Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.
Microglia orquestra respostas neuroimunes em várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Microglia limpa neurônios mortos e moribundos através do processo de eferócitose, uma forma especializada de fagocitose. A função fagocitose pode ser interrompida por fatores de risco ambientais ou genéticos que afetam a microglia. Este artigo apresenta um protocolo de microscopia in vitro rápido e simples para o estudo da equecriose microglial em um modelo de microglia (célula-tronco pluripotente) induzida, utilizando uma linha celular neuroblastoma humana (SH-SY5Y) rotulada com um corante sensível ao pH para a carga fagocítica. O procedimento resulta em um alto rendimento de células neuroblastoma mortas, que exibem fosfartidylserina superficial, reconhecida como um sinal de “comer-me” por fagocitos. O ensaio de placa de 96 poços é adequado para imagens de lapso de tempo de células vivas, ou a placa pode ser corrigida com sucesso antes de processamento adicional e quantificada por microscopia de alto conteúdo. A microscopia de alto teor de células fixas permite que o ensaio seja dimensionado para triagem de inibidores de pequenas moléculas ou avaliando a função fagocítica das linhas iPSC da variante genética. Embora este ensaio tenha sido desenvolvido para estudar fagocitose de células de neuroblastoma mortas por macrófagos iPSC, o ensaio pode ser facilmente adaptado para outras cargas relevantes para doenças neurodegenerativas, como sinapstos e mielina, e outros tipos de células fagocíticas.
Microglia são macrófagos residentes em tecido cerebral, e suas funções incluem vigilância imunológica, coordenação de respostas inflamatórias a lesões/infecções, remodelação sináptica e fagocitose de células mortas, mielina, agregados de proteínas e patógenos. A fagocitose é o processo pelo qual a microglia reconhece a carga com receptores superficiais e reorganiza seu citoesqueleto para engolir o objeto em um fagosome, que então se funde com lisosomos para degradação da carga. Microglia saudável fagocytose células cerebrais apoptóticas para removê-las antes de se tornarem necrosas1. A fagocitose das células apoptóticas também é conhecida como eferocisose, e requer a exibição de um sinal de fosfatidídeserina “comer-me” pela célulamoribunda 2. Numerosos receptores de microglia se ligam diretamente à fosfatidíserina, incluindo TIM-4, BAI1, Stabilin-2 e TREM2. Receptores TAM microglial (por exemplo, MERTK) e integrinos indiretamente se ligam à fosfatidíserina, utilizando proteínas acessórias GAS6 ou MFG-E8, respectivamente. Outros sinais de “comer-me” podem ser necessários para o reconhecimento de células moribundas, estes incluem alterações na glicoseção ou carga de proteínas superficiais; expressão de proteínas intracelulares ICAM3, calreticulina, anexo-I na superfície celular; LDL oxidado; ou revestimento da célula apoptótica por complemento produzido por microglia C1q1,2.
Doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson, doença de Alzheimer, demência frontotemporal e esclerose lateral amiotrófica têm sido associadas ao comprometimento da função microglia, incluindo o acúmulo de resíduos cerebrais, como células mortas, fragmentos de mielina e agregados proteicos, e respostas inflamatórias exageradas a esses estímulos3. A fagocitose pode ser prejudicada em doenças neurodegenerativas e contribuir para a patologia, devido a uma combinação de envelhecimento, inflamação ou variantes específicas de risco genético4,5. Por outro lado, há também evidências de modelos animais de doenças neurodegenerativas de que a microglia pode inapropriadamente fagocytose neurônios viáveis ou sinapses6,7,8. É provável que o mecanismo seja instigado pela exibição fosfatidylserina de neurites danificados, que é diretamente sentido pelos receptores de fagocitose microglial TREM2 ou GPR56, ou indiretamente sentido pelo complemento solúvel C1q revestimento da membrana enriquecida com fosfartidylserina, levando à fagocitose mediada por CR39,10,11.
Ensaios in vitro da função fagocitose, por exemplo, para avaliar o impacto fenotípico de uma variante de risco genético na microglia, são frequentemente realizados utilizando cargas não fisiológicas, como contas de látex4. Bactérias fluorescentes e zimosãs também são utilizadas, que são fisiológicas, mas não relevantes para doenças neurodegenerativas. Cargas fagocíticas não fisiológicas podem ser usadas para detectar defeitos no maquinário básico do engolamento fagocítico, mas não modelam com precisão o primeiro passo de “reconhecimento” na fagocitose dos neurônios apoptóticos. O tamanho, a forma, a rigidez e o tipo de carga também ditam as vias de sinalização intracelular que são ativadas, levando a diferentes resultados do estado de ativação da microglia. Por exemplo, as bactérias E.coli são pequenas e rígidas, ao contrário das células humanas, e os lipopólises em sua superfície são reconhecidos pelo receptor Toll-like 4 (TLR4) que ativa a fagocitose e as vias de sinalização pró-inflamatórias2,12.
No contexto de estudos de doenças neurodegenerativas, uma carga fagocítica mais relevante teria exibição de fosfatidylserina em membranas plasmáticas de mamíferos, e seria idealmente humana e neuronal, para incluir sinais que a microglia provavelmente encontrará. Para este protocolo de fagocitose, a linha celular neuroblastoma humana SH-SY5Y foi escolhida como um modelo de neurônio fácil de cultivar. A exposição permanente de fosfatidylserina foi artificialmente induzida por paraformaldeído, que já foi mostrado para causar exibição de fosfatidíserina de plaquetas13. Para o modelo microglia foram utilizados macrófagos humanos iPSC-macrófagos, que imitam o perfil ontogenia e transcricional da microglia humana, e são phagocyticamente competentes14,15,16,17. os macrófagos iPSC não são o modelo de microglia mais autêntico disponível, por exemplo, eles não imitam a morfologia da microglia; no entanto, pode-se substituí-lo por um modelo iPSC de monocultura mais autêntico, se desejar, como Haenseler et al.15. Os modelos humanos de iPSC são preferíveis à microglia de roedores primários para estudar a neurodegeneração, devido a preocupações com a sobreposição limitada dos módulos transcricionais de microglia observados nos tecidos da doença neurodegenerativa humana versuscamundongos 18. Os SH-SY5Ys mortos são manchados com um corante sensível ao ácido que fluoresce fracamente no pH neutro e mais fortemente dentro dos fagolicosomos de iPSC-macrófagos após fagocitose. O uso de um corante sensível ao ácido melhora a precisão da detecção de eventos fagocíticos, com versatilidade para diferentes leituras de macrófagos vivos e fixos19. Este protocolo descreve tanto a imagem de lapso de tempo de célula viva da fagocitose, quanto um ensaio de imagem fixo de alto teor de conteúdo para fagocitose, com as mesmas etapas de preparação celular antes da leitura(Figura 1).
Figura 1: Diagrama esquemático da metodologia. O esboço do ensaio de fagocitose, onde a preparação dos SH-SY5Ys e a coloração dos macrófagos iPSC são realizados em paralelo, e então os SH-SY5Ys são pipetados sobre os macrófagos iPSC. Ou a imagem de lapso de tempo de células vivas é realizada imediatamente, ou as células são incubadas a 37 °C/5% de CO2 para a duração necessária e fixadas antes de realizar microscopia de alto conteúdo. PFA: paraformaldeído, HBM: mídia sem fenol sem fenol, pHr: solução de corante fluorescente vermelho sensível ao pH STP Ester, PRFMM: mídia macrófago sem fenol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A microglia tem funções importantes que afetam a iniciação e progressão de doenças neurodegenerativas, incluindo fagocitose de neurônios apoptóticos. A fagocitose microglial prejudicada e a fagocitose inadequada das sinapses têm sido associadas a doenças neurodegenerativas, embora os mecanismos e causalidades subjacentes não sejam bem compreendidos4,23. Este artigo descreve um ensaio de fagocitose para medir a fagocitose de células apoptóticas por macrófagos iPSC, com uma leitura de imagem de lapso de tempo de células vivas ou microscopia de alto conteúdo de células fixas, ou uma combinação de ambos em um único ensaio. Essa versatilidade significa que o ensaio pode ser usado para estudar eventos fagácticos individuais ao longo do tempo em alguns poços ou usado para triagem de alto conteúdo com múltiplas condições ou tratamentos. Uma vez que o ensaio de alto teor é fixado em um único ponto de tempo, várias placas de ensaio podem ser preparadas simultaneamente. O ensaio de alto teor tem utilidade potencial para caracterizar macrófagos/microglia com variantes genéticas associadas à doença ou triagem de inibidores de pequenas moléculas para alterações na fagocitose. O ensaio também pode ser facilmente adaptado para estudar fagocitose de outros modelos de microglia, ou potencialmente astrócitos. O ensaio de fagocitose pode potencialmente ser multiplexado com manchas de imagem de células vivas, por exemplo, mitocôndrias, cálcio ou indicadores ROS, e coloração imunofluorescente pós-fixação para proteínas de interesse pode ser realizada. Em comparação com os ensaios de fagocitose existentes que utilizam células neuronais apoptóticas, as principais vantagens que este protocolo confere é que a preparação da carga fagocítica é relativamente simples e rápida, e resulta em um produto uniforme. Outros ensaios induzem apoptose de neurônios ou SH-SY5Ys com S-nitroso-L-cisteína por 2 h25, ácido okadaico para 3 h22, staurospor para 4-16 h26,27,28,29 ou UV-irradiação para 24 h30, e pode resultar em células em diferentes estágios da apoptose. Além disso, as imagens de células vivas e leituras de imagens de alto conteúdo não foram descritas anteriormente, tanto quanto os autores sabem. A principal limitação do uso da fixação do paraformaldeído para preparar a carga fagocítica é que ela não recapitule totalmente o processo de apoptose, uma vez que a fixação impede que as células separem em corpos apoptóticos, que provavelmente serão fagocitados mais rapidamente devido ao seu tamanho menor. Não se sabe qual efeito a fixação tem sobre a secreção de sinais nucleotídeos de “me encontre” (por exemplo, ATP, UDP) da célula alvo que atraem fagocitos. Semelhante às células apoptóticas, os SH-SY5Ys fixos exibem alguma permeabilidade de membrana ao iodeto propidium. A permeabilidade da membrana está associada à liberação de sinais de “encontre-me”; no entanto, isso não foi estudado nos SH-SY5Ys fixos, e se o nucleotídeo for liberado muito rapidamente, eles serão lavados antes que os SH-SY5Ys sejam adicionados aos macrófagos iPSC.
O primeiro passo crítico no protocolo é a coloração de SH-SY5Ys mortos com um éster STP de um corante fluorescente vermelho sensível ao pH. Este corante reage rapidamente e covalentemente com aminas primárias livres na superfície dos SH-SY5Ys mortos. A duração da coloração não precisa ser otimizada; no entanto, deve-se tomar cuidado com o manuseio do corante antes da rotulagem. A reação de rotulagem não deve ser realizada em buffers contendo aminas livres. Além disso, há risco de precipitação se o estoque de DMSO for diluído em tampão aquoso frio ou em alta concentração final. Precipitados aparecerão como objetos escuros densos sob o microscópio. Além disso, a solução de corante sensível ao pH gruda em tubos regulares de centrífugas plásticas e lava lentamente; portanto, são recomendados tubos de baixa ligação para a etapa de rotulagem. O uso de um corante sensível ao pH, em vez de um corante permanentemente fluorescente, auxilia na identificação de partículas engolfadas, contra partículas que vizinhos à membrana plasmática. Uma vez que há alguma fluorescência no pH neutro, a densidade da carga fagocítica e dos macrófagos iPSC precisam ser mantidos baixos o suficiente para uma segmentação precisa, embora alto o suficiente para que numerosos eventos fagocíticos sejam capturados. A microscopia de alto teor foi capaz de identificar com precisão a fagocitose com uma densidade média de carga no poço (mais de 2 SH-SY5Ys por iPSC-macrófago). Por outro lado, devido à sensibilidade mais fraca do microscópio no espectro vermelho profundo, a segmentação de macrófagos iPSC nos dados de imagem de lapso de tempo de células vivas foi menos confiante e foi necessário usar uma densidade muito baixa de carga para reduzir a probabilidade de falsos positivos (1 SH-SY5Y para cada dois macrófagos iPSC). A validação da segmentação adequada e da densidade da carga deve ser realizada com comparações entre poços não tratados e citochalasin D tratados. Em um ensaio bem otimizado, a citochalasina D deve reduzir o número médio de manchas por célula em 90% em relação a amostras não tratadas.
Outro passo crítico no protocolo é a coloração iPSC-macrófago, que permite que a célula seja identificada e segmentada na análise de imagens para que quaisquer SH-SY5Ys externos sejam excluídos da contagem. O corante recomendado é permeante celular, convertido em um produto fluorescente insolúvel dentro do citoplasma, fixável e não tóxico (ver Tabela de Materiais). A etapa de coloração foi otimizada para o uso de macrófagos iPSC com o ensaio de fagocitose de imagem de alto teor, e sugerimos que ele deve ser retim otimizado se outros tipos de células forem usados. A duração da coloração celular pode ser aumentada para melhorar a deposição do produto fluorescente insolúvel dentro das células. Se a concentração de corante for otimizada, deve-se tomar cuidado para evitar níveis tóxicos do veículo solvente orgânico.
O terceiro fator crítico para o sucesso do ensaio é a análise dos dados. Os gasodutos de análise fornecidos destinam-se a ser de orientação e não prescritivo, pois diferenças na intensidade de coloração ou morfologia celular podem reduzir a eficácia da segmentação dos gasodutos conforme escrito. Algumas otimizações serão, portanto, necessárias, com testes do pipeline sobre controles positivos e negativos adequados, e os parâmetros que devem ser otimizados estão indicados no texto do protocolo. Os controles negativos devem incluir uma condição em que os macrófagos iPSC são pré-tratados com um potente inibidor de fagocitose, como a citochalasina D antes da adição de SH-SY5Ys. Outro possível controle negativo é a adição dos SH-SY5Ys a poços não tratados anteriormente de macrófagos iPSC no final do ensaio, 10 minutos antes da fixação, o que permite algum ajuste da carga, mas é muito curto para que ocorra uma quantidade considerável de fagocitose. Um evento de fagocitose é definido como um objeto vermelho-fluorescente dentro das bordas de um iPSC-macrophage, definido pelo algoritmo de software usando o canal de fluorescência vermelho profundo. Se a segmentação das células for ruim(Figura 2),muitas SH-SY5Ys não fagocytosed em proximidade com iPSC-macrófagos podem ser erroneamente incluídas na análise, ou seja, falsos positivos. O fator mais importante para alcançar uma boa segmentação é o delineamento rigoroso dos macrófagos iPSC. A segmentação para ambas as análises é automatizada, portanto não é possível obter uma segmentação perfeita para cada célula; no entanto, alguns parâmetros podem ser ajustados para tornar a segmentação mais ideal, usando algumas imagens de teste como referência. O controle de citochalasina D é importante para avaliar a segmentação ideal, pois um alto número de eventos fagocíticos detectados nesta condição indica que a segmentação é sub-ideal. A otimização do pipeline de análise de dados deve ser idealmente repetida até que o número de eventos fagocíticos por célula seja 80%-90% menor na condição de citochalasina D versus nenhum inibidor.
Os problemas com o ensaio de fagocitose que são mais propensos a ocorrer são: (1) fluorescência fraca sensível ao pH em controles positivos, (2) distribuição esparsa ou desigual de macrófagos no final do ensaio, ou (3) alto número de falso-positivos na análise de SH-SY5Ys não fagoctos. A solução de problemas da fluorescência fraca sensível ao pH deve primeiro verificar que a coloração dos SH-SY5Ys resultou em uma pelota celular com uma cor magenta forte. Se a cor for fraca, certifique-se de que um estoque de corante fresco seja usado, certifique-se de que o buffer de rotulagem esteja livre de amina, adicione uma lavagem extra aos SH-SY5Ys antes de colorir, verifique se o número correto de SH-SY5Ys foi manchado, certifique-se de que não há precipitações de corante e otimize a concentração de rotulagem do corante. Se os SH-SY5Ys estiverem fortemente manchados, verifique se a concentração adicionada à placa de ensaio está correta e certifique-se de que os macrófagos iPSC são saudáveis e não muito velhos. O segundo tipo de problema, a distribuição desigual do macrófago, pode resultar da perda de células durante a tubulação e devem ser tomadas medidas para reduzir as forças de tubulação experimentadas pelas células, evitando pontas estreitas. Se o problema permanecer, reduza o tempo de incubação do carregamento dos macrófagos iPSC com corante permeante celular. O terceiro problema, em relação à inclusão errônea de partículas não fagocitas na análise, indica que é necessária mais otimização do pipeline de análise. A solução de problemas deve se concentrar em primeiro lugar na segmentação celular e se o software está incluindo objetos adjacentes. Parâmetros específicos que podem ser ajustados são sugeridos nas notas abaixo das etapas relevantes (etapas 6.1.11-6.1.15 para a análise de lapso de tempo de célula viva e etapas 6.2.4-6.2.8 para a análise de alto teor de conteúdo). Se a segmentação celular não puder ser melhorada, a análise de alto teor tem um passo extra (etapa 6.2.8) que exclui macrófagos iPSC segmentados incorretamente. Além disso, o módulo que filtra pontos aceitos de fluorescência sensível ao pH dentro de macrófagos iPSC pode ser otimizado, aumentando a intensidade limiar dos objetos aceitos, o que deve ajudar a excluir sh-SY5Ys não fagocitados (etapa 6.1.17 para a análise de lapso de tempo de células vivas e passo 6.2.11 para a análise de alto teor).
Desenvolvemos dois tipos de leitura de microscopia para o ensaio de fagocitose que cada um tem vantagens e limitações. A imagem de lapso de tempo de células vivas tem o mérito de fornecer informações extras sobre cinética de fagocitose e está mais amplamente disponível do que plataformas de imagem de alto conteúdo. O software de código aberto recomendado é agnóstico para a fonte do microscópio e pode ser usado com qualquer microscópio fluorescente de boa qualidade, com ou sem capacidade de lapso de tempo de célula viva. A principal limitação da imagem de células vivas é a sensibilidade e a óptica limitadas, o que torna mais desafiador detectar e executar uma boa segmentação de macrófagos iPSC. Essa limitação pode ser atenuada, aumentando a duração da coloração iPSC-macrófago, ou mudando para um microscópio mais sensível, se disponível. O ensaio de phagocytosis de imagem de alto conteúdo é a leitura recomendada se um sistema de imagem de alto conteúdo estiver disponível. Sistemas de imagem de alto teor de conteúdo permitem maior rendimento e dados mais confiáveis, permitindo que este ensaio seja usado para triagem, no qual seria esperado um Z’ robusto de ≥0,7 para a saída “número de pontos por célula”20. Em comparação com o método de lapso de tempo de células vivas, a leitura de microscopia de alto conteúdo tem maior sensibilidade, maior grau de automação e velocidade, mais poços e campos de imagem podem ser processados e imagens confocal de alta resolução são produzidas. A segmentação celular é mais eficaz com boas imagens, e a segmentação é adicionalmente auxiliada pelo software de análise de imagens de alto conteúdo, fornecendo mais métodos de segmentação celular adequados para células altamente irregulares. O software de análise de imagens de alto teor de conteúdo também calculou mais parâmetros de fagocitose, em comparação com o software de código aberto, como a porcentagem de células fagocíticas. A principal limitação do ensaio de fagocitose de alto teor é de custo e acessibilidade do sistema de imagem e software de análise.
Em conclusão, o ensaio quantitativo de fagocitose apresentado neste artigo é uma ferramenta útil para modelar a fagocitose de microglia de neurônios mortos in vitro. As microglias são modeladas por macrófagos iPSC e os neurônios mortos são modelados por SH-SY5Ys fixos em paraformaldeído. Embora não sejam os modelos de neurônios mais autênticos e mortos/apoptóticos publicados, estes são fáceis de preparar e escaláveis. O ensaio em si é altamente versátil, com dois tipos de leitura de imagem detalhados, e tem potencial para ser adaptado para uso com diferentes modelos de monocultura microglia/macrófago, ou um tipo de célula diferente para atuar como carga fagocítica. A leitura de imagens de alto teor é vantajosa para a obtenção de dados quantitativos e pode ser dimensionada para avaliar pequenos moduladores de moléculas de fagocitose, ou tela variantes genéticas nos macrófagos iPSC. No entanto, uma vez que os sistemas de imagem de alto conteúdo são caros e pesados em dados, uma leitura alternativa de imagem foi incluída no protocolo usando um microscópio de lapso de tempo de células vivas, que poderia ser substituído por qualquer microscópio convencional de fluorescência de boa qualidade, se necessário.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem ao Dr. Val Millar e ao Dr. Sohaib Nizami por sua assistência com microscopia de alto conteúdo, e o Dr. Daniel Ebner pelo acesso aos microscópios de alto conteúdo. Além disso, os autores agradecem à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, referência de subvenção ARUK-2020DDI-OX), com apoio adicional à James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) da Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award do Reino Unido de Parkinson (J-1403); a MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 e Momentum MC_PC_16034 Awards.
15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
6-well plate, tissue culture treated | |||
AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
Automated cell counter | |||
Benchtop centrifuge | |||
Benchtop microcentrifuge | |||
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
Flow cytometer | |||
Flow cytometry analysis software | |||
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
Serological pipette filler | |||
T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
Water bath, set to 37°C | |||
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |