In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Hazel Hall-Roberts; Elena Di Daniel; William S. James; John B. Davis; Sally A. Cowley

doi:10.3791/62217

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Neuroscience

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Published: February 14, 2021

doi:

10.3791/62217

Hazel Hall-Roberts^1,2,3, Elena Di Daniel², William S. James¹, John B. Davis², Sally A. Cowley¹

¹James Martin Stem Cell Facility, Sir William Dunn School of Pathology,University of Oxford, ²Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine Research Building,University of Oxford, ³UK Dementia Research Institute,Cardiff University

Summary

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Abstract

La microglía orquesta las respuestas neuroinmunes en varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. La microglía elimina las neuronas muertas y moribundas a través del proceso de efecocitosis, una forma especializada de fagocitosis. La función de la fagocitosis puede verse alterada por factores de riesgo ambientales o genéticos que afectan a la microglía. Este artículo presenta un protocolo de microscopía in vitro rápido y simple para estudiar la efemotosis microglial en un modelo de microglía de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), utilizando una línea celular de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) etiquetada con un colorante sensible al pH para la carga fagocítica. El procedimiento da como resultado un alto rendimiento de células muertas de neuroblastoma, que muestran fosfatidilserina superficial, reconocida como una señal de “comerme” por los fagocitos. El ensayo de placa de 96 pozos es adecuado para imágenes de lapso de tiempo de células vivas, o la placa se puede fijar con éxito antes de su posterior procesamiento y cuantificarse mediante microscopía de alto contenido. La microscopía de alto contenido de células fijas permite ampliar el ensayo para el cribado de inhibidores de moléculas pequeñas o la evaluación de la función fagocítica de las líneas iPSC de variantes genéticas. Si bien este ensayo se desarrolló para estudiar la fagocitosis de células muertas enteras de neuroblastoma por macrófagos iPSC, el ensayo se puede adaptar fácilmente para otras cargas relevantes para enfermedades neurodegenerativas, como sinaptosomas y mielina, y otros tipos de células fagocíticas.

Introduction

Las microglías son macrófagos residentes en el tejido cerebral, y sus funciones incluyen vigilancia inmune, coordinación de respuestas inflamatorias a lesiones / infecciones, remodelación sináptica y fagocitosis de células muertas, mielina, agregados de proteínas y patógenos. La fagocitosis es el proceso por el cual la microglía reconoce la carga con receptores de superficie y reorganiza su citoesqueleto para envolver el objeto en un fagosoma, que luego se fusiona con lisosomas para la degradación de la carga. Microglia fagocitasa sana células cerebrales apoptóticas para eliminarlas antes de que se conviertan en necróticas¹. La fagocitosis de las células apoptóticas también se conoce como efemotosis, y requiere la visualización de una señal de fosfatidilserina “come-me” por parte de la célula moribunda². Numerosos receptores de microglía se unen directamente a la fosfatidilserina, incluyendo TIM-4, BAI1, Stabilin-2 y TREM2. Los receptores microgliales TAM (por ejemplo, MERTK) y las integrinas se unen indirectamente a la fosfatidilserina, utilizando proteínas accesorias GAS6 o MFG-E8, respectivamente. Otras señales de “comerme” pueden ser necesarias para el reconocimiento de las células moribundas, estas incluyen cambios en la glicosilación o la carga de las proteínas de superficie; expresión de proteínas intracelulares ICAM3, calreticulina, anexina-I en la superficie celular; LDL oxidado; o recubrimiento de la célula apoptótica por complemento producido por microglía C1q¹^,².

Las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal y la esclerosis lateral amiotrófica se han asociado con un deterioro de la función de la microglía, incluida una acumulación de productos de desecho cerebral como células muertas, fragmentos de mielina y agregados de proteínas, y respuestas inflamatorias exageradas a estos estímulos³. La fagocitosis puede verse afectada en enfermedades neurodegenerativas y contribuir a la patología, debido a una combinación de envejecimiento, inflamación o variantes genéticas específicas de riesgo⁴^,⁵. Por otro lado, también hay evidencia a partir de modelos animales de enfermedades neurodegenerativas de que la microglía puede fagocitar inapropiadamente neuronas viables o sinapsis^6,^7,⁸. Es probable que el mecanismo sea instigado por la exhibición de fosfatidilserina de neuritas dañadas, que es detectada directamente por los receptores de fagocitosis microglial TREM2 o GPR56, o indirectamente detectada por el complemento soluble C1q que recubre la membrana enriquecida con fosfatidilserina, lo que lleva a la fagocitosis mediada por CR3^9,¹⁰^,¹¹.

Los ensayos in vitro de la función de la fagocitosis, por ejemplo, para evaluar el impacto fenotípico de una variante de riesgo genético en la microglía, se realizan con frecuencia utilizando cargas no fisiológicas como las perlas de^{látex 4}. También se utilizan bacterias y zymosan, que son fisiológicas pero no relevantes para las enfermedades neurodegenerativas. Las cargas fagocíticas no fisiológicas se pueden utilizar para detectar defectos en la maquinaria básica de envolvimiento fagocítico, pero no logran modelar con precisión el primer paso de “reconocimiento” en la fagocitosis de las neuronas apoptóticas. El tamaño, la forma, la rigidez y el tipo de carga también dictan las vías de señalización intracelular que se activan, lo que lleva a diferentes resultados del estado de activación de la microglía. Por ejemplo, las bacterias E. coli son pequeñas y rígidas, a diferencia de las células humanas, y los lipopolisacáridos en su superficie son reconocidos por el receptor 4 tipo Toll (TLR4) que activa la fagocitosis y las vías de señalización proinflamatorias^2,¹².

En el contexto de los estudios de enfermedades neurodegenerativas, una carga fagocítica más relevante tendría una exhibición de fosfatidilserina en las membranas plasmáticas de los mamíferos, e idealmente sería humana y neuronal, para incluir señales que es probable que encuentre la microglía. Para este protocolo de fagocitosis, se eligió la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y como modelo de neurona fácil de cultivar. La exhibición permanente de fosfatidilserina en la superficie fue inducida artificialmente por el paraformaldehído, que previamente se ha demostrado que causa la exhibición de fosfatidilserina de las plaquetas¹³. Para el modelo de células de microglía se utilizaron macrófagos iPSC humanos, que imitan la ontogenía y el perfil transcripcional de la microglía humana, y son fagocíticamente competentes^14,^15,^16,¹⁷. Los macrófagos iPSC no son el modelo de microglía más auténtico disponible, por ejemplo, no imitan la morfología de la microglía; sin embargo, se puede sustituir por un modelo iPSC de microglía de monocultivo más auténtico, como Haenseler et al.¹⁵. Los modelos iPSC humanos son preferibles a la microglía primaria de roedores para estudiar la neurodegeneración, debido a las preocupaciones sobre la superposición limitada de los módulos transcripcionales de microglia observados en tejidos de enfermedades neurodegenerativas humanas versus ratón¹⁸. Los SH-SY5Y muertos se tiñen con un colorante sensible al ácido que fluorescencia débilmente a pH neutro y más fuertemente dentro de los faglisosomas de los macrófagos iPSC después de la fagocitosis. El uso de un colorante sensible al ácido mejora la precisión de la detección de eventos fagocíticos, con versatilidad para diferentes lecturas de macrófagos vivos y fijos¹⁹. Este protocolo describe tanto la imagen de lapso de tiempo de células vivas de la fagocitosis como un ensayo de imágenes fijas de alto contenido para la fagocitosis, con los mismos pasos de preparación celular antes de la lectura(Figura 1).

Figura 1: Diagrama esquemático de la metodología. Esquema del ensayo de fagocitosis, donde la preparación de los SH-SY5Ys y la tinción de los macrófagos iPSC se realiza en paralelo, y luego los SH-SY5Ys se canalizan en los macrófagos iPSC. Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas se realizan de inmediato, o las células se incuban a 37 ° C / 5% de CO₂ durante la duración requerida y se fijan antes de realizar la microscopía de alto contenido. PFA: paraformaldehído, HBM: medios tamponados hepes libres de rojo fenol, pHr: solución de éster STP de colorante fluorescente rojo sensible al pH, PRFMM: medio de macrófagos libre de rojo de fenol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

El protocolo sigue las directrices para el uso de líneas celulares iPS humanas derivadas en la Universidad de Oxford, Oxford Parkinson’s Disease Centre (Comité de Ética: Servicio Nacional de Salud, Autoridad de Investigación en Salud, Comité NRES South Central, Berkshire, Reino Unido (REC 10/H0505/71)). Las iPSC humanas deben manejarse dentro de un gabinete de seguridad de Clase II para proteger al trabajador de posibles agentes adventicios. Se deben cumplir las normas de salud y seguridad locales, nacionales y de la UE. Las composiciones de los medios de cultivo celular se detallan en la Tabla 1, y todos los materiales se enumeran en la Tabla suplementaria de Materiales. 1. Cultivo celular previo al experimento Cultivo de iPSCs en medios iPSC (Tabla 1) en placas de 6 pomos pre-recubiertas con una matriz de membrana basal calificada hESC, subconfluente y en un número de paso bajo. Diferenciar las iPSC humanas a los precursores de iPSC-macrófagos: sembrar cuatro millones de iPSC en una placa de micropozos de baja adherencia de 24 pomos con 2 ml de medios corporales embrionarios(Tabla 1)para estimular la formación del cuerpo embrionario y realizar cambios de medios del 75% diariamente durante 5-6 días. Transferir cuerpos embrioides a matraces T175, aproximadamente 150 cuerpos embrionarios por matraz, que contienen 20 ml de medios de fábrica (Tabla 1). Alimentar semanalmente mediante la adición de 10-20 ml de medios de fábrica.NOTA: Los precursores de macrófagos iPSC emergen en el sobrenadante después de aproximadamente 2-3 semanas y se producen continuamente durante varios meses. Para este experimento, es preferible utilizar células a partir de aproximadamente 6 semanas después de que se establezcan las fábricas de diferenciación. Los macrófagos iPSC cosechados más temprano pueden retener cierta capacidad proliferativa y son menos adherentes, lo que impide incluso la siembra a una densidad celular baja. No se ha determinado un límite de edad superior para la capacidad de fagocitosis. Diferenciar los precursores de macrófagos iPSC a los macrófagos iPSC: cosechar precursores eliminando el volumen requerido de sobrenadante; páselo a través de un colador de células de 40 μm para eliminar los grumos; centrifugar a 400 x g durante 5 min para gletizar células y resuspend en medios macrófagos (Tabla 1). Semilla iPSC-macrófagos a 20.000-30.000 células por pozo en una microplaca tratada con cultivo de tejidos (CT) de 96 pomos con paredes de pozo negro y un fondo ópticamente claro, en 100 μL de medios macrófagos por pozo. Evite los pozos de borde y llénelos con PBS; esto es importante para reducir el efecto de la evaporación en el ensayo. Diferenciar durante 6-10 días mediante incubación a 37 °C/5% CO2.NOTA: Para este ensayo, se utilizó la línea iPSC BIONi010-C (ECACC ID: 66540023); sin embargo, se puede sustituir otra línea iPSC. Mantener SH-SY5Ys a subconfluencia en matraces T75 con 20 mL de medios SH-SY5Y (Tabla 1), pasando cada 3-4 días. Nombre Medios base Aditivo, concentración final Medios iPSC mTeSR1 – Medios del cuerpo embrioide mTeSR1 BMP4, 50 ng/ml VEGF, 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml Medios de fábrica XVIVO15 GlutaMAX, 2 mM Penicilina, 100 unidades/ml Estreptomicina, 100 μg/ml 2-Mercaptoetanol, 50 μM IL-3, 25 ng/ml M-CSF, 100 ng/mL Medios de macrófagos XVIVO15 GlutaMAX, 2 mM Penicilina, 100 unidades/ml Estreptomicina, 100 μg/ml M-CSF, 100 ng/mL Medios SH-SY5Y DMEM/F12 Suero fetal bovino, 10% Penicilina, 100 unidades/ml Estreptomicina, 100 μg/ml Tabla 1: Recetas de medios. Componentes de los medios de cultivo celular utilizados en el protocolo. Se pueden encontrar más detalles de los componentes del medio en la Tabla de materiales. 2. Preparación de SH-SY5Ys muertos En un gabinete de seguridad biológica de clase II, disociar SH-SY5Ys, mediante la adición de 4 mL de un tampón de disociación celular que contenga enzimas recombinantes similares a la tripsina y 1.1 mM de EDTA (ver Tabla de Materiales),que debe eliminarse inmediatamente para que quede menos de 1 mL como una película delgada que cubra las células. Incubar durante 2-3 min a 37 °C/ 5% CO2. Agregue 10 ml de HBSS al matraz T75 para enjuagar y pipetee el SH-SY5Ys en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml. Centrifugadora a 400 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 2 ml de medios tamponados hepes libres de fenol en rojo (ver Tabla de Materiales). Asegúrese de resuspender el pellet con cuidado, pipeteando con una pipeta de 100-1,000 μL para romper los grupos antes de la fijación. Fije las células agregando 2 ml de paraformaldehído al 4% (concentración final del 2%) al tubo. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente con agitación suave ocasional del tubo. Agregue 10 ml de HBSS al tubo. Centrifugar a 1.200 x g durante 7 min y volver a suspender en 2 ml de fenol medio tamponado hepes sin rojo.NOTA: Después del paso 2.4, la preparación fija SH-SY5Y se puede controlar de calidad mediante tinción con anexina V-FITC para mostrar fosfatidilserina y yoduro de propidio accesibles para medir la permeabilidad celular con una lectura de citometría de flujo. Compare la preparación fija con los SH-SY5Ys vivos obtenidos del paso 2.2. Ver sección 7 y Figura suplementaria S1. No se recomienda el almacenamiento del SH-SY5Ys fijo después del paso 2.4, ya que no se ha evaluado. 3. Etiquetado de SH-SY5Ys muertos con colorante fluorescente rojo sensible al pH Después del paso 2.4, cuente las células y elimine el número total de células requeridas en un tubo de baja unión a proteínas de 2 ml. Por cada 1 millón de SH-SY5Ys, consciba el volumen total en el tubo de 2 ml a 300-500 μL con medios tamponados hepes libres de fenol en rojo. Caliente el tubo brevemente en un baño de agua a 37 °C. Reconstituir el éster STP de colorante fluorescente rojo sensible al pH (ver Tabla de Materiales)y añadir 12,5 μg de colorante por millón de SH-SY5Y al tubo caliente de 2 ml de células. Mezclar suavemente mediante pipeteo. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 30 min, protegido de la luz.NOTA: La especie de éster STP del colorante sensible al pH reacciona con las aminas primarias y, por lo tanto, el tampón de etiquetado no debe contener aminas libres. Debido a la solubilidad potencialmente limitada en tampones acuosos, agregue el tinte disuelto en DMSO solo para calentar el tampón acuoso, mezcle inmediatamente y examine si hay signos de precipitado (partículas oscuras bajo un microscopio de luz). Añadir 1 ml de HBSS y centrifugar a 1200 x g durante 7 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lávelo con 2 ml de HBSS. Repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en medios de macrófagos libres de fenol rojo (ver Tabla de Materiales),a una concentración de 200,000-1.2 millones de células / ml para que 50 μL sean 10,000-60,000 células (es decir, 0.5x-3x más SH-SY5Ys que iPSC-macrófagos).NOTA: El rojo fenol en los medios aumenta la fluorescencia de fondo y, por lo tanto, se debe usar un medio libre de rojo de fenol si se deben realizar imágenes de células vivas. No se recomienda el almacenamiento de los SH-SY5Y manchados durante más de unas pocas horas, ya que esto no se ha evaluado. Mantenga los SH-SY5Y manchados en el hielo y protéjase de la luz. 4. Tinción de macrófagos iPSC En un gabinete de seguridad biológica, prepare una solución en medios macrófagos de un colorante reactivo al éster de succinimidil fluorescente profundo, permeante celular y succinimidil (consulte la Tabla de materiales). Agregue Hoechst 33342 (consulte la Tabla de materiales). Caliente la solución de trabajo a 37 °C en un baño de agua. Aspire el medio de macrófagos iPSC suavemente pipeteando el sobrenadante celular con una pipeta multicanal en un depósito estéril. Añadir 70 μL/pomo de la solución de colorante preparada en el paso 4.1 a los macrófagos iPSC, utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante 1 h a 37 °C/5% CO2. Preparar tratamientos experimentales en medios macrófagos libres de fenol rojo. Incluir 10 μM de citochalasina D como tratamiento de control negativo. Después de la incubación, aspire el medio de macrófagos iPSC muy suavemente con una pipeta multicanal y agregue 100 μL / pomo de solución salina tamponada (HBSS) de Hank para lavar. Retire inmediatamente el HBSS mediante pipeteo suave, luego agregue 100 μL de medios ± compuestos. Incubar durante 10 min-1 h a 37 °C/ 5% CO2.NOTA: La citochalasina D es un potente inhibidor de la actina y bloquea la fagocitosis. Para cualquier tratamiento experimental que requiera una incubación más larga, por ejemplo, 24-72 h, realice el tratamiento experimental antes del paso 4.1 utilizando 100 μL / pomo de tratamiento en medios macrófagos completos. Siga los pasos 4.1-4.3 según el protocolo para que se realice la tinción celular y, posteriormente, el tratamiento se vuelva a aplicar en medios de macrófagos libres de fenol rojo durante el resto del ensayo de fagocitosis. 5. Fagocitosis por imágenes A continuación se presentan dos métodos diferentes de lectura de fagocitosis, elija la subsección 5.1 o 5.2. Imágenes de lapso de tiempo de células vivas Antes de la fagocitosis, encienda el microscopio de imágenes de lapso de tiempo de células vivas (consulte la Tabla de materiales),la computadora, la cámara ambiental y el gas CO2. Abra el software de captura de imágenes. Compruebe que los cubos de luz DAPI, RFP y CY5 estén instalados en el microscopio. Haga clic en time lapse | Incubar | Habilite la cámara de medio ambiente y seleccione el calentamiento a 37 ° C con gas CO2, también asegúrese de que se deseleccione la humedad. Espere 30 minutos para que el microscopio se caliente a 37 °C. Durante la incubación del compuesto en el paso 4.3, cargue la placa de macrófagos iPSC en el microscopio. Haga clic en el | de la imagen Captura | Experto en buques. Seleccione Well Plate y elija un tipo de placa de 96 pozos. En la pestaña Imagen, active el canal de fase y ajuste el enfoque grueso y fino utilizando los controles deslizantes verticales, de modo que las celdas estén enfocadas. Ajuste los niveles de iluminación con el control deslizante horizontal. Haga clic en los canales DAPI, RFP y CY5 y ajuste los niveles de iluminación para cada canal. En la pestaña Sistema, haga clic en Calibrar alineación de recipientes y siga las instrucciones de la pantalla. Haga clic en time lapse | Rutinas | Crear nueva rutina. En la primera pantalla del Asistente para lapso de tiempo,asigne un nombre a la rutina. Haga clic en Siguiente. En la segunda pantalla, seleccione el objetivo 20x, seleccione Captura monocromática y seleccione los canales DAPI, RFP, CY5 y Phase. No seleccione las siguientes opciones: Detección automática de muestras, Enfoque fino automático, Z-Stack, Iluminación automática. Haga clic en Siguiente. En la siguiente pantalla, configure una baliza en el centro de cada pozo, lo que permitirá que el microscopio vuelva a las mismas coordenadas con los mismos ajustes de iluminación para cada punto de tiempo. Los ajustes de enfoque e iluminación para cada baliza son independientes. Para configurar una baliza: arrastre el círculo azul a la ubicación en el mapa de la placa, use el control deslizante vertical de enfoque grueso y fino y, cuando esté satisfecho, haga clic en Agregar baliza. La configuración de la baliza se puede actualizar más adelante mediante el botón Actualizar seleccionado. Cuando esté listo para comenzar el ensayo de fagocitosis, retire la placa de ensayo y colóquela en un gabinete de seguridad biológica. Use una pipeta multicanal para agregar 50 μL de SH-SY5Ys por pozo, agregando al lado de cada pozo en el borde del líquido. Cargue la placa en el microscopio y espere aproximadamente 30 minutos para que el cambio térmico se equilibre.NOTA: Durante los primeros 30 minutos que la placa está en el microscopio, la temperatura cambiante de la placa de ensayo hará que el enfoque cambie. Si no se permite que la placa se equilibre, las imágenes capturadas se desviarán de foco durante el lapso de tiempo. Haga clic en cada baliza y actualice la configuración de enfoque. Haga clic en Siguiente. En la siguiente pantalla del Asistente de lapso de tiempo,seleccione el formato de archivo TIFF,habilite la opción Guardar canales individualesy habilite la opción Crear video para cada baliza,y permita las opciones debajo de Incluir la siguiente información como marca de agua. Haga clic en Siguiente. Establezca el número de escenas en 1. Haga clic en Siguiente. Establezca la duración y los intervalos del lapso de tiempo, por ejemplo, 3 h e imágenes cada 5 minutos. No seleccione Capturar solo un fotograma. Haga clic en Siguiente. Habilite la cámara de ambiente, con una temperatura de 37 ° C y CO2 (la humedad es opcional para experimentos cortos). Haga clic en Siguiente dos veces. Elija una ruta para guardar los datos. Haga clic en Siguiente. Haga clic en Iniciar para iniciar el lapso de tiempo. Imágenes de alto contenido de celda fija Use una pipeta multicanal para agregar 50 μL del SH-SY5Ys etiquetado por pozo, agregando al lado de cada pozo en el borde del líquido. Incubar a 37 °C/ 5% CO2 durante 3-5 h. Después de la incubación de la fagocitosis, aspire suavemente los sobrenadantes celulares mediante pipeteo con una pipeta multicanal y deséchelos. Lavar una vez con 100 μL PBS. Fijar la placa mediante la adición de 100 μL de paraformaldehído al 2%, incubar durante 15 min a temperatura ambiente. Aspire los pozos y agregue 100 μL de PBS. Cubra con sellador de placas y papel de aluminio; conservar a 4 °C hasta que sea necesario.NOTA: La placa de ensayo se puede almacenar así durante al menos una semana sin degradación significativa de la señal; no se ha probado un almacenamiento más largo. Encienda el microscopio de imágenes de alto contenido (consulte tabla de materiales)y abra el software de captura de imágenes. Cargue la placa de ensayo en el microscopio haciendo clic en el icono Cargar en la parte superior de la pantalla. Seleccione la pestaña Configuración. En los menús desplegables del cuadro superior izquierdo: seleccione el tipo de placa apropiado, seleccione la opción de enfoque automático Two Peak (Predeterminado),seleccione el objetivo 40x Water, NA1.1,seleccione Modo confocal y seleccione binning de 1. Enjuague el objetivo de agua 40x antes de usarlo, a través del menú Configuración. En el cuadro Selección de canales, use el icono + para agregar los canales DAPI, Alexa 647 y Alexa 568. Establezca estos para medir en un solo plano de 1 μm. Optimice la configuración de tiempo y potencia para la eficiencia de tinción de la placa de ensayo.NOTA: Como guía, establezca DAPI en 200 ms de exposición y 100% de potencia, Alexa 647 a 1500 ms de exposición y 100% de potencia, y Alexa 568 a 100 ms de exposición y 40% de potencia. Asegúrese de que los canales no se midan simultáneamente haciendo clic en Secuencia de canales para separar los canales. En | de navegación Definir diseño,seleccionar los pozos de medición y seleccionar 9-12 campos por pozo. Durante la configuración, haga clic en un campo representativo en el mapa de la placa y verifique cada canal de medición a su vez, para asegurarse de que la tinción esté presente y que las imágenes estén enfocadas, ajustando el desplazamiento del canal. Para que los datos se carguen en un servidor para su análisis remoto, haga clic en el cuadro Trabajos en línea y en el nombre de pantalla correspondiente; esto permitirá la carga automática de los datos en un servidor después de la creación de imágenes. Guarde el protocolo de ensayo haciendo clic en el botón Guardar. Haga clic en la pestaña Ejecutar experimento en la parte superior y asigne un nombre a la placa del experimento, luego haga clic en Inicio. 6. Análisis de datos A continuación se presentan dos métodos diferentes de análisis de datos, elija la subsección 6.1 si se siguió la subsección 5.1, o elija la subsección 6.2 si se siguió la subsección 5.2. Análisis de imágenes de fagocitosis obtenidas por microscopio de lapso de tiempo de células vivas Descargue e instale el software de código abierto recomendado (consulte la Tabla de materiales). Abra el software. En el cuadro Módulos de entrada, seleccione Imágenes. Desde el Explorador de Windows,abra la carpeta de datos, que contiene subcarpetas denominadas Beacon-1, Beacon-2, etc. Seleccione y arrastre todas las carpetas de baliza al cuadro de lista Archivo. En el cuadro Módulos de entrada, seleccione Metadatos. En Extraer metadatos?, seleccione Sí. En el menú desplegable situado junto a Método de extracción de metadatos, elija Extraer de nombres de archivo/carpeta. En origen de metadatos, elija Nombre de carpeta. Haga clic en la lupa a la derecha de la expresión regular y escriba “.*[\.*](? P.*)$” en el cuadro de texto Regex (excluyendo las comillas). Haga clic en Enviar. En Extraer metadatos de, elija Todas las imágenes. Haga clic en Actualizar en la parte inferior de la pantalla. Las imágenes ahora se agruparán por baliza. En el cuadro Módulos de entrada, seleccione NamesAndTypes. El siguiente proceso permitirá asignar imágenes para cada punto de tiempo al canal de fluorescencia correcto. Asigne un nombre a Reglas de coincidencia de imágenes (menú desplegable). Seleccione los criterios de regla que coincidan con Todos (menú desplegable) de las siguientes reglas. Archivo (menú desplegable), Does (menú desplegable), Contener (menú desplegable), DAPI (cuadro de texto). Nombre para asignar a estas imágenes DAPI (cuadro de texto). Seleccione el tipo de imagen Escala de grises Image (menú desplegable). Establezca el rango de intensidad en Metadatos de imagen (menú desplegable). En la parte inferior de la pantalla, haga clic en Agregar otra imageny repita el paso 6.1.5. Reemplace DAPI con RFP, de modo que las imágenes de RFP se agrupen. Repita el paso 6.1.6 para las imágenes de canal CY5. Haga clic en Actualizar en la parte inferior de la pantalla, los archivos de imagen ahora se enumerarán en tres columnas etiquetadas como DAPI, RFP y CY5. En el cuadro Módulos de entrada, seleccione Grupos. En ¿Desea agrupar sus imágenes?, seleccione Sí. En el menú desplegable de Categoría de metadatos, elija Baliza. En el cuadro Módulos de análisis, haga clic con el botón secundario en el espacio en blanco para obtener una lista de todos los módulos. Haga clic en Agregar | | de procesamiento de imágenes EnhanceOrSuppressCaracterísticas. Elija DAPI en el primer cuadro desplegable como imagen de entrada. Asigne a la imagen de salida el nombre “DAPIspeckles”. Seleccione el tipo de operación Mejorar y el tipo de función Speckles,con un tamaño de función de 20 píxeles. Elija la opción de velocidad y precisión Rápido/Hexagonal. Cree un nuevo módulo. Añadir | | de procesamiento de objetos IdentificarPrimaryObjects. Elija DAPIspeckles en el primer cuadro desplegable como imagen de entrada. Nombra a los objetos primarios “Núcleos”. Ingrese el diámetro típico de los objetos como unidades de 10 a 35 píxeles; este parámetro se puede optimizar. Elija la estrategia de umbral Global, el método de umbral RidlerCalvard, el método de suavizado Automáticoy dé el factor de corrección de umbral como 12 con límites inferior y superior 0-1. Cambie el método para distinguir los objetos agrupados en Shape, pero deje otros parámetros en su configuración predeterminada.NOTA: Los núcleos de macrófagos iPSC se han segmentado aproximadamente en el paso 6.1.12, siguiendo un paso de procesamiento de imágenes que reduce el diámetro y aumenta el contraste de los núcleos. Es importante que solo se seleccionen los núcleos más brillantes, ya que los SH-SY5Ys aparecerán como núcleos más débiles y se confundirán con macrófagos iPSC de lo contrario. Para ajustar la proporción de núcleos que se seleccionan, aumentar o disminuir el factor de corrección del umbral. Durante la fase de prueba, compare la selección de núcleos resultante con una imagen de fase de la baliza, donde es fácil distinguir entre iPSC-macrófago y SH-SY5Y utilizando la morfología celular. Cree un nuevo módulo. Añadir | | de procesamiento de imágenes CorrectIlluminationCalculate. Elija CY5 en el primer cuadro desplegable como imagen de entrada. Asigne a la imagen de salida el nombre “IllumCY5”. En Seleccionar cómo es la iluminación, elija Fondo en el menú desplegable. Deje los otros parámetros en su configuración predeterminada. Cree un nuevo módulo. Haga clic en Agregar | | de procesamiento de imágenes CorrectIlluminationAplicar. Elija CY5 en el primer cuadro desplegable como imagen de entrada. Asigne a la imagen de salida el nombre “CorrCY5”. En Seleccione la iluminación, elija IllumCY5 en el menú desplegable. En Seleccionar cómo funciona la iluminación, elija Dividir en el menú desplegable.NOTA: El propósito de los pasos 6.1.13-6.1.14 es corregir la variación en la iluminación de fondo de las imágenes CY5, que de otro modo interferirían con la segmentación celular correcta. Cree un nuevo módulo. Haga clic en Agregar | | de procesamiento de objetos IdentifySecondaryObjects. Elija CorrCY5 en el primer cuadro desplegable como imagen de entrada. Elija Nuclei como objetos de entrada. Asigne a los objetos secundarios el nombre “Mac”. Elija el método de identificación como Distancia – B. Seleccione la estrategia deumbral Global , el método de umbral RidlerCalvard, el método de suavizado No suavizado, y dé el factor de corrección de umbral como 1 con los límites inferior y superior 0-1. Deje otros parámetros en su configuración predeterminada.NOTA: Este paso de segmentación celular puede requerir optimización, ajustando el factor de corrección del umbral para crecer o reducir los límites de la celda. La eficiencia de la segmentación también se puede mejorar aumentando la resistencia de la tinción de macrófagos iPSC, o la iluminación del cubo de luz CY5 durante la toma de imágenes. Cree un nuevo módulo. Haga clic en Agregar | | de procesamiento de imágenes EnhanceOrSuppressCaracterísticas. Elija RFP en el primer cuadro desplegable como imagen de entrada. Asigne a la imagen de salida el nombre “FilteredRFP”. Seleccione el tipo de operación Mejorar y el tipo de función Speckles,con un tamaño de función de 15 píxeles. El tamaño de la función se puede optimizar. Elija la opción de velocidad y precisión Rápido/Hexagonal. Cree un nuevo módulo. Haga clic en Agregar | | de procesamiento de objetos IdentificarPrimaryObjects. Elija FilteredRFP en el primer cuadro desplegable como imagen de entrada. Asigne a los objetos primarios el nombre “pHr”. Introduzca el diámetro típico de los objetos como unidades de 5-20 píxeles. Seleccione el Manualde estrategia de umbral y escriba un umbral manualmente, por ejemplo, 0,005. Cambie el método para distinguir los objetos agrupados en Shape, pero deje los demás parámetros en su configuración predeterminada.NOTA: Los SH-SY5Ys se han segmentado en el paso 6.1.17, siguiendo un paso de procesamiento de imágenes que reduce el diámetro y aumenta el contraste de la punta. Es fundamental realizar el umbral manual, ya que la intensidad del tinte sensible al pH aumenta con el tiempo en partículas fagocitadas, y otras estrategias de umbral inflarán artificialmente el número de puncta de colorante sensible al pH en los primeros puntos de tiempo. El umbral manual debe ajustarse para cada repetición experimental posterior, utilizando el modo de prueba. Cree un nuevo módulo. Haga clic en Agregar | | de procesamiento de objetos RelateObjects. Seleccione los objetos secundarios de entrada pHr en el menú desplegable. Seleccione los objetos padres de entrada Mac en el menú desplegable. En ¿Calcular las medias por padre para todas las mediciones secundarias?, seleccione Sí. No calcule las distancias hijo-padre (Ninguna).NOTA: El paso 6.1.18 relaciona la señal de colorante sensible al pH con los macrófagos iPSC, lo que permite medir el número promedio de objetos fagocitados por macrófago iPSC. Cree un nuevo módulo. Haga clic en Agregar | | de procesamiento de archivos ExportToSpreadsheet. Seleccione el delimitador de columna como Tab y agregue un prefijo para los nombres de archivo para indicar el número de baliza. Elija medidas específicas para la exportación, como se indica a continuación (pasos 6.1.19.1 – 6.1.19.4); dejando otros parámetros en su configuración predeterminada. Imagen | Contar | Seleccione pHr y Mac Imagen | Nombre Imagen | Grupo | mac Niños | Phr En el cuadro Salida, haga clic en Ver configuración de salida. Cree una nueva carpeta en el escritorio para este experimento y esta como la carpeta de salida predeterminada. Guarde el archivo de canalización | SaveProject como…. Pruebe y optimice la canalización en una imagen representativa haciendo clic en Iniciar modo de prueba en la esquina inferior izquierda. El programa selecciona automáticamente la primera imagen para probar y cada paso de la tubería se puede ver haciendo clic en los símbolos del ojo, lo que hace que la salida sea visible, y luego haciendo clic en Ejecutar. Para cambiar la baliza utilizada para las pruebas, en la barra de menú superior haga clic en Probar | Elija Grupo de imágenes. Para cambiar la imagen (punto de tiempo) dentro de una baliza, en la barra de menú superior haga clic en Probar | Elija Conjunto de imágenes. Los parámetros que deben optimizarse se indican en los pasos anteriores. Cuando esté satisfecho con la tubería, haga clic en Salir del modo de prueba y haga clic en los símbolos de ojo abierto para cerrarlos. Guarde la tubería. Haga clic en Analizar imágenes para iniciar el análisis completo de imágenes. Los archivos de texto que se generan se pueden abrir como una hoja de cálculo con el software de hoja de cálculo adecuado, y el archivo etiquetado como “Imagen” contendrá una fila para cada punto de tiempo de la imagen, con las columnas representando parámetros.NOTA: Count_Mac y Count_pHr representan el número de macrófagos iPSC y el número de objetos sensibles al pH identificados en una imagen. No utilice datos Count_pHr, ya que el recuento incluye SH-SY5Ys poco fluorescentes que no han sido fagocitados. La columna Mean_Mac_Children_pHr_Count toma el número promedio de objetos pHr fagocitados por Mac (paso 6.1.18 RelateObjects) para una imagen individual, es decir, el punto de tiempo individual de una baliza. Organice los datos de modo que cada baliza sea una columna separada en la hoja de cálculo, las imágenes organizadas como filas de orden cronológico, con diferentes parámetros que ocupan diferentes hojas del libro de cálculo de la hoja de cálculo. Multiplicar las medidas Mean_Mac_Children_pHr_Count por Count_Mac, para generar el parámetro Número de manchas por imagen. Calcule el Count_Mac medio para cada baliza. Divida el número de puntos por imagen por la media Count_Mac para esa baliza, generando el parámetro Número de puntos por celda.NOTA: El paso 6.1.26 corrige cualquier fluctuación errónea que pueda ocurrir en el recuento de macrófagos iPSC (Count_Mac), normalizando los datos al recuento promedio de macrófagos iPSC en todos los puntos de tiempo de una baliza. Asigne el tiempo desde que comenzó la fagocitosis (en min) a cada fila de imagen. Generar medias y desviación estándar para replicar pozos/balizas. Grafique el número de puntos por célula (eje y) contra el tiempo (eje x) para visualizar la tasa de fagocitosis. Figura 2: Segmentación celular en el análisis de fagocitosis de alto contenido. Ilustración para demostrar una segmentación buena versus mala de un macrófago iPSC muy cerca de un SH-SY5Y no fagocitado, con un segundo SH-SY5Y completamente fagocitado. Con ambos tipos de células mostrados en gris, el borde de la célula iPSC-macrófago delineado por el análisis por computadora se delinea (azul). Los SH-SY5Y que se cuentan como eventos de fagocitosis se delinean en verde o en rojo si se excluyen del análisis. La imagen en el medio muestra una segmentación pobre; el macrófago iPSC tiene una delineación subóptima que incluye el SH-SY5Y no fagocitado dentro del borde celular, que se contará como un evento de fagocitosis. La imagen de la derecha muestra una buena segmentación debido a los parámetros más estrictos que definen el borde de la célula iPSC-macrófago, lo que llevó a que el SH-SY5Y no fagocitado se excluyera correctamente del análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Análisis de imágenes de fagocitosis obtenidas con microscopio de alto contenido Inicie sesión en el software de procesamiento de imágenes recomendado (consulte la Tabla de materiales). Seleccione la carpeta de nombre de pantalla y la subcarpeta de ejecución de imágenes en el menú de la izquierda. Haga clic en el icono Análisis de imagen (una pantalla con lupa). Seleccione un pozo representativo en el diseño de la placa para configurar la tubería de análisis. El primer bloque de construcción del análisis es la imagen de entrada. Deje la configuración predeterminada para el procesamiento de pila(Planos individuales)y la corrección de campo plano(Ninguno). Haga clic en el signo + en la esquina superior derecha del bloque, para agregar el siguiente bloque de construcción y seleccione Buscar núcleos. En Buscar núcleos,establezca el canal como DAPI,la población ROI como Ninguno,el método de segmentación como C. El cuadro de método contiene un menú desplegable que permite optimizar el parámetro, con ajustes para el umbral común (es decir, 0,40) y el área (es decir, >30 μm2). Nombra a la población de salida “Núcleos”. Agregue el siguiente bloque de construcción haciendo clic en el símbolo + y seleccione Buscar citoplasma. En Buscar citoplasma, establezca el canal como Alexa 647 y el método como B. El cuadro de método contiene un menú desplegable que permite optimizar el parámetro, con ajustes para el umbral común (es decir, 0,45) y el umbral individual (es decir, 0,20). Agregue el siguiente bloque de creación haciendo clic en el símbolo + y seleccione Seleccionar población.NOTA: Es fundamental optimizar adecuadamente la segmentación del citoplasma para que excluya cualquier SH-SY5Y adyacente que no haya sido fagocitado, pero no excluya la carga fagocitada (ver Figura 2). En Seleccionar población, mantenga la configuración predeterminada, que será Núcleosde población , Método Filtros comunes, una marca para Quitar objetos de bordey la población de salida denominada “Núcleos seleccionados”. Agregue el siguiente bloque de construcción haciendo clic en el símbolo + y seleccione Calcular propiedades morfológicas. En Calcular propiedades morfológicas, establezca la población en Núcleos seleccionados, la región en Celda, el método en Estándar. En el menú desplegable, asegúrese de que el área y la redondez estén seleccionadas (μm2). Nombre de la población de salida “Célula de morfología”. Agregue el siguiente bloque de creación haciendo clic en el símbolo + y seleccione Seleccionar población. En Seleccionar población (2), elija la población Núcleos seleccionadosy el método Filtrar por propiedades. En el cuadro desplegable bajo Filtro F1, seleccione Área de celda de morfología [μm2]. Elija > en el cuadro desplegable de la derecha y escriba 160 en el cuadro a la derecha de ese. Nombre de la población de salida “Núcleos seleccionados 2”. Agregue el siguiente bloque de construcción haciendo clic en el símbolo + y seleccione Buscar puntos.NOTA: Este paso excluye cualquier célula mal segmentada y cualquier célula muerta de un análisis posterior. Puede ser necesario optimizar aumentando o disminuyendo el tamaño de corte. En Buscar spots,seleccione el canal Alexa 568,la población ROI Nuclei Selected 2,la región ROI Cell,el método By nombre a la población de salida “Spots”. El método se puede optimizar, si es necesario, utilizando el menú desplegable, con configuraciones para la sensibilidad de detección (es decir, 0.20) y la sensibilidad de división (es decir, 0.400). Agregue el siguiente bloque de construcción haciendo clic en el símbolo + y seleccione Calcular propiedades morfológicas. En Calcular propiedades morfológicas (2), seleccione la población Manchas,región Manchay método Estándar. En el menú desplegable, asegúrese de que el área y la redondez estén seleccionadas (μm2). Asigne a las propiedades de salida el nombre “Morphology Spot”. Agregue el siguiente bloque de creación haciendo clic en el símbolo + y seleccione Seleccionar población. En Seleccionar población (3), seleccione la población Spots y el método Filter by Properties. En los cuadros desplegables de Filtro F1, seleccione Área de punto [px2], >, 20. En los cuadros desplegables de Filtro F2, seleccione Área de punto [px2], <, 2500. En los cuadros desplegables de Filtro F3, seleccione Redondez del punto de morfología, >, 0,6. En los cuadros desplegables de Filtro F4, seleccione Intensidad de punto a región, >, 2.5. Asigne a la población de salida el nombre “Spots Selected”. Agregue el siguiente bloque de creación haciendo clic en el símbolo + y seleccione Seleccionar población.NOTA: La selección automatizada de puntos habrá segmentado muchas pequeñas manchas fluorescentes que resultan de cuerpos autofluorescentes dentro de los macrófagos iPSC. Este paso tiene como objetivo filtrar los cuerpos autofluorescentes mediante la aplicación de cortes estrictos en el área, la redondez y la intensidad de las manchas, y puede requerir cierta optimización. En Seleccionar población (4), seleccione la población Núcleos seleccionados 2 y el método Filtrar por propiedades. En los cuadros desplegables de Filtro F1, seleccione Número de manchas, >, 0,5. Nombra a la población de salida “Células positivas puntuales”. Agregue el siguiente bloque de creación haciendo clic en el símbolo + y seleccione Definir resultados. En Definir resultados, seleccione el primer método como Lista de salidas. La configuración predeterminada es para el número de objetos que se calcularon para cada población. Haga clic en el menú desplegable de Población: Núcleos seleccionados 2 y asegúrese de que Número de objetos esté marcado, y en el menú desplegable Aplicar a todos seleccione TODOS. Para la población Spot Positive Cell, asegúrese de que el número de objetos esté marcado. Para las otras poblaciones, no es necesario informar ningún parámetro. Seleccione el segundo método como Formula Outputy escriba la fórmula (a/b)*100. Elija como variable A Spot Positive Cell- Número de objetos, y como variable B elija Nuclei Selected 2- Número de objetos. Asigne a la salida el nombre “Células positivas puntuales (%)”. Guarde la tubería: haga clic en el icono Guardar análisis en disco (un disquete con flecha hacia abajo). Haga clic en el icono Análisis por lotes (un símbolo de embudo y engranajes en la parte superior de la pantalla). En las carpetas experimentales de la izquierda, seleccione el archivo de datos sin procesar, que debe actualizar el número de mediciones seleccionadas a 1. En la región Opciones de análisis, haga clic en el menú desplegable de Métodoy seleccione Análisis existente. Haga clic en el botón … junto a Archivo de script y busque el archivo de análisis guardado (sufijo .aas). Luego, haga clic en la flecha verde junto a Iniciar análisis. El progreso del análisis se puede monitorear haciendo clic en Estado del trabajo (en la esquina superior derecha de la pantalla). Una vez que se complete el análisis, haga clic en la pestaña Exportar,elija la carpeta del experimento y seleccione una carpeta de destino. Deje la configuración predeterminada, que exporta datos pero no imágenes TIFF, e inicie la exportación. Abra el archivo descargado como una hoja de cálculo en un software de hoja de cálculo apropiado. Los pozos están dispuestos en filas y los parámetros en columnas. Seleccione los datos en las columnas etiquetadas como Celdas positivas puntuales (%), Núcleos seleccionados 2 – Número de manchas – Media por pozo, y Núcleos seleccionados 2 – Área total de manchas – Media por pozo, y cópielos en hojas de cálculo nuevas para cada parámetro. Calcule la media de parámetros para los pozos replicados de cada condición y grafique según corresponda. 7. Ensayo de control de calidad para la homogeneidad de SH-SY5Ys fijos Recoger una alícuota de SH-SY5Ys vivos de la etapa 2.2 y resuspendir en el tampón de unión de anexina de un kit para la tinción de anexina V-FITC (véase la Tabla de materiales)a una concentración de aproximadamente 200.000 células por ml. Recolectar una alícuota de SH-SY5Ys fijos del paso 2.4 y resuspend en tampón de unión a anexina a una concentración de aproximadamente 200,000 células por ml. Preparar dos tubos de ensayo con 5 μL de anexina V-FITC y 5 μL de yoduro de propidio (ver Tabla de Materiales). Agregue 500 μL de SH-SY5Ys vivos a un tubo, y 500 μL de SH-SY5Ys fijos al otro. Preparar tres tubos de control: uno con 5 μL de anexina V-FITC, uno con 5 μL de yoduro de propidio y un tubo vacío. Mezcle una proporción de 1:1 de SH-SY5Ys vivos y fijos y agregue 500 μL de esto a cada tubo de control. Mezcle los tubos suavemente mediante pipeteo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, protegido de la luz. Medición inmediata en un citómetro de flujo (Ex = 488 nm; Em = 530 nm) utilizando el detector de señal FITC (generalmente FL1) para la anexina V-FITC, y el detector de señal de emisión de ficoeristrina (generalmente FL2) para el yoduro de propidio. Utilice cualquier software de análisis de citometría de flujo para mostrar gráficos de puntos de señal FITC vs PI y utilice una herramienta de gating rectangular para seleccionar la población doble negativa. Dentro de la población doble negativa, muestre FSC vs SSC y use una herramienta de puerta poligonal para crear una puerta de exclusión alrededor de la población con FSC y SSC muy bajos, que se clasifica como escombros y, por lo tanto, se excluye de un análisis posterior. Muestre los eventos restantes como señal FITC vs PI y use los controles de una sola mancha y sin mancha para establecer una puerta de cuadrante para los eventos FITC-/PI-, FITC+/PI-, FITC -/PI+ y FITC+/PI+.NOTA: Evite el manejo brusco, el vórtice o las incubaciones largas con SH-SY5Ys vivos, que podrían inducir artificialmente la visualización de fosfatidilserina. Proceda a la citometría de flujo sin demora. Un resultado deseable es que la proporción de eventos FITC-/PI- es del <5% en los SH-SY5Y fijos. Los resultados representativos se muestran en la Figura Suplementaria S1.

Representative Results

Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas se realizaron utilizando el protocolo descrito anteriormente, con macrófagos iPSC de tipo salvaje sembrados a 20,000 células por pozo. Se aplicaron diferentes cantidades de SH-SY5Ys (10.000-30.000 por pozo según lo estimado a partir del recuento celular en el paso 3.1), y el inhibidor de la fagocitosis citochalasina D fue preincubado (1 h) con algunos pozos, actuando como control para inhibir la fagocitosis para cada cantidad de SH-SY5Ys. Las imágenes comenzaron 40 minutos después de la adición de SH-SY5Ys y las imágenes se capturaron a intervalos de 5 minutos durante las siguientes 3 h (los datos incluyen el retraso inicial de 40 minutos). Un video representativo de lapso de tiempo se incluye en los Datos suplementarios,y los datos cuantitativos analizados se muestran en la Figura 3. Con la cantidad de 10,000 SH-SY5Ys por pozo, el número de partículas fagocitadas (manchas) por célula aumentó linealmente con el tiempo, y fue inhibido en aproximadamente un 50% por la citochalasina D. La inhibición por citochalasina D fue más débil de lo previsto, muy probablemente causada por réplicas técnicas o biológicas insuficientes, ya que solo se obtuvo una imagen de un pozo por condición con tres campos de imagen. Con mayores cantidades de SH-SY5Ys por pozo (20,000 y 30,000), la fagocitosis exhibió una linealidad deficiente, probablemente debido a la mala segmentación de los macrófagos iPSC y SH-SY5Ys en un campo de visión más concurrido. Las imágenes de alto contenido de células fijas se realizaron utilizando el protocolo descrito anteriormente, con macrófagos iPSC de tipo salvaje a 20,000 células por pozo, varias cantidades diferentes de SH-SY5Ys (10,000-80,000 por pozo), y la placa de ensayo se fijó y se obtuvo una imagen después de 5 h. Una imagen representativa de la fagocitosis se presenta en la Figura 4A,y los datos analizados se muestran en la Figura 4B17. El aumento de la cantidad de SH-SY5Ys resultó en un mayor número de partículas fagocitadas (manchas) por célula; sin embargo, una duplicación de la cantidad de SH-SY5Y solo conduce a un aumento de 1.5 veces en el número de manchas por célula. Esto indica que las cantidades analizadas no limitan la tasa de fagocitosis. Posteriormente se validó el ensayo de fagocitosis por imágenes de alto contenido utilizando varios inhibidores de la fagocitosis(Figura 4C)17. Los inhibidores de la polimerización de actina citochalasina D y jasplaquinolide inhibieron significativamente la fagocitosis en un 91% y 90%, respectivamente, cuando se preincubaron durante 1 h antes de la fagocitosis. El robusto Z’ del ensayo cuando se utilizan citochalasina D o jasplakinolide como controles negativos se calcula como 0,7 y 0,8, respectivamente20. El inhibidor de la acidificación del lisosoma bafilomycin A1 redujo significativamente la fagocitosis en un 31%, cuando se incubó 1 h antes de la fagocitosis. El efecto más débil del inhibidor de la acidificación del lisosoma frente a los inhibidores de la actina sugieren que la detección de la carga internalizada puede no requerir la acidificación completa del fagosoma. La anexina V recombinante se utilizó como control para bloquear específicamente la fosfatidilserina expuesta en la superficie de SH-SY5Ys, evitando que los receptores fagocíticos accedan al ligando, una importante señal de “comerme”. La adición de anexina V recombinante redujo significativamente la fagocitosis en un 30%, cuando se agregó a los pozos inmediatamente antes de la adición de SH-SY5Y. Se confirmó que los SH-SY5Y fijos exponían fosfatidilserina, utilizando una sonda fluorescente de anexina V, mientras que los SH-SY5Y vivos eran negativos para la tinción de anexina V(Figura 4D). El receptor de fagocitosis microglial TREM2 ha demostrado previamente ser importante para la fagocitosis de las neuronas apoptóticas21. La mutación R47H de TREM2 es un gen de riesgo para el inicio tardío de la enfermedad de Alzheimer, y se plantea la hipótesis de reducir la unión al ligando de TREM223. Con el objetivo de evaluar la función fagocítica de R47H TREM2 y TREM2 KO, se realizó el ensayo de fagocitosis de alto contenido de células fijas utilizando líneas isogénicas iPSC-macrófagos con WT/R47H/KO TREM217. Se probaron varias longitudes de duración de la fagocitosis de 1 a 5 h, utilizando una adición escalonada de carga fagocítica (40,000 SH-SY5Ys). La señal resultante aumenta linealmente a 4 h, estancando ligeramente a las 5 h (Figura 5)17. La reducción de la tasa y capacidad de fagocitosis (% de células positivas puntuales) fue evidente en el TREM2 KO en comparación con WT, mientras que el mutante R47H TREM2 no mostró fagocitosis alterada. El defecto fagocítico en las células TREM2 KO no es fenocopiado por la mutación R47H TREM2, aparentemente porque la función TREM2 es suficiente para apoyar la fagocitosis normal. Figura 3:Datos de ejemplo para el ensayo de fagocitosis de lapso de tiempo de células vivas. Captación de SH-SY5Ys muertos por macrófagos iPSC de tipo salvaje BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) fotografiados a intervalos de 5 minutos durante 3 h. Los tiempos que se muestran en el gráfico son desde el inicio de la fagocitosis, incluidos los primeros 40 minutos sin medición. Se traza el número promedio de manchas por célula de tres pozos replicados. La fagocitosis de 10.000 SH-SY5Ys se inhibe con citochalasina D de 10 μM con 1 h de pretratamiento, mientras que las cantidades más altas de SH-SY5Ys (20.000 y 30.000) tienen una cuantificación subóptima de la fagocitosis. Media ± desviación estándar (DE), N = 1 experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Optimización y validación del ensayo de fagocitosis de alto contenido de células fijas. (A) Imagen representativa de microscopía de alto contenido de SH-SY5Ys fagocitados por macrófagos iPSC de tipo salvaje BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Se muestra un punto de tiempo de 3 h con 40,000 SH-SY5Ys. Los canales de fluorescencia se fusionan, con la tinción de macrófagos iPSC que se muestra como roja, los núcleos como azules y SH-SY5Ys como amarillos. El panel insertado es una sección de la imagen ampliada 3x. (B) El número de manchas por célula de SH-SY5Ys muertos fagocitados después de 5 h, utilizando diferentes cantidades de carga adicionales a los macrófagos iPSC de tipo salvaje. Media ± error estándar de la media (SEM), para N = 3 cosechas. (C) La fagocitosis (3 h) se inhibe con 10 μM de citochalasina D (Cyt), 1 μM de bafilomicina A1 (Baf), 1 μM de jasplaquinolida (con 1 h de pretratamiento; Jas), y 13 μg/ml de anexina V recombinante (añadida simultáneamente a los SH-SY5Y muertos; Ana). Los macrófagos iPSC sin SH-SY5Ys agregados se utilizaron como control negativo (-ve), y el control positivo (+ve) es iPSC-macrófagos no tratados con SH-SY5Ys agregados. Los datos se normalizaron a la media para la repetición del experimento. Medias ± SEM, para N = cosechas 3-6 y con dos líneas celulares de tipo silvestre (SFC840-03-03, la caracterización de esta línea se describe en (Fernandes et al.21 y BIONi010-C). ANOVA de 1 vía con prueba post-hoc de Dunnett, comparaciones con células no tratadas. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Los SH-SY5Ys recién fijados se tiñen uniformemente para la visualización de fosfatidilserina (anexina V-FITC) y tienen una permeabilidad celular limitada (yoduro de propidio). Los SH-SY5Y vivos no se tiñen para la anexina V-FITC o el yoduro de propidio, excepto para la tinción focal presente en las pocas células muertas en cultivo. Las cifras se reproducen con permiso de Alzheimer’s Research & Therapy17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: La fagocitosis se reduce en TREM2 KO pero no en R47H TREM2 iPSC-macrófagos. Ensayo de fagocitosis de alto contenido realizado con 40,000 SH-SY5Ys por pozo con adiciones escalonadas. Se cuantificaron las medias para los parámetros: número de manchas por célula, suma de áreas puntuales(μm 2) por célula y porcentaje de células que contienen partículas fagocitadas por campo. Los datos se normalizaron para medias para cada genotipo por experimento. Media ± SEM, para N = 3 cosechas. ANOVA de 2 vías de medidas repetidas, la prueba post-hoc de Dunnett, comparaciones por pares con el WT para cada vez: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Las cifras se reproducen con permiso de Alzheimer's Research & Therapy17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura suplementaria S1: Ejemplo de control de calidad para la preparación de SH-SY5Ys. Los SH-SY5Y disociados se fijaron durante 10 min con 0% (células vivas), 1% y 2% de paraformaldehído (PFA), luego se lavaron. Las células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) e inmediatamente se midieron por citometría de flujo. Se crearon diagramas de puntos de densidad de color en el software de análisis de citometría de flujo, utilizando los controles de una sola mancha y sin teñir para colocar una puerta cuadrante. Los cuadrantes se anotan con el porcentaje de eventos dentro de ese cuadrante. Las células vivas están principalmente en Q4, y las células fijas están principalmente en Q2. Q1 = anexina V-/PI-, Q2 = anexina V+/PI+, Q3 = anexina V+/PI-, Q4 = anexina V-/PI- (células vivas). Haga clic aquí para descargar este archivo. Video complementario: Fagocitosis de lapso de tiempo de células vivas. Video representativo de lapso de tiempo de SH-SY5Ys fagocitado por macrófagos iPSC de tipo salvaje BIONi010-C (ID de ECACC: 66540023). Las imágenes se tomaron cada 5 minutos durante 3 h. El video se recorta y se ejecuta a 3 cuadros por segundo, mostrando las últimas 1.5 h del ensayo. Los SH-SY5Y teñidos con colorante sensible al ácido se muestran en rojo, la intensidad de la señal aumenta con la acidificación del fagosoma. Los núcleos celulares teñidos con Hoechst 33342 se muestran en azul. Haga clic aquí para descargar este video.

Discussion

La microglía tiene funciones importantes que afectan la iniciación y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluida la fagocitosis de las neuronas apoptóticas. La fagocitosis microglial alterada y la fagocitosis inapropiada de las sinapsis se han asociado con enfermedades neurodegenerativas, aunque los mecanismos subyacentes y la causalidad no se comprenden bien⁴^,²³. Este artículo describe un ensayo de fagocitosis para medir la fagocitosis de células apoptóticas por macrófagos iPSC, con una lectura de imágenes de lapso de tiempo de células vivas o microscopía de alto contenido de células fijas, o una combinación de ambas en un solo ensayo. Esta versatilidad significa que el ensayo se puede utilizar para estudiar eventos fagocíticos individuales a lo largo del tiempo en unos pocos pozos o se puede utilizar para la detección de alto contenido con múltiples afecciones o tratamientos. Dado que el ensayo de alto contenido se fija en un solo punto de tiempo, se podrían preparar múltiples placas de ensayo simultáneamente. El ensayo de alto contenido tiene una utilidad potencial para caracterizar macrófagos / microglía con variantes genéticas asociadas a la enfermedad o detectar inhibidores de moléculas pequeñas para detectar cambios en la fagocitosis. El ensayo también se puede adaptar fácilmente para estudiar la fagocitosis de otros modelos de microglía, o potencialmente astrocitos. El ensayo de fagocitosis puede potencialmente multiplexarse con tinciones de imágenes de células vivas, por ejemplo, mitocondrias, calcio o indicadores ROS, y se puede realizar tinción inmunofluorescente posterior a la fijación para proteínas de interés. En comparación con los ensayos de fagocitosis existentes que utilizan células neuronales apoptóticas, las principales ventajas que confiere este protocolo es que la preparación de la carga fagocítica es relativamente simple y rápida, y da como resultado un producto uniforme. Otros ensayos inducen apoptosis de neuronas o SH-SY5Ys con S-nitroso-L-cisteína durante 2 h^25,ácido okadaico durante 3 h^22,estaurosporina durante 4-16 h^26,^{27, 28,}²⁹o irradiación UV durante²⁴ h^30,y pueden dar lugar a células en diferentes etapas de la apoptosis. Además, las imágenes de células vivas y las lecturas de imágenes de alto contenido no se han descrito previamente, hasta donde los autores saben. La principal limitación del uso de la fijación de paraformaldehído para preparar la carga fagocítica es que no recapitula completamente el proceso de apoptosis, ya que la fijación evita que las células se dividan en cuerpos apoptóticos, que es probable que se fagocitan más rápidamente debido a su tamaño más pequeño. No se sabe qué efecto tiene la fijación sobre la secreción de señales de nucleótidos “encuéntrame” (por ejemplo, ATP, UDP) de la célula diana que atraen a los fagocitos. Similar a las células apoptóticas, los SH-SY5Ys fijos exhiben cierta permeabilidad de la membrana al yoduro de propidio. La permeabilidad de la membrana se asocia con la liberación de señales de “encuéntrame”; sin embargo, esto no se ha estudiado en los SH-SY5Y fijos, y si los nucleótidos se liberan demasiado rápido, se eliminarían antes de que los SH-SY5Y se agreguen a los macrófagos iPSC.

El primer paso crítico en el protocolo es la tinción de SH-SY5Ys muertos con un éster STP de un tinte fluorescente rojo sensible al pH. Este tinte reacciona rápida y covalentemente con aminas primarias libres en la superficie de los SH-SY5Y muertos. No es necesario optimizar la duración de la tinción; sin embargo, se debe tener cuidado con la manipulación del tinte antes del etiquetado. La reacción de etiquetado no debe realizarse en tampones que contengan aminas libres. Además, existe un riesgo de precipitación si la población dmSO se diluye en tampón acuoso frío o en alta concentración final. Los precipitados aparecerán como objetos oscuros densos bajo el microscopio. Además, la solución de tinte sensible al pH se adhiere a los tubos de centrífuga de plástico normales y se lava lentamente; por lo tanto, se recomiendan tubos de baja unión para el paso de etiquetado. El uso de un tinte sensible al pH, en lugar de un tinte fluorescente permanente, ayuda a la identificación de partículas engullidas, frente a las partículas vecinas a la membrana plasmática. Dado que hay cierta fluorescencia a pH neutro, la densidad de la carga fagocítica y los macrófagos iPSC deben mantenerse lo suficientemente bajas para una segmentación precisa, aunque lo suficientemente alta como para que se capturen numerosos eventos fagocíticos. La microscopía de alto contenido fue capaz de identificar con precisión la fagocitosis con una densidad media de carga en el pozo (más de 2 SH-SY5Ys por iPSC-macrófago). Por el contrario, debido a una sensibilidad más débil del microscopio en el espectro rojo profundo, la segmentación de los macrófagos iPSC en los datos de imágenes de lapso de tiempo de células vivas fue menos segura y fue necesario utilizar una densidad muy baja de carga para reducir la probabilidad de falsos positivos (1 SH-SY5Y por cada dos macrófagos iPSC). La validación de la segmentación adecuada y la densidad de carga debe realizarse con comparaciones entre pozos no tratados y tratados con citochalasina D. En un ensayo bien optimizado, la citochalasina D debería reducir el número promedio de manchas por célula en un 90% en relación con las muestras no tratadas.

Otro paso crítico en el protocolo es la tinción de macrófagos iPSC, que permite identificar y segmentar la célula en el análisis de imágenes para que cualquier SH-SY5Y externo se excluya del conteo. El colorante recomendado es penetrante celular, convertido en un producto fluorescente insoluble dentro del citoplasma, reparable y no tóxico (ver Tabla de Materiales). El paso de tinción se optimizó para el uso de macrófagos iPSC con el ensayo de fagocitosis por imágenes de alto contenido, y sugerimos que se vuelva a optimizar si se utilizan otros tipos de células. La duración de la tinción celular se puede aumentar para mejorar la deposición del producto fluorescente insoluble dentro de las células. Si se optimiza la concentración de colorante, se debe tener cuidado para evitar los niveles tóxicos del vehículo de disolvente orgánico.

El tercer factor crítico para el éxito del ensayo es el análisis de datos. Las tuberías de análisis proporcionadas están destinadas a ser de orientación en lugar de prescriptivas, ya que las diferencias en la intensidad de tinción o la morfología celular pueden reducir la efectividad de la segmentación de las tuberías tal como están escritas. Por lo tanto, se requerirán algunas optimizaciones, con pruebas de la tubería en controles positivos y negativos apropiados, y los parámetros que deben optimizarse se indican en el texto del protocolo. Los controles negativos deben incluir una afección en la que los macrófagos de iPSC se tratan previamente con un potente inhibidor de la fagocitosis como la citochalasina D antes de la adición de SH-SY5Ys. Otro posible control negativo es la adición del SH-SY5Ys a pozos previamente no tratados de macrófagos iPSC al final del ensayo, 10 minutos antes de la fijación, lo que permite cierto asentamiento de la carga, pero es demasiado corto para que ocurra una cantidad apreciable de fagocitosis. Un evento de fagocitosis se define como un objeto rojo-fluorescente dentro de los límites de un macrófago iPSC, definido por el algoritmo de software que utiliza el canal de fluorescencia de color rojo profundo. Si la segmentación de las células es pobre (Figura 2), muchos SH-SY5Ys no fagocitados en las proximidades de los macrófagos iPSC pueden incluirse erróneamente en el análisis, es decir, falsos positivos. El factor más importante para lograr una buena segmentación es la delineación estricta de los macrófagos iPSC. La segmentación para ambos análisis está automatizada, por lo que no es posible obtener una segmentación perfecta para cada célula; sin embargo, se pueden ajustar algunos parámetros para que la segmentación sea más óptima, utilizando algunas imágenes de prueba como referencia. El control de la citochalasina D es importante para evaluar la segmentación óptima porque un alto número de eventos fagocíticos detectados en esta condición indica que la segmentación es subóptima. Idealmente, la optimización de la canalización de análisis de datos debe repetirse hasta que el número de eventos fagocíticos por célula sea entre un 80% y un 90% menor en la condición de citochalasina D frente a ningún inhibidor.

Los problemas con el ensayo de fagocitosis que tienen más probabilidades de ocurrir son: (1) fluorescencia débil sensible al pH en controles positivos, (2) distribución escasa o desigual de macrófagos al final del ensayo, o (3) alto número de falsos positivos en el análisis de SH-SY5Y no fagocitados. La solución de problemas de fluorescencia débil sensible al pH debe verificar en primer lugar que la tinción del SH-SY5Ys resultó en un gránulo celular con un fuerte color magenta. Si el color es débil, asegúrese de que se utiliza un material de tinte fresco, asegúrese de que el tampón de etiquetado esté libre de aminas, agregue un lavado adicional al SH-SY5Ys antes de la tinción, verifique si se tiñó el número correcto de SH-SY5Y, asegúrese de que no haya precipitados de tinte en evidencia y optimice la concentración de etiquetado del tinte. Si los SH-SY5Y están fuertemente teñidos, verifique si la concentración agregada a la placa de ensayo es correcta y asegúrese de que los macrófagos iPSC estén sanos y no sean demasiado viejos. El segundo tipo de problema, la distribución desigual de macrófagos, puede ser el resultado de la pérdida de células durante el pipeteo y se deben tomar medidas para reducir las fuerzas de pipeteo experimentadas por las células, evitando las puntas de diámetro estrecho. Si el problema persiste, reduzca el tiempo de incubación de la carga de los macrófagos iPSC con colorante permeante celular. El tercer problema, con respecto a la inclusión errónea de partículas no fagocitadas en el análisis, indica que se requiere una mayor optimización de la tubería de análisis. La solución de problemas debe centrarse en primer lugar en la segmentación de celdas y si el software está incluyendo objetos adyacentes. Los parámetros específicos que se pueden ajustar se sugieren en las notas a continuación de los pasos relevantes (pasos 6.1.11-6.1.15 para el análisis de lapso de tiempo de celda viva y pasos 6.2.4-6.2.8 para el análisis de alto contenido). Si la segmentación celular no se puede mejorar aún más, el análisis de alto contenido tiene un paso adicional (paso 6.2.8) que excluye los macrófagos iPSC mal segmentados. Además, se puede optimizar el módulo que filtra los puntos aceptados de fluorescencia sensible al pH dentro de los macrófagos iPSC, aumentando la intensidad umbral de los objetos aceptados, lo que debería ayudar a excluir los SH-SY5Y no fagocitados (paso 6.1.17 para el análisis de lapso de tiempo de células vivas y paso 6.2.11 para el análisis de alto contenido).

Desarrollamos dos tipos de lectura de microscopía para el ensayo de fagocitosis que tienen ventajas y limitaciones. Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas tienen el mérito de proporcionar información adicional sobre la cinética de la fagocitosis y están más ampliamente disponibles que las plataformas de imágenes de alto contenido. El software de código abierto recomendado es agnóstico a la fuente del microscopio y podría usarse con cualquier microscopio fluorescente de buena calidad, con o sin capacidad de lapso de tiempo de células vivas. La principal limitación de las imágenes de células vivas es la sensibilidad y la óptica limitadas, lo que hace que sea más difícil detectar y realizar una buena segmentación de los macrófagos iPSC. Esta limitación podría mitigarse aumentando la duración de la tinción de macrófagos iPSC, o cambiando a un microscopio más sensible, si está disponible. El ensayo de fagocitosis por imágenes de alto contenido es la lectura recomendada si hay un sistema de imágenes de alto contenido disponible. Los sistemas de imágenes de alto contenido permiten un mayor rendimiento y datos más confiables, lo que permite que este ensayo se utilice para la detección, en la que se esperaría una robusta Z’ de ≥0.7 para la salida “número de puntos por célula”²⁰. En comparación con el método de lapso de tiempo de células vivas, la lectura de microscopía de alto contenido tiene una mayor sensibilidad, un mayor grado de automatización y velocidad, se pueden procesar más pozos y campos de imágenes, y se producen imágenes confocales de alta resolución. La segmentación celular es más efectiva con buenas imágenes, y la segmentación también es ayudada por el software de análisis de imágenes de alto contenido que proporciona más métodos de segmentación celular adecuados para células de forma altamente irregular. El software de análisis de imágenes de alto contenido también calculó más parámetros de fagocitosis, en comparación con el software de código abierto, como el porcentaje de células fagocíticas. La principal limitación del ensayo de fagocitosis de alto contenido es la del costo y la accesibilidad del sistema de imágenes y el software de análisis.

En conclusión, el ensayo cuantitativo de fagocitosis presentado en este artículo es una herramienta útil para modelar la fagocitosis de microglia de neuronas muertas in vitro. La microglía es modelada por iPSC-macrófagos y las neuronas muertas son modeladas por SH-SY5Ys fijado en paraformaldehído. Aunque no son los modelos de microglia y neuronas muertas/apoptóticas más auténticos publicados, estos son fáciles de preparar y escalables. El ensayo en sí es altamente versátil, con dos tipos de lectura de imágenes detalladas, y tiene potencial para ser adaptado para su uso con diferentes modelos de monocultivo de microglia / macrófagos, o un tipo de célula diferente para actuar como carga fagocítica. La lectura de imágenes de alto contenido es ventajosa para obtener datos cuantitativos y se puede escalar para evaluar moduladores de moléculas pequeñas de fagocitosis o variantes genéticas de detección en los macrófagos iPSC. Sin embargo, dado que los sistemas de imágenes de alto contenido son caros y tienen muchos datos, se ha incluido una lectura de imágenes alternativa en el protocolo utilizando un microscopio de lapso de tiempo de células vivas, que podría sustituirse por cualquier microscopio de fluorescencia convencional de buena calidad, si es necesario.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al Dr. Val Millar y al Dr. Sohaib Nizami por su ayuda con la microscopía de alto contenido, y al Dr. Daniel Ebner por el acceso a los microscopios de alto contenido. Además, los autores agradecen a la Dra. Emma Mead por el asesoramiento sobre el desarrollo de ensayos y a la Sra. Cathy Browne por el apoyo de iPSC. Este trabajo fue apoyado por el Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, referencia de subvención ARUK-2020DDI-OX), con apoyo adicional al James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) de la Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award de Parkinson’s UK (J-1403); MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 y Momentum MC_PC_16034 Awards.

Materials

15 mL conical centrifuge tube	Falcon	352096	For centrifugation of cells
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes
2-mercaptoethanol 50 mM	Gibco	31350010	Component of Factory media
4% paraformaldehyde in PBS	Alfa Aesar	J61899	For fixation of cells
6-well plate, tissue culture treated
AggreWell-800 24-well plate	STEMCELL Technologies	34815	Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit	Abcam	ab14085	Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.
Automated cell counter
Benchtop centrifuge
Benchtop microcentrifuge
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid	Perkin Elmer	6055302	96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay
CellProfiler software			Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.
CellTracker Deep Red dye	Thermo Fisher	C34565	Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.
Class 2 laminar air flow safety cabinet
CO₂ gas bottle			Accessory for EVOS FL Auto
CO₂ incubator, set to 37°C and 5 % CO₂
Columbus Image Data Storage and Analysis System	Perkin Elmer	Columbus	Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.
Cytochalasin D	Cayman	11330	Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Component of SH-SY5Y media
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for CellTracker and pHrodo dyes
EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher	AMF4300	Live-cell time-lapse imaging microscope
EVOS Light Cube CY5	Thermo Fisher	AMEP4656	Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube DAPI	Thermo Fisher	AMEP4650	Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube RFP	Thermo Fisher	AMEP4652	Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Onstage Incubator	Thermo Fisher	AMC1000	Accessory for EVOS FL Auto
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135	Component of SH-SY5Y media
Flow cytometer
Flow cytometry analysis software
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Invitrogen	A1413302	hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-038	Component of both Factory and Macrophage media
HBSS	Lonza	BE 10-547F	Hank’s balanced salt solution for washing steps
Human recombinant BMP4	Gibco	PHC9534	Component of Embryoid Body media
Human recombinant IL-3	Gibco	PHC0033	Component of both Factory and Macrophage media
Human recombinant SCF	Miltenyi Biotech	130-096-695	Component of Embryoid Body media
Human recombinant VEGF	Gibco	PHC9394	Component of Embryoid Body media
Live Cell Imaging Solution	Thermo Fisher	A14291DJ	Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys
Low protein binding 2 mL tubes	Eppendorf	30108.132	For staining SH-SY5Ys
M-CSF	Thermo Fisher	PHC9501	Component of both Factory and Macrophage media
mTeSR1 Medium	STEMCELL Technologies	85850	iPSC media
Multichannel 20-200 uL pipette			For liquid handling of 96-well plate
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher	R37605	Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer	HH14000000	High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media
pHrodo iFL Red STP-Ester	Thermo Fisher	P36011	pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.
Serological pipette filler
T175 flask, tissue culture treated			Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories"
T75 flask			Vessel for SH-SY5Y culture
Transparent plate sealers	Greiner Bio-One	676001	For assay plate storage and transportation
TrypLE Express (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.
Water bath, set to 37°C
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red	Lonza	BE04-418F	Component of Factory and Macrophage media
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red	Lonza	04-744Q	Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors

References

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Hall-Roberts, H., Di Daniel, E., James, W. S., Davis, J. B., Cowley, S. A. In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages. J. Vis. Exp. (168), e62217, doi:10.3791/62217 (2021).

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