JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Published: February 14, 2021
doi:
10.3791/62217
, , , ,
1James Martin Stem Cell Facility, Sir William Dunn School of Pathology,University of Oxford, 2Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine Research Building,University of Oxford, 3UK Dementia Research Institute,Cardiff University

Summary

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

Abstract

Microglia orkestreren neuro-immuunreacties bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. Microglia ruimen dode en stervende neuronen op door het proces van efferocytose, een gespecialiseerde vorm van fagocytose. De fagocytosefunctie kan worden verstoord door omgevings- of genetische risicofactoren die microglia beïnvloeden. Dit artikel presenteert een snel en eenvoudig in vitro microscopieprotocol voor het bestuderen van microgliale efferocytose in een geïnduceerd pluripotent stamcelmodel (iPSC) van microglia, met behulp van een menselijke neuroblastoomcellijn (SH-SY5Y) gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof voor de fagocytische lading. De procedure resulteert in een hoge opbrengst van dode neuroblastoomcellen, die oppervlaktefosfatidylserine vertonen, herkend als een “eet-me” -signaal door fagocyten. De 96-well plaattest is geschikt voor live-cell time-lapse imaging, of de plaat kan met succes worden gefixeerd voorafgaand aan verdere verwerking en gekwantificeerd door microscopie met een hoog gehalte. Fixed-cell high-content microscopie maakt het mogelijk om de test op te schalen voor screening van kleine molecuulremmers of het beoordelen van de fagocytische functie van genetische variant iPSC-lijnen. Hoewel deze test is ontwikkeld om fagocytose van hele dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen te bestuderen, kan de test gemakkelijk worden aangepast voor andere ladingen die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten, zoals synaptosomen en myeline, en andere fagocytische celtypen.

Introduction

Microglia zijn macrofagen die in hersenweefsel wonen en hun functies omvatten immuunsurveillance, het coördineren van ontstekingsreacties op letsel / infectie, synaptische remodellering en fagocytose van dode cellen, myeline, eiwitaggregaten en pathogenen. Fagocytose is het proces waarbij microglia lading herkennen met oppervlaktereceptoren en hun cytoskelet reorganiseren om het object te verzwelgen tot een fagosoom, dat vervolgens fuseert met lysosomen voor degradatie van de lading. Gezonde microglia fagocytose apoptotische hersencellen om ze te verwijderen voordat ze necrotisch worden1. De fagocytose van apoptotische cellen is ook bekend als efferocytose en vereist de weergave van een fosfatidylserine “eet-me” -signaal door de stervende cel2. Talrijke microgliareceptoren binden direct aan fosfatidylserine, waaronder TIM-4, BAI1, Stabilin-2 en TREM2. Microgliale TAM-receptoren (bijv. MERTK) en integrinen binden indirect aan fosfatidylserine, met behulp van respectievelijk accessoire-eiwitten GAS6 of MFG-E8. Andere “eet-me” -signalen kunnen nodig zijn voor herkenning van stervende cellen, deze omvatten veranderingen in glycosylatie of lading van oppervlakte-eiwitten; expressie van intracellulaire eiwitten ICAM3, calreticuline, annexine-I aan het celoppervlak; geoxideerd LDL; of coating van de apoptotische cel door microglia-geproduceerd complement C1q1,2.

Neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, frontotemporale dementie en amyotrofische laterale sclerose zijn in verband gebracht met een aantasting van de microgliafunctie, waaronder een opeenhoping van hersenafvalproducten zoals dode cellen, myelinefragmenten en eiwitaggregaten, en overdreven ontstekingsreacties op deze stimuli3. Fagocytose kan worden aangetast bij neurodegeneratieve ziekten en bijdragen aan de pathologie, als gevolg van een combinatie van veroudering, ontsteking of specifieke genetische risicovarianten4,5. Aan de andere kant is er ook bewijs uit diermodellen van neurodegeneratieve ziekten dat microglia ten onrechte levensvatbare neuronen of synapsen kunnen fagocytosen6,7,8. Het mechanisme wordt waarschijnlijk geïnstigeerd door fosfatidylserineweergave van beschadigde neurieten, die direct wordt gevoeld door microgliale fagocytosereceptoren TREM2 of GPR56, of indirect wordt gevoeld door oplosbaar complement C1q dat het fosfatidylserine-verrijkte membraan bedekt, wat leidt tot CR3-gemedieerde fagocytose9,10,11.

In vitro assays van fagocytosefunctie, bijvoorbeeld om de fenotypische impact van een genetische risicovariant in microglia te beoordelen, worden vaak uitgevoerd met behulp van niet-fysiologische ladingen zoals latexparels4. Fluorescerend gelabelde bacteriën en zymosan worden ook gebruikt, die fysiologisch zijn maar niet relevant voor neurodegeneratieve ziekten. Niet-fysiologische fagocytische ladingen kunnen worden gebruikt om defecten in de basismachinerie van fagocytische overspoeling te detecteren, maar slagen er niet in om de eerste “herkenningsstap” in fagocytose van apoptotische neuronen nauwkeurig te modelleren. De grootte, vorm, stijfheid en het type lading dicteren ook de intracellulaire signaalroutes die worden geactiveerd, wat leidt tot verschillende uitkomsten van de activeringstoestand van microglia. E.coli-bacteriën zijn bijvoorbeeld klein en stijf, in tegenstelling tot menselijke cellen, en de lipopolysacchariden op hun oppervlak worden herkend door Toll-like receptor 4 (TLR4) die fagocytose en pro-inflammatoire signaalroutesactiveert 2,12.

In de context van neurodegeneratieve ziektestudies zou een meer relevante fagocytische lading fosfatidylserine-weergave hebben op plasmamembranen van zoogdieren, en idealiter menselijk en neuronaal zijn, om signalen op te nemen die microglia waarschijnlijk zullen tegenkomen. Voor dit fagocytoseprotocol werd de menselijke neuroblastoomcellijn SH-SY5Y gekozen als een neuronmodel dat gemakkelijk te culturen is. Permanente oppervlaktefosfatidylserineweergave werd kunstmatig geïnduceerd door paraformaldehyde, waarvan eerder is aangetoond dat het fosfatidylserine-weergave van bloedplaatjesveroorzaakt 13. Voor het microgliacelmodel werden menselijke iPSC-macrofagen gebruikt, die het ontogenie- en transcriptieprofiel van menselijke microglia nabootsen en fagocytisch competent zijn14,15,16,17. iPSC-macrofagen zijn niet het meest authentieke microgliamodel dat beschikbaar is, ze bootsen bijvoorbeeld geen microgliamorfologie na; men kan het echter vervangen door een meer authentiek monocultuur iPSC-model van microglia indien gewenst, zoals Haenseler et al.15. Menselijke iPSC-modellen hebben de voorkeur boven primaire knaagdiermicroglia voor het bestuderen van neurodegeneratie, vanwege bezorgdheid over de beperkte overlap van de microglia-transcriptionele modules waargenomen in neurodegeneratieve ziekteweefsels van mens versus muis18. De dode SH-SY5Y’s zijn gekleurd met een zuurgevoelige kleurstof die zwak fluoresceert bij neutrale pH en sterker in de fagolysosomen van iPSC-macrofagen na fagocytose. Het gebruik van een zuurgevoelige kleurstof verbetert de nauwkeurigheid van het detecteren van fagocytische gebeurtenissen, met veelzijdigheid voor verschillende uitlezingen van levende en vaste macrofagen19. Dit protocol schetst zowel live-cell time-lapse beeldvorming van fagocytose, als een vaste high-content imaging assay voor fagocytose, met dezelfde celvoorbereidingsstappen voorafgaand aan de uitlezing(Figuur 1).

Figure 1
Figuur 1: Schematisch schema van de methodologie. Omtrek van de fagocytosetest, waarbij de bereiding van de SH-SY5Ys en kleuring van de iPSC-macrofagen parallel wordt uitgevoerd en vervolgens de SH-SY5Ys op de iPSC-macrofagen worden gepipteerd. Ofwel wordt live-cell time-lapse imaging onmiddellijk uitgevoerd, ofwel worden de cellen geïncubeerd bij 37 °C/5% CO2 voor de vereiste duur en gefixeerd voordat microscopie met een hoog gehalte wordt uitgevoerd. PFA: paraformaldehyde, HBM: fenol roodvrije HEPES-gebufferde media, pHr: pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof STP Ester oplossing, PRFMM: fenol roodvrije macrofaag media. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen voor het gebruik van menselijke iPS-cellijnen afgeleid aan de Universiteit van Oxford, Oxford Parkinson’s Disease Centre (Ethics Committee: National Health Service, Health Research Authority, NRES Committee South Central, Berkshire, UK (REC 10/H0505/71)). Menselijke iPSC’s moeten worden gehanteerd in een veiligheidskast van klasse II om de werknemer te beschermen tegen mogelijke onvoorziene agentia. Lokale, nationale en EU-gezondheids- en veiligheidsvoorschriften moeten worden nageleefd. De samenstelling van de celkweekmedia is gedetailleerd in tabel 1en alle materialen zijn opgenomen in de aanvullende tabel met materialen. 1. Celkweek voorafgaand aan het experiment Cultuur-iPSC’s in iPSC-media (tabel 1) in 6-putplaten voorgecoat met een hESC-gekwalificeerde keldermembraanmatrix, subconfluent en bij een laag doorgangsgetal. Onderscheid menselijke iPSC’s met iPSC-macrofaagprecursoren: zaad vier miljoen iPSC in een microwell lage hechting 24-well plaat met 2 ml embryoïde lichaamsmedia (tabel 1) om embryoïde lichaamsvorming te stimuleren en dagelijks 75% mediaveranderingen uit te voeren gedurende 5-6 dagen. Breng embryoïde lichamen over in T175-kolven, ongeveer 150 embryoïde lichamen per kolf, die 20 ml fabrieksmedia bevatten (tabel 1). Voer wekelijks door toevoeging van 10-20 ml fabrieksmedia.OPMERKING: iPSC-macrofaagprecursoren komen na ongeveer 2-3 weken in het supernatant en worden gedurende enkele maanden continu geproduceerd. Voor dit experiment verdient het de voorkeur om cellen te gebruiken vanaf ongeveer 6 weken nadat de differentiatiefabrieken zijn opgezet. Eerder geoogste iPSC-macrofagen kunnen enige proliferatieve capaciteit behouden en zijn minder hechtend, waardoor zelfs zaaien bij een lage celdichtheid wordt voorkomen. Een bovengrens voor fagocytosevermogen is niet vastgesteld. Onderscheid iPSC-macrofaagprecursoren naar iPSC-macrofagen: oogstprecursoren door het vereiste volume supernatant te verwijderen; passeer het door een celzeef van 40 μm om klonten te verwijderen; centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g tot pelletcellen en resuspend in macrofaagmedia (tabel 1). Zaad iPSC-macrofagen bij 20.000-30.000 cellen per put in een met 96 putjes weefselkweek (TC) behandelde microplaat met zwarte putwanden en een optisch heldere bodem, in 100 μL macrofaagmedia per put. Vermijd de randputten en vul deze met PBS; dit is belangrijk om het effect van verdamping op de test te verminderen. Differentieer gedurende 6-10 dagen door incubatie bij 37 °C/5% CO2.OPMERKING: Voor deze test werd de iPSC-lijn BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) gebruikt; een andere iPSC-lijn kan echter worden vervangen. Houd SH-SY5Ys tot subconfluency in T75-kolven met 20 ml SH-SY5Y-media(tabel 1),passaging om de 3-4 dagen. Naam Basismedia Additief, eindconcentratie iPSC-media mTeSR1 – Embryoïde Lichaamsmedia mTeSR1 BMP4, 50 ng/ml VEGF, 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml Fabrieksmedia Xvivo15 GlutaMAX, 2mM Penicilline, 100 eenheden/ml Streptomycine, 100 μg/ml 2-mercaptoethanol, 50 μM IL-3, 25 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml Macrofaag media Xvivo15 GlutaMAX, 2mM Penicilline, 100 eenheden/ml Streptomycine, 100 μg/ml M-CSF, 100 ng/ml SH-SY5Y media Dmem/F12 Foetaal runderserum, 10% Penicilline, 100 eenheden/ml Streptomycine, 100 μg/ml Tabel 1: Mediarecepten. Bestanddelen van celkweekmedia die in het protocol worden gebruikt. Meer informatie over de mediacomponenten is te vinden in de tabel met materialen. 2. Bereiding van dode SH-SY5Ys Dissociëren SH-SY5Ys in een biologische veiligheidskast van klasse II door toevoeging van 4 ml van een celdissociatiebuffer met recombinante trypsine-achtige enzymen en 1,1 mM EDTA (zie materialentabel), die onmiddellijk moeten worden verwijderd, zodat minder dan 1 ml overblijft als een dunne film die de cellen bedekt. Incubeer gedurende 2-3 min bij 37 °C/ 5% CO2. Voeg 10 ml HBSS toe aan de T75-kolf om te spoelen en pipetteer de SH-SY5Ys in een conische centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant en suspensie de cellen opnieuw in 2 ml fenol roodvrije HEPES-gebufferde media (zie Tabel met materialen). Zorg ervoor dat u de pellet zorgvuldig resuspendeert en pipetteer met een pipet van 100-1.000 μL om klonten te breken voordat deze wordt gefixeerd. Fixeer cellen door 2 ml 4% paraformaldehyde (eindconcentratie 2%) aan de buis toe te voegen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met af en toe zachtjes roeren van de buis. Voeg 10 ml HBSS toe aan de buis. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 1.200 x g en suspensie opnieuw in 2 ml fenolroodvrije HEPES-gebufferde media.OPMERKING: Na stap 2.4 kan het vaste SH-SY5Y-preparaat van kwaliteit worden gecontroleerd door kleuring met annexine V-FITC om toegankelijke fosfatidylserine en propidiumjodide te tonen om de celpermeabiliteit te meten met een flowcytometrie-uitlezing. Vergelijk het vaste preparaat met levende SH-SY5Ys verkregen uit stap 2.2. Zie rubriek 7 en aanvullende figuur S1. Opslag van de vaste SH-SY5Ys na stap 2.4 wordt niet aanbevolen omdat dit niet is beoordeeld. 3. Etikettering van dode SH-SY5Ys met pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof Tel na stap 2.4 de cellen en verwijder het totale aantal benodigde cellen in een 2 ml lage eiwitbindende buis. Maak voor elke 1 miljoen SH-SY5Ys het totale volume in de buis van 2 ml op 300-500 μL met fenolrode hepes-gebufferde media. Verwarm de buis kort in een waterbad van 37 °C. Reconstitueer de pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof STP-ester (zie Tabel met materialen) en voeg 12,5 μg kleurstof per miljoen SH-SY5Y toe aan de warme 2 ml buis van cellen. Meng zachtjes door te pipetteren. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht.OPMERKING: De STP-estersoort van de pH-gevoelige kleurstof reageert met primaire amines en daarom mag de etiketteringsbuffer geen vrije amines bevatten. Vanwege de mogelijk beperkte oplosbaarheid in waterige buffers, voegt u de DMSO-opgeloste kleurstof alleen toe aan de waterige buffer, mengt u onmiddellijk en onderzoekt u op tekenen van neerslag (donkere deeltjes onder een lichtmicroscoop). Voeg 1 ml HBSS toe en centrifugeer bij 1200 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en was met 2 ml HBSS. Herhaal de centrifugatie. Gooi het supernatant weg en suspensmeer de cellen opnieuw in fenolrode vrije macrofaagmedia (zie Tabel met materialen), tot een concentratie van 200.000-1,2 miljoen cellen / ml, zodat 50 μL 10.000-60.000 cellen is (d.w.z. 0,5x-3x meer SH-SY5Ys dan iPSC-macrofagen).OPMERKING: Fenolrood in media verhoogt de achtergrondfluorescentie en daarom moet een fenolroodvrij medium worden gebruikt als live-cell imaging moet worden uitgevoerd. Opslag van de gekleurde SH-SY5Ys gedurende meer dan een paar uur wordt niet aanbevolen omdat dit niet is beoordeeld. Houd gekleurde SH-SY5Ys op ijs en bescherm tegen licht. 4. Kleuring van iPSC-macrofagen Bereid in een biologische veiligheidskast een oplossing in macrofaagmedia van een diep rood-fluorescerende, celdoorlatende, succinimidylester-reactieve kleurstof (zie Materialentabel). Voeg Hoechst 33342 toe (zie Materialen tabel). Verwarm de werkoplossing tot 37 °C in een waterbad. Aspirateer het iPSC-macrofaagmedium voorzichtig door het celsupernatant met een meerkanaalspipet in een steriel reservoir te pipetteren. Voeg 70 μL/putje van de in stap 4.1 bereide kleurstofoplossing toe aan iPSC-macrofagen met behulp van een meerkanaalsp pipet. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C/5% CO2. Bereid experimentele behandelingen voor in fenolrode macrofaagmedia. Neem 10 μM cytochalasine D op als negatieve controlebehandeling. Na-incubatie zuigt u het iPSC-macrofaagmedium heel voorzichtig op met een meerkanaalspipet en voegt u 100 μL/put van Hank’s gebufferde zoutoplossing (HBSS) toe om te wassen. Verwijder HBSS onmiddellijk door zachtjes te pipetteren en voeg vervolgens 100 μL media toe ± verbindingen. Incubeer gedurende 10 min-1 uur bij 37 °C/ 5% CO2.OPMERKING: Cytochalasine D is een krachtige actineremmer en blokkeert fagocytose. Voor alle experimentele behandelingen die een langere incubatie vereisen, bijvoorbeeld 24-72 uur, voert u de experimentele behandeling vóór stap 4.1 uit met behulp van 100 μL / put van de behandeling in volledige macrofaagmedia. Volg stappen 4.1-4.3 volgens het protocol, zodat celkleuring wordt uitgevoerd en vervolgens de behandeling opnieuw wordt toegepast in fenolrode macrofaagmedia voor de rest van de fagocytosetest. 5. Beeldvorming fagocytose Hieronder staan twee verschillende fagocytose-uitleesmethoden, kies subsectie 5.1 of 5.2. Live-cell time-lapse beeldvorming Schakel voorafgaand aan fagocytose de live-cell time-lapse imaging microscoop in (zie Tabel met materialen),computer, omgevingskamer en CO2-gas. Open software voor het vastleggen van afbeeldingen. Controleer of de DAPI-, RFP- en CY5-lichtkubussen in de microscoop zijn geïnstalleerd. Klik op Time Lapse | | incuberen Schakel omgevingskamer in en selecteer opwarming tot 37 ° C met CO2-gas, zorg er ook voor dat de luchtvochtigheid wordt gedeselected. Laat de microscoop 30 minuten opwarmen tot 37 °C. Laad tijdens de samengestelde incubatie bij stap 4.3 de iPSC-macrofaagplaat in de microscoop. Klik op Afbeelding | Leg | vast Scheepsexpert. Selecteer Well Plate en kies een 96-well plate type. Schakel op het tabblad Afbeelding het fasekanaal in en pas de grove en fijne scherpstelling aan met de verticale schuifregelaars, zodat de cellen scherp zijn. Pas de verlichtingsniveaus aan met de horizontale schuifregelaar. Klik op de DAPI-, RFP- en CY5-kanalen en pas de verlichtingsniveaus voor elk kanaal aan. Klik op het tabblad Systeem op Uitlijning van vat kalibreren en volg de instructies op het scherm. Klik op Time Lapse | Routines | Maak nieuwe routine. Geef op het eerste scherm van de Wizard Time Lapsede routine een naam. Klik op Volgende. Selecteer op het tweede scherm het 20x-objectief, selecteer Monochrome capture en selecteer de DAPI-, RFP-, CY5- en Phase-kanalen. Selecteer de volgende opties niet: Voorbeeld automatisch zoeken, Fijnfocus automatisch, Z-Stack, Automatische verlichting. Klik op Volgende. Stel op het volgende scherm een baken in het midden van elke put in, waardoor de microscoop kan terugkeren naar dezelfde coördinaten met dezelfde lichtinstellingen voor elk tijdstip. De scherpstel- en lichtinstellingen voor elk baken zijn onafhankelijk. Om een baken in te stellen: sleep de blauwe cirkel naar de locatie op de plaatkaart, gebruik de grove en fijne focus verticale schuifregelaar en klik tevreden op Beacon toevoegen. Beacon-instellingen kunnen later worden bijgewerkt met de knop Geselecteerd bijwerken. Wanneer u klaar bent om de fagocytosetest te starten, verwijdert u de testplaat en plaatst u deze in een biologische veiligheidskast. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 μL SH-SY5Ys per put toe te voegen, aan de zijkant van elke put aan de rand van de vloeistof. Plaats de plaat in de microscoop en wacht ongeveer 30 minuten tot de thermische verschuiving in evenwicht is.OPMERKING: Tijdens de eerste 30 minuten dat de plaat in de microscoop ligt, zal de veranderende temperatuur van de testplaat ervoor zorgen dat de focus verschuift. Als de plaat niet in evenwicht mag worden gebracht, zullen de vastgelegde beelden tijdens de time-lapse onscherp worden. Klik op elk baken en werk de focusinstelling bij. Klik op Volgende. Selecteer op het volgende scherm van de wizard Time-lapsede bestandsindeling TIFF,schakel de optie in om afzonderlijke kanalen opte slaan en schakel de optie Video maken voor elk bakenin en sta de opties hieronder De volgende informatie opnemen als watermerktoe. Klik op Volgende. Stel het aantal scènes in op 1. Klik op Volgende. Stel de duur en intervallen van de time-lapse in, bijvoorbeeld 3 uur en beeldvorming om de 5 minuten. Selecteer Niet slechts één frame vastleggen. Klik op Volgende. Schakel de omgevingskamer in, met een temperatuur van 37 °C en CO2 (vochtigheid is optioneel voor korte experimenten). Klik twee keer op Volgende. Kies een pad om de gegevens op te slaan. Klik op Volgende. Klik op Start om de time-lapse te starten. Imaging met een hoog gehalte aan vaste cellen Gebruik een meerkanaalspipet om 50 μL van de gelabelde SH-SY5Ys per put toe te voegen, voeg toe aan de zijkant van elke put aan de rand van de vloeistof. Incubeer bij 37 °C/ 5% CO2 gedurende 3-5 uur. Na de fagocytose-incubatie, aspirateer voorzichtig celsupernatanten door pipetteren met een meerkanaalspipet en weggooien. Eenmaal wassen met 100 μL PBS. Bevestig de plaat door toevoeging van 100 μL 2% paraformaldehyde, incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer putten en voeg 100 μL PBS toe. Dek af met plaatsealer en folie; bewaren bij 4 °C totdat dit nodig is.OPMERKING: De testplaat kan op deze manier minstens een week worden bewaard zonder significante signaaldegradatie; langere opslag is niet getest. Schakel de beeldmicroscoop met hoog gehalte in (zie Materiaaltabel)en open de software voor het vastleggen van afbeeldingen. Laad de testplaat in de microscoop door op het pictogram Laden boven aan het scherm te klikken. Selecteer het tabblad Instellingen. In de vervolgkeuzemenu’s van het vak linksboven: selecteer het juiste plaattype, selecteer de autofocusoptie Two Peak (Standaard),selecteer het objectief 40x Water, NA1.1,selecteer Confocal-modus en selecteer binning van 1. Spoel de 40x waterstand voor gebruik door via het menu Instellingen. Gebruik in het vak Kanaalselectie het pictogram + om de kanalen DAPI, Alexa 647 en Alexa 568 toe te voegen. Stel deze in op een enkel vlak van 1 μm. Optimaliseer tijd- en energie-instellingen voor de kleurefficiëntie van de testplaat.OPMERKING: Stel als richtlijn DAPI in op 200 ms blootstelling en 100% vermogen, Alexa 647 op 1500 ms blootstelling en 100% vermogen, en Alexa 568 op 100 ms blootstelling en 40% vermogen. Zorg ervoor dat de kanalen niet tegelijkertijd worden gemeten door op Kanaalvolgorde te klikken om de kanalen te scheiden. Onder Navigatie | Lay-out definiëren,de meetputten selecteren en 9-12 velden per put selecteren. Klik tijdens het instellen op een representatief veld op de plaatkaart en controleer elk meetkanaal om de beurt om er zeker van te zijn dat de kleuring aanwezig is en dat de beelden scherp zijn, door de kanaalverschuiving aan te passen. Om gegevens te uploaden naar een server voor analyse op afstand, klikt u op het vak Online vacatures en de relevante schermnaam; dit maakt het automatisch uploaden van de gegevens naar een server mogelijk na beeldvorming. Sla het testprotocol op door op de knop Opslaan te klikken. Klik bovenaan op het tabblad Experiment uitvoeren en geef het experimentplaatje een naam en klik vervolgens op Start. 6. Data-analyse Hieronder staan twee verschillende methoden voor gegevensanalyse, kies subsectie 6.1 als subsectie 5.1 werd gevolgd, of kies subsectie 6.2 als subsectie 5.2 werd gevolgd. Analyse van fagocytosebeelden verkregen door live-cell time-lapse microscoop Download en installeer de aanbevolen open-source software (zie Tabel met materialen). Open de software. Selecteer in het vak Invoermodules de optie Afbeeldingen. Open vanuit WindowsVerkenner de map met gegevens met submappen met de naam Beacon-1, Beacon-2, enz. Selecteer en sleep alle Beacon-mappen naar de keuzelijst Bestand. Selecteer in het vak Invoermodules de optie Metagegevens. Voor Metagegevens extraheren?selecteert u Ja. Kies in het vervolgkeuzemenu naast Methode voor het uitpakkenvan metagegevens de optie Uitpakken uit bestands-/mapnamen. Kies voor de metagegevensbronde optie Mapnaam. Klik op het vergrootglas rechts van de reguliere expressie en typ “.*[\.*](? P.*)$” in het Regex-tekstvak (met uitzondering van de aanhalingstekens). Klik op Verzenden. Voor Metagegevens extraheren uitkiest u Alle afbeeldingen. Klik op Update onderaan het scherm. De beelden worden nu gegroepeerd per baken. Selecteer in het vak Invoermodules de optie NamesAndTypes. Met het volgende proces kunnen afbeeldingen voor elk tijdspunt worden toegewezen aan het juiste fluorescentiekanaal. Wijs een naam toe aan Regels voor overeenkomende afbeeldingen (vervolgkeuzemenu). Selecteer de regelcriteria voor Alle (vervolgkeuzemenu) van de volgende regels. Bestand (vervolgkeuzemenu), Doet (vervolgkeuzemenu), Bevatten (vervolgkeuzemenu), DAPI (tekstvak). Naam om toe te wijzen aan deze afbeeldingen DAPI (tekstvak). Selecteer het afbeeldingstype Grijswaarden Image (vervolgkeuzemenu). Stel het intensiteitsbereik in via Metagegevens van afbeeldingen (vervolgkeuzemenu). Klik onderaan het scherm op Nog een afbeelding toevoegenen herhaal stap 6.1.5. Vervang DAPI door RFP, zodat de RFP-images worden gegroepeerd. Herhaal stap 6.1.6 voor de CY5-kanaalafbeeldingen. Klik op Update onderaan het scherm, de afbeeldingsbestanden worden nu weergegeven in drie kolommen met het label DAPI, RFP en CY5. Selecteer in het vak Invoermodules de optie Groepen. Selecteer bij Wilt u uw afbeeldingen groeperen?de optie Ja. Kies in het vervolgkeuzemenu voor Metagegevenscategoriede optie Beacon. Klik in het vak Analysemodules met de rechtermuisknop op de witruimte om een lijst met alle modules op te roepen. Klik op | toevoegen Beeldverwerking | EnhanceOrSuppressFeatures. Kies DAPI in de eerste vervolgkeuzelijst als invoerafbeelding. Geef de uitvoerafbeelding de naam “DAPIspeckles”. Selecteer het bewerkingstype Verbeteren en het functietype Spikkels , met een functiegrootte van 20 pixels. Kies de snelheid en nauwkeurigheid optie Snel / Zeshoekig. Maak een nieuwe module. voeg | toe | IdentificeerPrimaryObjects. Kies DAPIspeckles in de eerste vervolgkeuzelijst als invoerafbeelding. Noem de primaire objecten “Nuclei”. Voer de typische diameter van objecten in als eenheden van 10 tot 35 pixels; deze parameter kan worden geoptimaliseerd. Kies de drempelstrategie Globaal,de drempelmethode RidlerCalvard,de afvlakkingsmethode Automatischen geef de drempelcorrectiefactor als 12 met onder- en bovengrenzen 0-1. Wijzig de methode om geklonpte objecten te onderscheiden in Vorm, maar laat andere parameters bij hun standaardinstellingen staan.OPMERKING: De iPSC-macrofaagkernen zijn ruwweg gesegmenteerd in stap 6.1.12, na een beeldverwerkingsstap die de diameter verkleint en het contrast van de kernen verhoogt. Het is belangrijk dat alleen de helderste kernen worden geselecteerd, omdat de SH-SY5Ys als zwakkere kernen zullen verschijnen en anders worden aangezien als iPSC-macrofagen. Als u het aandeel kernen dat is geselecteerd, wilt aanpassen, verhoogt of verlaagt u de drempelcorrectiefactor. Vergelijk tijdens de testfase de resulterende kernselectie met een fasebeeld van het baken, waar het gemakkelijk is om onderscheid te maken tussen iPSC-macrofaag en SH-SY5Y met behulp van celmorfologie. Maak een nieuwe module. voeg | toe Beeldverwerking | CorrectIlluminationCalculate. Kies CY5 in de eerste vervolgkeuzelijst als invoerafbeelding. Geef de uitvoerafbeelding de naam “IllumCY5”. Kies bij Selecteer hoe de verlichtingde optie Achtergrond in het vervolgkeuzemenu. Laat de andere parameters op hun standaardinstellingen staan. Maak een nieuwe module. Klik op | toevoegen Beeldverwerking | CorrectIlluminationApply. Kies CY5 in de eerste vervolgkeuzelijst als invoerafbeelding. Geef de uitvoerafbeelding de naam “CorrCY5”. Kies bij De verlichtingselecteren de optie IllumCY5 in het vervolgkeuzemenu. Kies bij Selecteer hoe de verlichting werktde optie Delen in het vervolgkeuzemenu.OPMERKING: Het doel van stap 6.1.13-6.1.14 is om de variatie in achtergrondverlichting van de CY5-afbeeldingen te corrigeren, die anders de juiste celsegmentatie zou verstoren. Maak een nieuwe module. Klik op | toevoegen | IdentificerenSecondaryObjects. Kies CorrCY5 in de eerste vervolgkeuzelijst als invoerafbeelding. Kies Nuclei als invoerobjecten. Geef de secundaire objecten de naam “Mac”. Kies de identificatiemethode als Afstand – B. Selecteer drempelstrategie Globaal, drempelmethode RidlerCalvard, de afvlakkingsmethode Geen afvlakking, en geef de drempelcorrectiefactor als 1 met onder- en bovengrenzen 0-1. Laat andere parameters bij de standaardinstellingen staan.OPMERKING: Deze celsegmentatiestap moet mogelijk worden geoptimaliseerd door de drempelcorrectiefactor aan te passen om celgrenzen te laten groeien of verkleinen. De segmentatie-efficiëntie kan ook worden verbeterd door de sterkte van de iPSC-macrofaagkleuring te verhogen, of de verlichting van de CY5-lichtkubus tijdens het afbeelden. Maak een nieuwe module. Klik op | toevoegen Beeldverwerking | EnhanceOrSuppressFeatures. Kies RFP in de eerste vervolgkeuzelijst als invoerafbeelding. Geef de uitvoerafbeelding de naam “FilteredRFP”. Selecteer het bewerkingstype Verbeteren en het functietype Spikkels , met een functiegrootte van 15 pixels. De functiegrootte kan worden geoptimaliseerd. Kies de snelheid en nauwkeurigheid optie Snel / Zeshoekig. Maak een nieuwe module. Klik op | toevoegen | IdentificeerPrimaryObjects. Kies FilteredRFP in de eerste vervolgkeuzelijst als invoerafbeelding. Geef primaire objecten de naam “pHr”. Voer de typische diameter van objecten in als eenheden van 5-20 pixels. Selecteer de drempelstrategie Handmatigen typ handmatig een drempel, bijvoorbeeld 0,005. Wijzig de methode om klontvormige objecten te onderscheiden in Vorm, maar laat de andere parameters op hun standaardinstellingen staan.OPMERKING: De SH-SY5Ys zijn gesegmenteerd in stap 6.1.17, na een beeldverwerkingsstap die de diameter verkleint en het contrast van de puncta verhoogt. Het is van cruciaal belang om handmatige drempels uit te voeren, omdat de intensiteit van de pH-gevoelige kleurstof in de loop van de tijd toeneemt in fagocytosed deeltjes, en andere drempelstrategieën zullen het aantal pH-gevoelige kleurstof puncta in vroege tijdspunten kunstmatig opblazen. De handmatige drempelwaarde moet worden aangepast voor elke volgende experimentele herhaling, met behulp van de testmodus. Maak een nieuwe module. Klik op | toevoegen | RelateObjects. Selecteer de invoer onderliggende objecten pHr in het vervolgkeuzemenu. Selecteer de mac-invoerobjecten in het vervolgkeuzemenu. Selecteer bij Bereken per bovenliggende middelen voor alle onderliggende metingen?de optie Ja. Bereken geen kind-ouderafstanden(Geen).OPMERKING: Stap 6.1.18 relateert het pH-gevoelige kleurstofsignaal aan de iPSC-macrofagen, waardoor het gemiddelde aantal fagocytosed objecten per iPSC-macrofaag kan worden gemeten. Maak een nieuwe module. Klik op | toevoegen | voor bestandsverwerking ExportToSpreadsheet. Selecteer het kolomscheidingsteken als Tab en voeg een voorvoegsel voor bestandsnamen toe om het bakennummer aan te geven. Kies specifieke metingen voor export, zoals hieronder aangegeven (stappen 6.1.19.1 – 6.1.19.4); andere parameters op hun standaardinstellingen laten staan. Afbeelding | Tel | Selecteer pHr en Mac Afbeelding | Bestandsnaam Afbeelding | Groep Mac | Kinderen | Phr Klik in het vak Uitvoer op Uitvoerinstellingen weergeven. Maak een nieuwe map op het bureaublad voor dit experiment en stel deze in als de standaarduitvoermap. Sla het pijplijnbestand | SaveProject als…. Test en optimaliseer de pijplijn op een representatieve afbeelding door in de linkerbenedenhoek op Testmodus starten te klikken. Het programma selecteert automatisch de eerste afbeelding om te testen en elke stap van de pijplijn kan worden bekeken door op de oogsymbolen te klikken, waardoor de uitvoer zichtbaar wordt, en vervolgens op Uitvoerente klikken . Om het baken te wijzigen dat wordt gebruikt voor het testen, klikt u in de bovenste menubalk op Test | Kies Afbeeldingsgroep. Om de afbeelding (tijdspunt) in een baken te wijzigen, klikt u in de bovenste menubalk op Test | Kies Afbeeldingenset. Parameters die moeten worden geoptimaliseerd, worden in de vorige stappen vermeld. Als u tevreden bent met de pijplijn, klikt u op Testmodus afsluiten en klikt u op de symbolen met het open oog om ze te sluiten. Sla de pijplijn op. Klik op Afbeeldingen analyseren om de volledige beeldanalyse te starten. De tekstbestanden die worden gegenereerd, kunnen worden geopend als een spreadsheet met de juiste spreadsheetsoftware en het bestand met het label “Afbeelding” bevat een rij voor elk afbeeldingstijdpunt, waarbij de kolommen parameters vertegenwoordigen.OPMERKING: Count_Mac en Count_pHr vertegenwoordigen het aantal iPSC-macrofagen en het aantal geïdentificeerde pH-gevoelige objecten in een afbeelding. Gebruik geen Count_pHr gegevens, omdat de telling zwak fluorescerende SH-SY5Ys omvat die niet zijn gefagocytoseerd. De kolom Mean_Mac_Children_pHr_Count neemt het gemiddelde aantal gefagocyteerde pHr-objecten per Mac (stap 6.1.18 RelateObjects) voor een afzonderlijke afbeelding, d.w.z. het individuele tijdspunt van een baken. Rangschik de gegevens zo dat elk baken een afzonderlijke kolom op de spreadsheet is, de afbeeldingen gerangschikt als rijen van chronologische volgorde, met verschillende parameters die verschillende bladen van de spreadsheetwerkmap bezetten. Vermenigvuldig de metingen Mean_Mac_Children_pHr_Count met Count_Mac om de parameter Aantal vlekken per afbeelding te genereren. Bereken de gemiddelde Count_Mac voor elk baken. Deel het aantal vlekken per afbeelding door het gemiddelde Count_Mac voor dat baken en genereer de parameter Aantal vlekken per cel.OPMERKING: Stap 6.1.26 corrigeert eventuele foutieve fluctuaties die kunnen optreden in de iPSC-macrofaagtelling (Count_Mac), door de gegevens te normaliseren naar de gemiddelde iPSC-macrofaagtelling over alle tijdspunten van een baken. Wijs de tijd sinds het begin van fagocytose (in min) toe aan elke afbeeldingsrij. Genereer middelen en standaarddeviatie voor replicatieputten/bakens. Grafiek het aantal vlekken per cel (y-as) tegen de tijd (x-as) om de snelheid van fagocytose te visualiseren. Figuur 2: Celsegmentatie in de fagocytoseanalyse met hoog gehalte. Illustratie om een goede versus slechte segmentatie van een iPSC-macrofaag in de nabijheid van een niet-fagocytosed SH-SY5Y aan te tonen, met een tweede SH-SY5Y volledig fagocytosed. Met beide celtypen grijs weergegeven, wordt de iPSC-macrofaagcelgrens afgebakend door de computeranalyse geschetst (blauw). SH-SY5Ys die worden geteld als fagocytosegebeurtenissen worden groen of rood omlijnd als ze van de analyse worden uitgesloten. De afbeelding in het midden toont een slechte segmentatie; de iPSC-macrofaag heeft een suboptimale afbakening die de niet-fagocytosed SH-SY5Y binnen de celgrens omvat, die zal worden geteld als een fagocytosegebeurtenis. De afbeelding rechts toont een goede segmentatie vanwege strengere parameters die de iPSC-macrofaagcelrand definiëren, wat ertoe leidde dat de niet-gefagocyteerde SH-SY5Y correct werd uitgesloten van de analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Analyse van fagocytosebeelden verkregen met microscoop met een hoog gehalte Log in op de aanbevolen beeldverwerkingssoftware (zie Tabel met materialen). Selecteer de map met de schermnaam en de submap Imaging Run in het menu aan de linkerkant. Klik op het pictogram Beeldanalyse (een scherm met een vergrootglas). Selecteer een representatieve put op de plaatindeling voor het instellen van de analysepijplijn. De eerste analysebouwsteen is input image. Laat de standaardinstellingen voor stackverwerking(Individual Planes)en flatfield-correctie(Geen) staan. Klik op het + teken in de rechterbovenhoek van het blok om de volgende bouwsteen toe te voegen en selecteer Find Nuclei. Stel in Zoek kernenhet kanaal in als DAPI,de ROI-populatie als Geen,de methode van segmentatie als C. Het methodevak bevat een vervolgkeuzemenu waarmee de parameter kan worden geoptimaliseerd, met instellingen voor de gemeenschappelijke drempel (d.w.z. 0,40) en het gebied (d.w.z. >30 μm2). Noem de outputpopulatie “Kernen”. Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Cytoplasma zoeken teselecteren. Stel in Cytoplasmazoeken het kanaal in als Alexa 647 en de methode als B. Het methodevak bevat een vervolgkeuzemenu waarmee de parameter kan worden geoptimaliseerd, met instellingen voor de gemeenschappelijke drempel (d.w.z. 0,45) en de individuele drempel (d.w.z. 0,20). Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Selecteer Populatie selecteren.OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de cytoplasmasegmentatie goed te optimaliseren, zodat het aangrenzende SH-SY5Ys uitsluit die niet zijn gefagocytoseerd, maar fagocytosed lading niet uitsluit (zie figuur 2). Houd in Select Populationde standaardinstellingen aan, namelijk populatienuclei, methode Common Filters, een vinkje voor Randobjecten verwijderenen de uitvoerpopulatie met de naam “Nuclei Selected”. Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Morfologie-eigenschappen berekenen teselecteren. Stel in Morfologie-eigenschappen berekenende populatie in op Kernen geselecteerd,het gebied op Cel, de methode op Standaard. Zorg ervoor dat in het vervolgkeuzemenu gebied en rondheid zijn geselecteerd (μm2). Noem de uitvoerpopulatie “Morfologiecel”. Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Selecteer Populatie selecteren. Kies in Select Population (2)de populatie Nuclei Selecteden de methode Filter op eigenschappen. Selecteer in de vervolgkeuzelijst onder Filter F1de optie Morfologie celgebied [μm2]. Kies > in de vervolgkeuzelijst aan de rechterkant en typ 160 in het vak rechts daarvan. Noem de uitvoerpopulatie “Nuclei Selected 2”. Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Zoek plekken teselecteren.OPMERKING: Met deze stap worden onjuist gesegmenteerde cellen en dode cellen uitgesloten van verdere analyse. Het kan nodig zijn om te optimaliseren door de cut-off grootte te vergroten of te verkleinen. Selecteer in Find Spotshet kanaal Alexa 568, de ROI-populatie Nuclei Selected 2, de ROI-regio Cell, methode Ben geef de uitvoerpopulatie de naam “Spots”. De methode kan indien nodig worden geoptimaliseerd met behulp van het vervolgkeuzemenu, met instellingen voor detectiegevoeligheid (d.w.z. 0,20) en splitsingsgevoeligheid (d.w.z. 0,400). Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Morfologie-eigenschappen berekenen teselecteren. Selecteer in Morfologie-eigenschappen berekenen (2)de populatie vlekken, regiovlekkenen methode Standaard. Zorg ervoor dat in het vervolgkeuzemenu gebied en rondheid zijn geselecteerd (μm2). Geef de uitvoereigenschappen de naam “Morphology Spot”. Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Selecteer Populatie selecteren. Selecteer in Select Population (3)de populatie Spots en de methode Filter op Eigenschappen. Selecteer in de vervolgkeuzelijsten onder Filter F1de optie Spotgebied [px2],>, 20. Selecteer in de vervolgkeuzelijsten onder Filter F2de optie Spotgebied [px2],<, 2500. Selecteer in de vervolgkeuzelijsten onder Filter F3de optie Morfologie Spot Roundness, >, 0.6. Selecteer in de vervolgkeuzelijsten onder Filter F4de optie Intensiteit van locatie tot regio > 2.5. Geef de uitvoerpopulatie de naam “Spots Selected”. Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Selecteer Populatie selecteren.OPMERKING: De geautomatiseerde spotselectie heeft veel kleine fluorescerende stippen gesegmenteerd die het gevolg zijn van autofluorescente lichamen in de iPSC-macrofagen. Deze stap is bedoeld om autofluorescente lichamen uit te filteren door strikte afsnijdingen toe te passen op het gebied, de rondheid en de intensiteit van de vlekken, en kan enige optimalisatie vereisen. Selecteer in Select Population (4)de populatie Nuclei Selected 2 en de methode Filter op Eigenschappen. Selecteer in de vervolgkeuzelijsten onder Filter F1de optie Aantal vlekken, >, 0,5. Noem de outputpopulatie “Spot Positive Cells”. Voeg de volgende bouwsteen toe door op het + symbool te klikken en Resultaten definiëren teselecteren. Selecteer in Resultatendefiniëren de eerste methode als Lijst met uitvoer. De standaardinstelling is het aantal objecten dat voor elke populatie moet worden berekend. Klik op het vervolgkeuzemenu voor Populatie: Kernen geselecteerd 2 en zorg ervoor dat Aantal objecten is aangevinkt en selecteer in het vervolgkeuzemenu Toepassen op alles DE OPTIE ALLES. Voor de populatie Spot Positive Cell, zorg ervoor dat Aantal objecten is aangevinkt. Voor de andere populaties is het niet nodig om parameters te melden. Selecteer de tweede methode als Formule-uitvoeren typ de formule (a/b)*100. Kies als variabele A Spot Positive Cell- Aantal objectenen kies als variabele B Nuclei Selected 2- Number of Objects. Geef de uitvoer de naam “Spot Positive Cells (%)”. Sla de pijplijn op: klik op het pictogram Analyse opslaan op schijf (een diskette met pijl-omlaag). Klik op het pictogram Batchanalyse (een trechter- en tandwielsymbool bovenaan het scherm). Selecteer in de experimentele mappen aan de linkerkant het onbewerkte gegevensbestand, dat het aantal geselecteerde metingen moet bijwerken naar 1. Klik in het gebied Analyseopties op het vervolgkeuzemenu voor Methodeen selecteer Bestaande analyse. Klik op de … naast Scriptbestand en blader naar het opgeslagen analysebestand (achtervoegsel .aas). Klik vervolgens op de groene pijl naast Analyse starten. De voortgang van de analyse kan worden gevolgd door te klikken op Taakstatus (in de rechterbovenhoek van het scherm). Zodra de analyse is voltooid, klikt u op het tabblad Exporteren,kiest u de experimentmap en selecteert u een doelmap. Laat de standaardinstellingen staan, waarmee gegevens worden geëxporteerd, maar geen TIFF-afbeeldingen, en start de export. Open het gedownloade bestand als een spreadsheet in een geschikte spreadsheetsoftware. De putten zijn gerangschikt in rijen en de parameters in kolommen. Selecteer de gegevens in kolommen met het label Spot Positive Cells (%), Nuclei Selected 2 – Number of Spots – Mean per Well en Nuclei Selected 2 – Total Spot Area – Mean per Well, en kopieer deze naar nieuwe spreadsheets voor elke parameter. Bereken het parametergemiddelde voor replicatieputten van elke voorwaarde en maak een grafiek van toepassing. 7. Kwaliteitscontroletest voor homogeniteit van vaste SH-SY5Ys Verzamel een aliquot van levende SH-SY5Ys uit stap 2.2 en resuspend in de annexine bindingsbuffer uit een kit voor annexine V-FITC-kleuring (zie Materiaaltabel) in een concentratie van ongeveer 200.000 cellen per ml. Verzamel een aliquot van vaste SH-SY5Ys uit stap 2.4 en resuspend in annexine binding buffer in een concentratie van ongeveer 200.000 cellen per ml. Bereid twee reageerbuizen voor met 5 μL annexine V-FITC en 5 μL propidiumjodide (zie Materiaaltabel). Voeg 500 μL levende SH-SY5Ys toe aan de ene buis en 500 μL vaste SH-SY5Ys aan de andere. Bereid drie controlebuizen voor: één met 5 μL annexine V-FITC, één met 5 μL propidiumjodide en één buis leeg. Meng een 1:1 verhouding van live en vaste SH-SY5Ys en voeg hiervan 500 μL toe aan elke regelbuis. Meng buizen voorzichtig door te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, beschermd tegen het licht. Onmiddellijk meten op een flowcytometer (Ex = 488 nm; Em = 530 nm) met behulp van FITC-signaaldetector (meestal FL1) voor annexine V-FITC en de fycoerythrin-emissiesignaaldetector (meestal FL2) voor propidiumjodide. Gebruik flowcytometrie-analysesoftware om puntplots van FITC vs PI-signaal weer te geven en gebruik een rechthoekig gating-gereedschap om de dubbelnegatieve populatie te selecteren. Geef binnen de dubbelnegatieve populatie FSC versus SSC weer en gebruik een veelhoekige gatingtool om een uitsluitingspoort te creëren rond de populatie met zeer lage FSC en SSC, die is geclassificeerd als puin en daarom is uitgesloten van verdere analyse. Geef de resterende gebeurtenissen weer als FITC vs PI-signaal en gebruik de enkelgekleurde en niet-gekleurde besturingselementen om een kwadrantpoort in te stellen voor FITC-/PI-, FITC+/PI-, FITC -/PI+ en FITC+/PI+- gebeurtenissen.OPMERKING: Vermijd ruwe hantering, vortexing of lange incubaties met levende SH-SY5Ys, die kunstmatig fosfatidylserine-weergave kunnen induceren. Ga zonder vertraging verder met flowcytometrie. Een wenselijke uitkomst is dat het aandeel FITC-/PI-gebeurtenissen <5% is in de vaste SH-SY5Y's. Representatieve resultaten zijn weergegeven in aanvullende figuur S1.

Representative Results

Live-cell time-lapse beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van het eerder geschetste protocol, met wild-type iPSC-macrofagen gezaaid op 20.000 cellen per put. Verschillende hoeveelheden SH-SY5Ys werden toegepast (10.000-30.000 per put zoals geschat op basis van het celgetal in stap 3.1), en de fagocytoseremmer cytochalasine D werd voorgeïncubeerd (1 uur) met enkele putten, die fungocytose voor elke hoeveelheid SH-SY5Ys fungocytose. Beeldvorming begon 40 minuten na de toevoeging van SH-SY5Ys en beelden werden vastgelegd met intervallen van 5 minuten voor de volgende 3 uur (gegevens omvatten de initiële vertraging van 40 minuten). Een representatieve time-lapse video is opgenomen in de aanvullende gegevensen geanalyseerd kwantitatieve gegevens weergegeven in figuur 3. Met de hoeveelheid van 10.000 SH-SY5Ys per put nam het aantal fagocytosed deeltjes (vlekken) per cel lineair toe met de tijd en werd het met ongeveer 50% geremd door cytochalasine D. De remming door cytochalasine D was zwakker dan verwacht, hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door onvoldoende technische of biologische replicaties, aangezien slechts één put per aandoening in beeld werd gesteld met drie beeldvelden. Met hogere hoeveelheden SH-SY5Ys per put (20.000 en 30.000) vertoonde fagocytose een slechte lineariteit, waarschijnlijk als gevolg van slechte segmentatie van iPSC-macrofagen en SH-SY5Ys in een drukker gezichtsveld. Fixed-cell high-content imaging werd uitgevoerd met behulp van het eerder geschetste protocol, met wild-type iPSC-macrofagen bij 20.000 cellen per put, verschillende hoeveelheden SH-SY5Ys (10.000-80.000 per put), en de testplaat werd na 5 uur gefixeerd en in beeld gebracht. Een representatief beeld van fagocytose wordt weergegeven in figuur 4Aen de geanalyseerde gegevens in figuur 4B17. Het verhogen van de hoeveelheid SH-SY5Ys resulteerde in een hoger aantal fagocytosed deeltjes (vlekken) per cel; een verdubbeling van de SH-SY5Y-hoeveelheid leidt echter slechts tot een toename van 1,5x van het aantal vlekken per cel. Dit geeft aan dat de geteste hoeveelheden niet snelheidsbeperkend zijn voor fagocytose. Vervolgens werd de high-content imaging fagocytose assay gevalideerd met behulp van verschillende remmers van fagocytose (Figuur 4C)17. De actinepolymerisatieremmers cytochalasine D en jasplakinolide remden fagocytose significant met respectievelijk 91% en 90% wanneer ze gedurende 1 uur voorafgaand aan fagocytose werden geprecubeerd. De robuuste Z’ van de test wanneer cytochalasine D of jasplakinolide als negatieve controle worden gebruikt, wordt berekend als 0,7 en 0,8, respectievelijk20. De lysosoomverzuringsremmer bafilomycine A1 verminderde fagocytose aanzienlijk met 31%, wanneer geïncubeerd 1 uur voorafgaand aan fagocytose. Het zwakkere effect van de lysosoomverzuringsremmer versus actineremmers suggereert dat detectie van de geïnternaliseerde lading mogelijk geen volledige verzuring van het fagosoom vereist. Recombinant annexine V werd gebruikt als een controle om specifiek fosfatidylserine blootgesteld aan het oppervlak van SH-SY5Ys te blokkeren, waardoor fagocytische receptoren geen toegang krijgt tot het ligand, een belangrijk “eet-me” -signaal. Toevoeging van recombinant annexine V verminderde fagocytose aanzienlijk met 30%, wanneer toegevoegd aan putten onmiddellijk vóór SH-SY5Y-toevoeging. Vaste SH-SY5Y’s werden bevestigd om fosfatidylserine bloot te leggen, met behulp van een fluorescerende annexine V-sonde, terwijl levende SH-SY5Y’s negatief waren voor annexine V-kleuring(figuur 4D). De microgliale fagocytosereceptor TREM2 is eerder belangrijk gebleken voor fagocytose van apoptotische neuronen21. De R47H-mutatie van TREM2 is een risicogen voor het late begin van de ziekte van Alzheimer en wordt verondersteld ligandbinding van TREM223te verminderen. Met het oog op de beoordeling van de fagocytische functie van R47H TREM2 en TREM2 KO, werd de fagocytosetest met een vast celgehalte uitgevoerd met behulp van isogene iPSC-macrofaaglijnen met WT / R47H / KO TREM217. Verschillende lengtes van fagocytoseduur van 1 tot 5 uur werden getest, met behulp van een gespreide toevoeging van fagocytische lading (40.000 SH-SY5Ys). Het resulterende signaal neemt lineair toe tot 4 uur en vlakt iets af bij 5 uur (figuur 5)17. Verminderde fagocytosesnelheid en -capaciteit (% spotpositieve cellen) was duidelijk in de TREM2 KO in vergelijking met WT, terwijl de R47H TREM2-mutant geen veranderde fagocytose vertoonde. Het fagocytische defect in TREM2 KO-cellen wordt niet gefenocopieerd door de R47H TREM2-mutatie, schijnbaar omdat de TREM2-functie voldoende is om normale fagocytose te ondersteunen. Figuur 3: Voorbeeldgegevens voor live-cell time-lapse fagocytose assay. Opname van dode SH-SY5Ys door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) afgebeeld met intervallen van 5 minuten gedurende 3 uur. De tijden die op de grafiek worden weergegeven, zijn vanaf het begin van fagocytose, inclusief de eerste 40 minuten zonder meting. Het gemiddelde aantal vlekken per cel uit drie repliceerputten wordt uitgezet. Fagocytose van 10.000 SH-SY5Ys wordt geremd met 10 μM cytochalasine D met 1 uur voorbehandeling, terwijl hogere hoeveelheden SH-SY5Ys (20.000 en 30.000) suboptimale kwantificering van fagocytose hebben. Gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), N = 1 experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Optimalisatie en validatie van fagocytosetest met een vast celgehalte met een hoog gehalte. (A) Representatief microscopiebeeld met hoog gehalte van SH-SY5Ys fagocytosed door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Een 3 uur tijdspunt met 40.000 SH-SY5Ys wordt getoond. Fluorescentiekanalen worden samengevoegd, waarbij iPSC-macrofaagvlek als rood wordt weergegeven, kernen als blauw en SH-SY5Ys als geel. Het inzetpaneel is een gedeelte van het beeld dat 3x wordt vergroot. (B) Het aantal vlekken per cel van fagocytosed dode SH-SY5Ys na 5 uur, met behulp van verschillende hoeveelheden ladingtoevoeging aan wild-type iPSC-macrofagen. Gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), voor N = 3 oogsten. (C)Fagocytose (3 h) wordt geremd met 10 μM cytochalasine D (Cyt), 1 μM bafilomycine A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (met 1 uur voorbehandeling; Jas) en 13 μg/ml recombinant annexine V (gelijktijdig toegevoegd aan de dode SH-SY5Ys; Ann). iPSC-macrofagen zonder toegevoegde SH-SY5Y’s werden gebruikt als een negatieve controle (-ve), en de positieve (+ve) controle is onbehandelde iPSC-macrofagen met SH-SY5Ys toegevoegd. Gegevens werden genormaliseerd tot het gemiddelde voor de herhaling van het experiment. Betekent ± SEM, voor N = 3-6 oogsten en met twee wild-type cellijnen (SFC840-03-03, de karakterisering van deze lijn wordt beschreven in (Fernandes et al.21 en BIONi010-C). 1-weg ANOVA met Dunnett’s post-hoc test, vergelijkingen met onbehandelde cellen. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Vers gefixeerde SH-SY5Ys kleuren gelijkmatig voor fosfatidylserineweergave (annexine V-FITC) en hebben een beperkte celdoorlaatbaarheid (propidiumjodide). Levende SH-SY5Y’s vlekken niet op annexine V-FITC of propidiumjodide, behalve focale kleuring die aanwezig is op de weinige dode cellen in cultuur. Cijfers zijn gereproduceerd met toestemming van Alzheimer’s Research & Therapy17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Fagocytose is verminderd in TREM2 KO maar niet in R47H TREM2 iPSC-macrofagen. Fagocytosetest met hoog gehalte uitgevoerd met 40.000 SH-SY5Ys per put met gespreide toevoegingen. Voor de parameters werden middelen gekwantificeerd: aantal vlekken per cel, som van de spotgebieden(μm 2) per cel en percentage cellen dat fagocytosed deeltjes per veld bevat. Gegevens werden genormaliseerd tot gemiddelde voor elk genotype per experiment. Gemiddelde ± SEM, voor N = 3 oogsten. Herhaalde metingen 2-weg ANOVA, Dunnett’s post-hoc test, paarsgewijze vergelijkingen met de WT voor elke keer: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Cijfers zijn gereproduceerd met toestemming van Alzheimer's Research & Therapy17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur S1: Voorbeeld QC voor SH-SY5Ys voorbereiding. Gedissocieerde SH-SY5Y’s werden gedurende 10 minuten gefixeerd met 0% (levende cellen), 1% en 2% paraformaldehyde (PFA) en vervolgens gewassen. Cellen werden gekleurd met annexine V-FITC en propidiumjodide (PI) en onmiddellijk gemeten met flowcytometrie. Kleurdichtheid dot plots werden gemaakt in flowcytometrie analyse software, met behulp van de single-stained en unstained controles om een kwadrant poort te plaatsen. Kwadranten worden geannoteerd met het percentage gebeurtenissen binnen dat kwadrant. Levende cellen bevinden zich voornamelijk in Q4 en vaste cellen bevinden zich voornamelijk in Q2. Q1 = annexine V-/PI-, Q2 = annexine V+/PI+, Q3 = annexine V+/PI-, Q4 = annexine V-/PI- (levende cellen). Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende video: Live-cell time-lapse fagocytose. Representatieve time-lapse video van SH-SY5Ys fagocytosed door wild-type iPSC-macrofagen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Er werden elke 5 minuten gedurende 3 uur foto’s gemaakt. Video wordt bijgesneden en draait met 3 frames per seconde, waarbij de laatste 1,5 uur van de test wordt weergegeven. De zuurgevoelige kleurstof-gekleurde SH-SY5Ys worden weergegeven in rood, signaalintensiteit neemt toe met fagosoomverzuring. Celkernen gekleurd met Hoechst 33342 zijn blauw weergegeven. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

Microglia hebben belangrijke functies die de initiatie en progressie van neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden, waaronder fagocytose van apoptotische neuronen. Verminderde microgliale fagocytose en ongepaste fagocytose van synapsen zijn beide in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten, hoewel de onderliggende mechanismen en causaliteit niet goed worden begrepen4,23. Dit artikel schetst een fagocytose-assay om fagocytose van apoptotische cellen te meten door iPSC-macrofagen, met ofwel een live-cell time-lapse imaging-uitlezing of fixed-cell high-content microscopie, of een combinatie van beide op een enkele assay. Deze veelzijdigheid betekent dat de test kan worden gebruikt om individuele fagocytische gebeurtenissen in de loop van de tijd in een paar putten te bestuderen of kan worden gebruikt voor screening met een hoog gehalte aan meerdere aandoeningen of behandelingen. Omdat de test met een hoog gehalte op één tijdstip is gefixeerd, kunnen meerdere testplaten tegelijkertijd worden bereid. De test met een hoog gehalte heeft potentieel nut voor het karakteriseren van macrofagen / microglia met ziekte-geassocieerde genetische varianten of het screenen van kleine molecuulremmers op veranderingen in fagocytose. De test kan ook gemakkelijk worden aangepast om fagocytose van andere microgliamodellen of mogelijk astrocyten te bestuderen. De fagocytosetest kan mogelijk worden gemultixt met levendcellige beeldvormingsvlekken, bijvoorbeeld mitochondriën, calcium of ROS-indicatoren, en post-fixatie immunofluorescente kleuring voor eiwitten-van-belang kan worden uitgevoerd. In vergelijking met bestaande fagocytose-assays die apoptotische neuronale cellen gebruiken, zijn de belangrijkste voordelen die dit protocol biedt dat de bereiding van de fagocytische lading relatief eenvoudig en snel is en resulteert in een uniform product. Andere assays induceren apoptose van neuronen of SH-SY5Ys met S-nitroso-L-cysteïne gedurende 2 h25,okadaïnezuur gedurende 3 h22,staurosporine voor 4-16 h26,27,28,29 of UV-bestraling gedurende 24 h30,en kunnen resulteren in cellen in verschillende stadia van apoptose. Bovendien zijn de live-cell imaging en high-content imaging readouts niet eerder beschreven, voor zover de auteurs weten. De belangrijkste beperking van het gebruik van paraformaldehyde-fixatie om de fagocytische lading te bereiden, is dat het het proces van apoptose niet volledig samenvat, omdat fixatie voorkomt dat de cellen zich splitsen in apoptotische lichamen, die waarschijnlijk sneller worden gefagocytoseerd vanwege hun kleinere omvang. Het is niet bekend welk effect fixatie heeft op de secretie van nucleotide “vind me” -signalen (bijv. ATP, UDP) van de doelcel die fagocyten aantrekken. Net als bij apoptotische cellen vertonen de vaste SH-SY5Ys enige membraandoorlaatbaarheid voor propidiumjodide. Membraandoorlaatbaarheid wordt geassocieerd met het vrijkomen van “vind mij” -signalen; dit is echter niet onderzocht in de vaste SH-SY5Ys, en als het nucleotide te snel vrijkomt, zouden ze worden weggespoeld voordat SH-SY5Ys worden toegevoegd aan de iPSC-macrofagen.

De eerste kritische stap in het protocol is het kleuren van dode SH-SY5Y’s met een STP-ester van een pH-gevoelige rode fluorescerende kleurstof. Deze kleurstof reageert snel en covalent met vrije primaire amines op het oppervlak van de dode SH-SY5Ys. De duur van de kleuring hoeft niet te worden geoptimaliseerd; er moet echter voorzichtig worden omgegaan met het hanteren van de kleurstof voordat deze wordt gelabeld. De etiketteringsreactie mag niet worden uitgevoerd in buffers die vrije amines bevatten. Bovendien bestaat er een risico op neerslag als de DMSO-voorraad wordt verdund in een koude waterige buffer of bij een hoge eindconcentratie. Precipitaten verschijnen als dichte donkere objecten onder de microscoop. Bovendien kleeft de pH-gevoelige kleurstofoplossing aan gewone plastic centrifugebuizen en spoelt langzaam af; daarom worden laagbindende buizen aanbevolen voor de etiketteringsstap. Het gebruik van een pH-gevoelige kleurstof, in plaats van een permanent fluorescerende kleurstof, helpt bij de identificatie van overspoelde deeltjes, versus deeltjes die het plasmamembraan omsluiten. Aangezien er enige fluorescentie is bij neutrale pH, moet de dichtheid van fagocytische lading en iPSC-macrofagen laag genoeg worden gehouden voor nauwkeurige segmentatie, hoewel hoog genoeg om talrijke fagocytische gebeurtenissen te vangen. Microscopie met een hoog gehalte was in staat om fagocytose met een gemiddelde dichtheid van lading in de put nauwkeurig te identificeren (meer dan 2 SH-SY5Ys per iPSC-macrofaag). Omgekeerd, vanwege de zwakkere gevoeligheid van de microscoop in het dieprode spectrum, was segmentatie van iPSC-macrofagen in de live-cell time-lapse beeldvormingsgegevens minder zeker en was het noodzakelijk om een zeer lage dichtheid van lading te gebruiken om de kans op valse positieven te verminderen (1 SH-SY5Y voor elke twee iPSC-macrofagen). Validatie van de juiste segmentatie en ladingsdichtheid moet worden uitgevoerd met vergelijkingen tussen onbehandelde en cytochalasine D-behandelde putten. In een goed geoptimaliseerde test zou cytochalasine D het gemiddelde aantal vlekken per cel met 90% moeten verminderen ten opzichte van onbehandelde monsters.

Een andere cruciale stap in het protocol is de iPSC-macrofaagkleuring, waarmee de cel kan worden geïdentificeerd en gesegmenteerd in beeldanalyse, zodat externe SH-SY5Ys worden uitgesloten van de telling. De aanbevolen kleurstof is celpermeant, omgezet in een onoplosbaar fluorescerend product in het cytoplasma, fixeerbaar en niet-toxisch (zie Tabel met materialen). De kleuringsstap werd geoptimaliseerd voor het gebruik van iPSC-macrofagen met de high-content imaging fagocytose-test, en we stellen voor dat deze opnieuw moet worden geoptimaliseerd als andere celtypen worden gebruikt. De duur van celkleuring kan worden verhoogd om de afzetting van het onoplosbare fluorescerende product in cellen te verbeteren. Als de kleurstofconcentratie is geoptimaliseerd, moet ervoor worden gezorgd dat toxische niveaus van het organische oplosmiddel worden vermeden.

De derde kritische factor voor het succes van de assay is de data-analyse. De verstrekte analysepijplijnen zijn bedoeld als leidraad in plaats van prescriptief, omdat verschillen in kleuringsintensiteit of celmorfologie de effectiviteit van segmentatie van de pijpleidingen zoals geschreven kunnen verminderen. Er zullen daarom enkele optimalisaties nodig zijn, waarbij de pijplijn wordt getest op de juiste positieve en negatieve controles, en de parameters die moeten worden geoptimaliseerd, worden aangegeven in de protocoltekst. Negatieve controles moeten een aandoening omvatten waarbij iPSC-macrofagen worden voorbehandeld met een krachtige fagocytoseremmer zoals cytochalasine D vóór toevoeging van SH-SY5Ys. Een andere mogelijke negatieve controle is de toevoeging van de SH-SY5Ys aan eerder onbehandelde putten van iPSC-macrofagen aan het einde van de test, 10 minuten voor de fixatie, waardoor enige bezinking van de lading mogelijk is, maar te kort is voor een merkbare hoeveelheid fagocytose. Een fagocytosegebeurtenis wordt gedefinieerd als een rood-fluorescerend object binnen de grenzen van een iPSC-macrofaag, gedefinieerd door het softwarealgoritme met behulp van het dieprode fluorescentiekanaal. Als de segmentatie van de cellen slecht is(figuur 2),kunnen veel niet-gefagocyteerde SH-SY5Y’s in de nabijheid van iPSC-macrofagen ten onrechte in de analyse worden opgenomen, d.w.z. vals-positieven. De belangrijkste factor bij het bereiken van een goede segmentatie is een strikte afbakening van de iPSC-macrofagen. Segmentatie voor beide analyses is geautomatiseerd, dus het is niet mogelijk om perfecte segmentatie voor elke cel te verkrijgen; er kunnen echter enkele parameters worden aangepast om de segmentatie optimaler te maken, met behulp van enkele testafbeeldingen als referentie. De cytochalasine D-controle is belangrijk voor het beoordelen van optimale segmentatie omdat een groot aantal fagocytische gebeurtenissen die in deze aandoening worden gedetecteerd, aangeeft dat de segmentatie suboptimaal is. Optimalisatie van de data-analysepijplijn moet idealiter worden herhaald totdat het aantal fagocytische gebeurtenissen per cel 80% -90% lager is in de cytochalasine D-conditie versus geen remmer.

De problemen met de fagocytosetest die het meest waarschijnlijk optreden zijn: (1) zwakke pH-gevoelige fluorescentie in positieve controles, (2) schaarse of ongelijke verdeling van macrofagen aan het einde van de test, of (3) hoge aantallen vals-positieven in de analyse van niet-fagocytosed SH-SY5Ys. Het oplossen van problemen met zwakke pH-gevoelige fluorescentie moet eerst controleren of kleuring van de SH-SY5Ys resulteerde in een celkorrel met een sterke magentakleur. Als de kleur zwak is, zorg er dan voor dat een verse kleurstofvoorraad wordt gebruikt, zorg ervoor dat de etiketteringsbuffer aminevrij is, voeg een extra was toe aan de SH-SY5Ys voor het kleuren, controleer of het juiste aantal SH-SY5Ys is gekleurd, zorg ervoor dat er geen kleurstofprecipitaten zichtbaar zijn en optimaliseer de etiketteringsconcentratie van de kleurstof. Als de SH-SY5Ys sterk gekleurd zijn, controleer dan of de concentratie die aan de testplaat is toegevoegd correct is en zorg ervoor dat de iPSC-macrofagen gezond en niet te oud zijn. Het tweede type probleem, ongelijke macrofaagverdeling, kan het gevolg zijn van verlies van cellen tijdens het pipetteren en er moeten stappen worden ondernomen om de pipetteerkrachten die door de cellen worden ervaren te verminderen, waarbij smalle boringspunten worden vermeden. Als het probleem zich blijft, verminder dan de incubatietijd van het laden van de iPSC-macrofagen met celpermeante kleurstof. Het derde probleem, met betrekking tot het foutief opnemen van niet-fagocytosed deeltjes in de analyse, geeft aan dat meer optimalisatie van de analysepijplijn nodig is. Probleemoplossing moet zich in de eerste plaats richten op celsegmentatie en of de software aangrenzende objecten opneemt. Specifieke parameters die kunnen worden aangepast, worden voorgesteld in de opmerkingen onder de relevante stappen (stappen 6.1.11-6.1.15 voor de live-cell time-lapse-analyse en stappen 6.2.4-6.2.8 voor de analyse met een hoog gehalte). Als de celsegmentatie niet verder kan worden verbeterd, heeft de analyse met een hoog gehalte een extra stap (stap 6.2.8) die onjuist gesegmenteerde iPSC-macrofagen uitsluit. Bovendien kan de module die geaccepteerde vlekken van pH-gevoelige fluorescentie binnen iPSC-macrofagen filtert, worden geoptimaliseerd, waardoor de drempelintensiteit van geaccepteerde objecten wordt verhoogd, wat zou moeten helpen om niet-fagocytosed SH-SY5Ys uit te sluiten (stap 6.1.17 voor de live-cell time-lapse-analyse en stap 6.2.11 voor de high-content analyse).

We ontwikkelden twee soorten microscopie-uitlezing voor de fagocytose-test die elk voordelen en beperkingen hebben. Live-cell time-lapse beeldvorming heeft de voordelen van het verstrekken van extra informatie over fagocytosekinetiek en is breder beschikbaar dan high-content beeldvormingsplatforms. De aanbevolen open-source software is agnostisch voor de microscoopbron en kan worden gebruikt met elke fluorescerende microscoop van goede kwaliteit, met of zonder live-cell time-lapse-mogelijkheid. De belangrijkste beperking van de live-cell imaging is beperkte gevoeligheid en optica, die het uitdagender maken om goede segmentatie van iPSC-macrofagen te detecteren en uit te voeren. Deze beperking kan worden verzacht door de duur van iPSC-macrofaagkleuring te verhogen of door over te schakelen naar een gevoeligere microscoop, indien beschikbaar. De high-content imaging fagocytose assay is de aanbevolen uitlezing als er een high-content imaging systeem beschikbaar is. Beeldvormingssystemen met een hoog gehalte maken een hogere doorvoer en betrouwbaardere gegevens mogelijk, waardoor deze test kan worden gebruikt voor screening, waarbij een robuuste Z ‘ van ≥ 0,7 zou worden verwacht voor het “aantal vlekken per cel” output20. In vergelijking met de live-cell time-lapse-methode heeft de high-content microscopie-uitlezing een hogere gevoeligheid, een hogere mate van automatisering en snelheid, kunnen meer putten en beeldvormende velden worden verwerkt en worden confocale beelden met een hoge resolutie geproduceerd. Celsegmentatie is effectiever met goede beelden en segmentatie wordt bovendien geholpen door de software voor beeldvormingsanalyse met een hoog gehalte die meer celsegmentatiemethoden biedt die geschikt zijn voor zeer onregelmatig gevormde cellen. De high-content imaging analyse software berekende ook meer parameters van fagocytose, vergeleken met de open-source software, zoals het percentage fagocytische cellen. De belangrijkste beperking van de fagocytosetest met een hoog gehalte is er een van kosten en toegankelijkheid van het beeldvormingssysteem en de analysesoftware.

Kortom, de kwantitatieve fagocytose-assay die in dit artikel wordt gepresenteerd, is een nuttig hulpmiddel voor het modelleren van microglia fagocytose van dode neuronen in vitro. De microglia worden gemodelleerd door iPSC-macrofagen en de dode neuronen worden gemodelleerd door paraformaldehyde-gefixeerde SH-SY5Ys. Hoewel niet de meest authentieke microglia en dode / apoptotische neuronmodellen gepubliceerd, zijn deze gemakkelijk te bereiden en schaalbaar. De test zelf is zeer veelzijdig, met twee soorten beelduitlezing gedetailleerd, en het heeft potentieel om te worden aangepast voor gebruik met verschillende microglia / macrofaag monocultuurmodellen, of een ander celtype om als de fagocytische lading te fungeren. De high-content imaging-uitlezing is voordelig voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens en kan worden opgeschaald om kleine molecuulmodulatoren van fagocytose te testen, of genetische varianten in de iPSC-macrofagen te screenen. Omdat beeldvormingssystemen met een hoog gehalte echter duur en gegevensrijk zijn, is een alternatieve beelduitlezing in het protocol opgenomen met behulp van een live-cell time-lapse-microscoop, die indien nodig kan worden vervangen door een conventionele fluorescentiemicroscoop van goede kwaliteit.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Dr. Val Millar en Dr. Sohaib Nizami voor hun hulp bij microscopie met een hoog gehalte, en Dr. Daniel Ebner voor toegang tot de microscopen met een hoog gehalte. Verder bedanken de auteurs Dr. Emma Mead voor het advies over de ontwikkeling van testen en mevrouw Cathy Browne voor iPSC-ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, subsidiereferentie ARUK-2020DDI-OX), met aanvullende ondersteuning voor de James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) van de Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award van Parkinson’s UK (J-1403); het MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 en Momentum MC_PC_16034 Awards.

Materials

15 mL conical centrifuge tube Falcon 352096 For centrifugation of cells
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes
2-mercaptoethanol 50 mM Gibco 31350010 Component of Factory media
4% paraformaldehyde in PBS Alfa Aesar J61899 For fixation of cells
6-well plate, tissue culture treated
AggreWell-800 24-well plate STEMCELL Technologies 34815 Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit Abcam ab14085 Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.
Automated cell counter
Benchtop centrifuge
Benchtop microcentrifuge
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid Perkin Elmer 6055302 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay
CellProfiler software Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.
CellTracker Deep Red dye Thermo Fisher C34565 Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. 
Class 2 laminar air flow safety cabinet
CO2 gas bottle Accessory for EVOS FL Auto
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2
Columbus Image Data Storage and Analysis System Perkin Elmer Columbus Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.
Cytochalasin D Cayman 11330 Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM.
DMEM/F12 Gibco 11320074 Component of SH-SY5Y media
DMSO Sigma D8418 Solvent for CellTracker and pHrodo dyes
EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher AMF4300 Live-cell time-lapse imaging microscope
EVOS Light Cube CY5 Thermo Fisher AMEP4656 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube DAPI Thermo Fisher AMEP4650 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube RFP Thermo Fisher AMEP4652 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Onstage Incubator Thermo Fisher AMC1000 Accessory for EVOS FL Auto
Fetal Bovine Serum Sigma F4135 Component of SH-SY5Y media
Flow cytometer
Flow cytometry analysis software
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Invitrogen A1413302 hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture
GlutaMAX Supplement Gibco 35050-038 Component of both Factory and Macrophage media
HBSS Lonza BE 10-547F Hank’s balanced salt solution for washing steps
Human recombinant BMP4 Gibco PHC9534 Component of Embryoid Body media
Human recombinant IL-3 Gibco PHC0033 Component of both Factory and Macrophage media
Human recombinant SCF Miltenyi Biotech 130-096-695 Component of Embryoid Body media
Human recombinant VEGF Gibco PHC9394 Component of Embryoid Body media
Live Cell Imaging Solution Thermo Fisher A14291DJ Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys
Low protein binding 2 mL tubes Eppendorf 30108.132 For staining SH-SY5Ys
M-CSF Thermo Fisher PHC9501 Component of both Factory and Macrophage media
mTeSR1 Medium STEMCELL Technologies 85850 iPSC media
Multichannel 20-200 uL pipette For liquid handling of 96-well plate
NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher R37605 Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.
Opera Phenix High-Content Screening System Perkin Elmer HH14000000 High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media
pHrodo iFL Red STP-Ester Thermo Fisher P36011 pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. 
Serological pipette filler
T175 flask, tissue culture treated Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories"
T75 flask Vessel for SH-SY5Y culture
Transparent plate sealers Greiner Bio-One 676001 For assay plate storage and transportation
TrypLE Express (1X), no phenol red Gibco 12604013 Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.
Water bath, set to 37°C
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red Lonza BE04-418F Component of Factory and Macrophage media
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red Lonza 04-744Q Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).
  2. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).
  3. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  4. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease. Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).
  5. Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer’s disease: potential therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).
  6. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  7. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).
  8. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  9. Scott-Hewitt, N., et al. Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).
  10. Li, T., et al. A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding. The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).
  11. Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
  12. Skjesol, A., et al. The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2. PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).
  13. Wong, K., Li, X., Ma, Y. Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets. Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).
  14. van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), (2013).
  15. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  16. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  17. Hall-Roberts, H., et al. TREM2 Alzheimer’s variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages. Alzheimer’s Research & Therapy. 12, 151 (2020).
  18. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer’s disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  19. Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).
  20. Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. Adaptation of robust Z’ factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).
  21. Fernandes, H. J. R., et al. ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson’s iPSC-Derived Dopamine Neurons. Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).
  22. Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2. Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).
  23. Kober, D. L., Brett, T. J. TREM2-ligand interactions in health and disease. Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).
  24. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  25. Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).
  26. Hsieh, C. L., et al. A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).
  27. Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease. Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).
  28. Diaz-Aparicio, I., et al. Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome. Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).
  29. Shirotani, K., et al. Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  30. Garcia-Reitboeck, P., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis. Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).

Tags

In VitroQuantitative Imaging AssayPhagocytosisDead Neuroblastoma CellsIPSC-macrophagesNeurodegenerative DiseaseSH-SY5Y CellsCell DissociationFixationPH-sensitive DyeFluorescent DyeMacrophage MediaHoechst 33342

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hall-Roberts, H., Di Daniel, E., James, W. S., Davis, J. B., Cowley, S. A. In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages. J. Vis. Exp. (168), e62217, doi:10.3791/62217 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image