملة مقنعة للحد من الاعتماد على سلسلة التبريد من العلاج الحيوي. وأخيرا، مع اختبارات بسيطة حيوية الخلية، يمكن تقييم نمو الخلايا والهجرة داخل المواد PNP، مع التطبيقات المحتملة في العلاجات الخلوية والسقالات.

وقد وجدت مجموعتنا العديد من التطبيقات مقنعة لمنصة هيدروجيل PNP27. وقد استخدمت الهيدروجيلات PNP لبطء تسليم اللقاحات وحدة فرعية، وتمكين ملامح إطلاق الحركية المتطابقة من المستضدات والمواكب لتعزيز حجم ومدة وجودة الاستجابة المناعية الفكاهية31. وقد تم العثور على الهيدروجيلات PNP أن يكون حجم شبكة أصغر من الهيدروجيل الأكثر استخداما، لذلك فهي فعالة في إبطاء الانتشار والإفراج ببطء البضائع الجزيئية. كما تم استخدام خصائص الالتزام الأنسجة الفريدة والخصائص الميكانيكية للهيدروجلز PNP لتشكيل حواجز مادية لمنع الالتصاقات الناشئة عن الجراحة عن طريق رش الهيدروجيلس على مساحات سطحية كبيرة من الأعضاء بعد الجراحة30. وقد ثبت أيضا أن الهيدروجيل PNP مركبات توصيل الخلايا فعالة، والخصائص الميكانيكية في الواقع درع الخلايا من القوى الميكانيكية التي تحدث في إبرة حقنة أثناء الحقن، وتحسين قدرة الخلية علىالبقاء 29. عندما يتم اقتران NPs مع الببتيد لاصقة الخلية، يمكن للخلايا إرفاق والتفاعل مع مصفوفة PNP لتبقى قابلة للحياة. باستخدام هذا النهج، وقد ثبت هيدروجيلس PNP لتحسين الاحتفاظ المحلية من الخلايا الجذعية المحقونة مقارنة مع الأساليب التي تستخدم المركبات السائلة28. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت هيدروجيلس PNP لمنع تجميع الناجم حراريا من الأنسولين مغلفة، حتى في ظل ظروف الشيخوخة وشدد قاسية، مما يشير إلى أن هذه المواد قد تكون قادرة على الحد من الحاجة إلى تبريد الأدوية الحساسة لدرجة الحرارة38.

وعموما، فإن المنهجيات الموصوفة هنا ستسمح لمجموعات البحوث بتصنيع واستكشاف الهيدروجيلات PNP كما هو مادي حيوي. توفر هذه البروتوكولات تقنيات التوليف على نطاق المختبر لتصنيع ما يكفي من المواد الهيدروجيل لمتابعة كل من المختبر وفي الدراسات الحية. وتشير الدراسات المذكورة أعلاه إلى أن الروابط الديناميكية لهذه المواد تمكنها من أن تكون مناسبة لمجموعة من التطبيقات الطبية الحيوية من خلال السماح بالحركية النشطة للخلايا المحاصرة مع تقييد الانتشار السلبي للشحن الجزيئي. ومن المتوقع أن يجد الباحثون منصة الشرطة الوطنية الفلبينية أداة سهلة المنال وقوية لتحسين النتائج السريرية من خلال تسليم الأدوية الخاضعة للرقابة ودراسة الآليات البيولوجية الأساسية مثل تجنيد الخلايا وعلم الأحياء الميكانيكية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث ماليا من قبل مركز المناعة للأنظمة البشرية مع مؤسسة بيل وميليندا غيتس (OPP1113682) ومؤسسة بيل وميليندا غيتس (OPP1211043). C.M.M. تم دعمها من قبل زمالة ستانفورد للدراسات العليا وزمالة ستانفورد بيو إكس ويليام وليندا ستيار. وامتنانا لشهادة زمالة أبحاث الدراسات العليا التي منحتها المؤسسة الوطنية للعلوم، وزمالة جابيلان لزمالة ستانفورد للخريجين في العلوم والهندسة. S.C. تم دعمه من قبل المعهد الوطني للسرطان للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم F32CA247352. كما يود المؤلفون أن يعترفوا بحرارة بأعضاء مختبر أبيل بمن فيهم الدكتور جيلي روث، والدكتور أنتوني يو، والدكتور ليندساي ستابلتون، والدكتور هيكتور لوبيز هرنانديز، والدكتور أندريا داكينو، والدكتورة جولي بيليه، وسيلين ليونغ، وبن أو، وإميلي ميني، وإميلي غيل، والدكتور أنطون سميث لجهودهم ووقتهم في مساعدة مختبر أبيل على تطوير هذه البروتوكولات على مر السنين.

Materials

21G needles BD 305165 PNP hydrogel injection
22G, 4 in hypodermic needles Air-Tite N224 In vitro release studies
384-well plates, black, clear bottom Corning 3540 Dynamic light scattering (DLS)
96-well plates, black Fisher Scientific 07-200-627 Biostability studies
96-well plates, clear Corning 3599 Cell viability and settling studies
Calcein AM Thermo Fisher Scientific C3100MP Cell viability and settling studies
Capillary tubes McMaster-Carr 8729K66 In vitro release studies
Centrifugal filter units Fisher Scientific UFC901024 NP concentration
Cuvettes Millipore Sigma BR759015-100EA Cell viability and settling studies
DLS Plate Reader Wyatt Technology DynaPro II Plate Reader Dynamic light scattering (DLS)
Epoxy VWR International 300007-392 (EA) In vitro release studies
Hypodermic needles Air-Tite 8300015027 In vitro release studies
Luer elbow connector Cole-Parmer EW-30800-12 PNP hydrogel formulation
Luer lock syringe Fisher Scientific 14-955-456 PNP hydrogel formulation
Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher Scientific 10010049 PNP hydrogel formulation
Plastic Spatula Thomas Scientific 1229F13 Rheological characterization
Plate Reader BioTek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader Biostability studies
Plate seals Excel Scientific TS-RT2-100 Biostability studies
Recombinant human insulin Gibco A11382II Biostability studies
Rheometer TA Instruments DHR-2 Rheometer Rheological characterization
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G Biostability studies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandal, A., Clegg, J. R., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Hydrogels in the clinic. Bioengineering Translational Medicine. 5 (2), 10158 (2020).
  2. Appel, E. A., del Barrio, J., Loh, X. J., Scherman, O. A. Supramolecular polymeric hydrogels. Chemical Society Reviews. 41 (18), 6195-6214 (2012).
  3. Mann, J. L., Yu, A. C., Agmon, G., Appel, E. A. Supramolecular polymeric biomaterials. Biomaterials Science. 6 (1), 10-37 (2018).
  4. Foster, A. A., Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. The diverse roles of hydrogel mechanics in injectable stem cell transplantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 15, 15-23 (2017).
  5. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  6. Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. Design of injectable materials to improve stem cell transplantation. Current Stem Cell Reports. 2 (3), 207-220 (2016).
  7. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Current Opinion in Biotechnology. 24 (5), 841-846 (2013).
  8. Marquardt, L. M., et al. Designer, injectable gels to prevent transplanted Schwann cell loss during spinal cord injury therapy. Science Advances. 6 (14), 1039 (2020).
  9. Stephan, S. B., et al. Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-cell therapy. Nature Biotechnology. 33 (1), 97-101 (2015).
  10. Tuladhar, A., et al. Injectable hydrogel enables local and sustained co-delivery to the brain: two clinically approved biomolecules, cyclosporine and erythropoietin, accelerate functional recovery in rat model of stroke. Biomaterials. 235, 119794 (2020).
  11. Pakulska, M. M., Miersch, S., Shoichet, M. S. Designer protein delivery: From natural to engineered affinity-controlled release systems. Science. 351 (6279), (2016).
  12. Gupta, D., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to the injured spinal cord. Biomaterials. 27 (11), 2370-2379 (2006).
  13. Verbeke, C. S., Mooney, D. J. Injectable, pore-forming hydrogels for in vivo enrichment of immature dendritic cells. Advanced Healthcare Materials. 4 (17), 2677-2687 (2015).
  14. Tous, E., Purcell, B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Injectable acellular hydrogels for cardiac repair. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (5), 528-542 (2011).
  15. Zhao, X., et al. Antibacterial anti-oxidant electroactive injectable hydrogel as self-healing wound dressing with hemostasis and adhesiveness for cutaneous wound healing. Biomaterials. 122, 34-47 (2017).
  16. Johnson, T. D., Christman, K. L. Injectable hydrogel therapies and their delivery strategies for treating myocardial infarction. Expert Opinion on Drug Delivery. 10 (1), 59-72 (2013).
  17. Kleinman, H. K., Martin, G. R. . Seminars in Cancer Biology. , 378-386 (2005).
  18. Hickey, J. W., et al. Engineering an artificial T-cell stimulating matrix for immunotherapy. Advanced Materials. 31 (23), 1807359 (2019).
  19. Baumann, M. D., et al. An injectable drug delivery platform for sustained combination therapy. Journal of Controlled Release. 138 (3), 205-213 (2009).
  20. Trappmann, B., et al. Matrix degradability controls multicellularity of 3D cell migration. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  21. Figueiredo, L., et al. Assessing glucose and oxygen diffusion in hydrogels for the rational design of 3D stem cell scaffolds in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (5), 1238-1246 (2018).
  22. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. , 1-24 (2019).
  23. Chaudhuri, O., et al. Substrate stress relaxation regulates cell spreading. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  24. Cai, L., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Injectable hydrogels with in situ double network formation enhance retention of transplanted stem cells. Advanced Functional Materials. 25 (9), 1344-1351 (2015).
  25. Fisher, S. A., Baker, A. E., Shoichet, M. S. Designing peptide and protein modified hydrogels: selecting the optimal conjugation strategy. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7416-7427 (2017).
  26. Li, R. H., Altreuter, D. H., Gentile, F. T. Transport characterization of hydrogel matrices for cell encapsulation. Biotechnology and Bioengineering. 50 (4), 365-373 (1996).
  27. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6 (6295), (2015).
  28. Grosskopf, A. K., et al. Injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels enhance human mesenchymal stem cell delivery. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (1), 10147 (2020).
  29. Lopez Hernandez, H., Grosskopf, A. K., Stapleton, L. M., Agmon, G., Appel, E. A. Non-newtonian polymer-nanoparticle hydrogels enhance cell viability during injection. Macromolecular Bioscience. 19 (1), (2019).
  30. Stapleton, L. M., et al. Use of a supramolecular polymeric hydrogel as an effective post-operative pericardial adhesion barrier. Nature Biomedical Engineering. 3 (8), 611-620 (2019).
  31. Roth, G. A., et al. Injectable hydrogels for sustained codelivery of subunit vaccines enhance humoral immunity. ACS Central Science. , (2020).
  32. Steele, A. N., et al. A biocompatible therapeutic catheter-deliverable hydrogel for in situ tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), 1801147 (2019).
  33. Fenton, O. S., et al. Injectable polymer-nanoparticle hydrogels for local immune cell recruitment. Biomacromolecules. 20 (12), 4430-4436 (2019).
  34. Yu, A. C., Smith, A. A., Appel, E. A. Structural considerations for physical hydrogels based on polymer-nanoparticle interactions. Molecular Systems Design & Engineering. 5 (1), 401-407 (2020).
  35. Wisdom, K., Chaudhuri, O., Koledova, Z. . 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 29-37 (2017).
  36. Lohmeijer, B. G., et al. Guanidine and amidine organocatalysts for ring-opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39 (25), 8574-8583 (2006).
  37. Cheng, J., et al. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery. Biomaterials. 28 (5), 869-876 (2007).
  38. Meis, C. M., et al. Self-assembled, dilution-responsive hydrogels for enhanced thermal stability of insulin biopharmaceuticals. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2020).
  39. Franck, A., Germany, T. Viscoelasticity and dynamic mechanical testing. TA Instruments. , (1993).
  40. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6, 6295 (2015).
  41. Gallastegui, A., et al. Controlled release of antibiotics from photopolymerized hydrogels: kinetics and microbiological studies. Materials Science and Engineering: C. 102, 896-905 (2019).
  42. Qiao, M., Chen, D., Ma, X., Liu, Y. Injectable biodegradable temperature-responsive PLGA-PEG-PLGA copolymers: synthesis and effect of copolymer composition on the drug release from the copolymer-based hydrogels. International Journal of Pharmaceutics. 294 (1-2), 103-112 (2005).
  43. Schlein, M. Insulin Formulation Characterization-The Thioflavin T Assays. The AAPS Journal. 19 (2), 397-408 (2017).
  44. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  45. Sakas, G., Grimm, M., Savopoulos, A. . EUROGRAPHICS workshop on Rendering Techniques. , 51-63 (1995).
  46. Axpe, E., et al. A multiscale model for solute diffusion in hydrogels. Macromolecules. 52 (18), 6889-6897 (2019).
  47. Peppas, N., Bures, P., Leobandung, W., Ichikawa, H. Hydrogels in pharmaceutical formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 50 (1), 27-46 (2000).
  48. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs. Journal of Controlled Release. 5 (1), 23-36 (1987).
  49. Reinhart, C. T., Peppas, N. A. Solute diffusion in swollen membranes. Part II. Influence of crosslinking on diffusive properties. Journal of Membrane Science. 18, 227-239 (1984).
  50. Salinas, C. N., Anseth, K. S. The influence of the RGD peptide motif and its contextual presentation in PEG gels on human mesenchymal stem cell viability. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 2 (5), 296-304 (2008).
  51. Smith, A. A., et al. Nanoparticles presenting potent TLR7/8 agonists enhance anti-PD-L1 immunotherapy in cancer treatment. Biomacromolecules. 21 (9), 3704-3712 (2020).

Tags

InjectableSupramolecularPolymer-nanoparticleHydrogelsCell DeliveryDrug DeliveryNano-precipitationPEG-PLADynamic Light ScatteringHPMC-C12Rheological PropertiesDrug Release

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Meis, C. M., Grosskopf, A. K., Correa, S., Appel, E. A. Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications. J. Vis. Exp. (168), e62234, doi:10.3791/62234 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image