ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンにおける結晶学的フラグメントスクリーニングのワークフローとツール

1.水晶を浸す スクリーニングプレート(ここではF2X入力スクリーンプレート、 図2)を-20°C冷凍庫から取り出し、ベンチ/テーブルに約30分間置いて室温に予熱し、凝縮水分を避けます。 2つの密接に配置された顕微鏡と必要なすべてのツールで作業場所を配置します(図3A)。これらの資料は、 材料表にリストされています。 浸す結晶の転送に適したサイズの3-4ループを選択し、顕微鏡の近くに置きます。 ガラススポットプレートキャビティに脱イオンまたは蒸留水を充填します。 浸漬液5 mLを準備します。 スクリーニングプレートの袋を切り開き、予め温め、室温にします。 プレートをベンチ/テーブルに置いたまま、蓋とホイルをスクリーニングプレートから取り外します。 試薬貯留槽内の浸漬液の5 mLをデカントする。 12チャンネルピペットを使用して、96個の各リザーバに40 μLの浸漬液を充填します。 スクリーニングプレートの上にEasyAccessフレームを置き、デバイスの左右にスライドさせて、付属のクランプで固定します。メモ:イージーアクセスフレームは、HZB14で開発された複数の結晶を扱うための特別なデバイスです。それは蒸発から他の井戸を保護しながら移動可能なタイルをシフトすることによって、各井戸への容易なアクセスを可能にする。 スクリーニングプレート(EasyAccessフレームを含む)を第1の顕微鏡の下に置き、第2の顕微鏡で浸す結晶を含む結晶化板を配置します。 簡単アクセスフレームのアクリルガラスタイルを指または付属のペンツールで動かして、スクリーニングプレートのA1をスライドさせます。 新鮮なピペットチップを使用して、貯蔵所からよく含まれる断片(左上レンズ)に0.4 μLの浸漬溶液を追加します。顕微鏡を通して、ドロップが乾燥した断片を覆っていることを確認して、溶解することができます。注:このステップは、EasyAccessフレームの組み立て前にピペットロボットを使用して行うことができます。このようにして、すべての井戸の浸漬滴を1つの自動手順に配置することができます。しかし、著者らは、断片がゆっくりと結晶の存在下で可溶化することを確実にするために、記載されているように浸漬ステップの直前に浸漬溶液を追加することを推奨している。これは、結晶が高い断片濃度のドロップに移ると突然の衝撃を経験することを避ける。 第2顕微鏡下で、対象結晶を含むウェルの1つで結晶化板のシール箔を切開する。 結晶杖に取り付けられた適切なサイズのループを用いて2つの結晶を第1の顕微鏡下でスクリーニングプレートのウェルA1に移す。 準備したガラススポットプレートでループを洗い、組織にそっと触れて乾燥させます。浸漬溶液を含む断片との交差汚染を避けるために、すべての転送後にこれを行います。 顕微鏡を使用して、結晶が適切に配置されていることを確認します。 次の井戸(例えば、B1)に移動します。 各浸漬ドロップに2つの結晶が含まれるまで、スクリーニングプレートのすべての96ウェルでステップ1.13-1.18を繰り返します。 顕微鏡下からスクリーニングプレート(イージーアクセスフレームを含む)を取り外し、ベンチ/テーブルに置きます。 スクリーニングプレートからイージーアクセスフレームを取り外します。 スクリーニングプレートをシールホイルで密封し、結晶が成長した結晶化インキュベーターまたは食器棚にそれぞれ置きます。 最適化された浸漬時間のためにインキュベート。一晩は通常便利です。 (オプション)約40個のアポ結晶の調製(すなわち、模擬浸漬) MRC 3レンズ96ウェル低プロファイルの結晶化プレートを取り、12チャンネルピペットを使用して、ウェルあたり40 μLの浸漬溶液で2つのカラムを充填します。 EasyAccess フレームを結晶化プレートの上に置き、付属のクランプでデバイスの左右にスライドさせて固定します。 よくA1のアクリルガラスタイルを開いてスライド。 ウェルの左レンズ2枚に0.4μLの浸漬液を入れる。 各ドロップに2〜3結晶を転送します。各移送後、準備したガラススポットプレートでループを洗い、組織にそっと触れて乾燥させます。 次のウェル(例えば、B1)に移動します。 約40個の結晶がインキュベーションの準備ができるまで、ステップ1.24.4-1.24.6を繰り返します。 顕微鏡下からベンチ/テーブルに結晶化プレート(イージーアクセスフレームを含む)を取り外し、EasyAccessフレームを取り外します。 シールホイルで結晶板を密封し、前述の結晶化インキュベーターまたは食器棚に入れる。 スクリーニングプレートと同時にインキュベートする。 2.結晶の収穫 インキュベーターまたは食器棚からインキュベートプレートを取り出します。 1つの顕微鏡と必要なすべてのツールで作業場所を配置します(図3B)。材料は、材料表にリストされています。 3つのUnipuckのふた(例えば、サンプルエンクロージャ)でユニパックフォームデュワーを準備し、液体窒素(LN2)でそれを満たす。注:LN2 を操作するための適切な安全対策を遵守してください(すなわち、安全ゴーグルを着用し、適切な保護具を使用してください)。LN2 ストレージ缶の水凝縮を避けるために、セッション中に数回新鮮な LN2 を取得することをお勧めします。以下の手順全体を通して、泡デュワーのLN2 レベルが常にデュワーの上端に達していることを確認してください。また、LN2 が氷を含まないことも確認してください。頻繁にLN2( 例えば、45分に一度)を交換するか、氷が蓄積し始める場合は最新。その後、第二の泡のデュワーを記入し、それにユニパックを転送します。凍った泡デュワーを空にし、ブロードライヤーで残留氷と水分を取り除きます。 スクリーニングプレートからホイルを取り外し、イージーアクセスフレームを上に置きます。 スライドは、よく開きます A1. 落下から2つの結晶を収穫し、LN2 に速い垂直移動で突っ込み、適切なパック位置にサンプルを挿入することによって、LN2(1 つずつ)でそれらをフラッシュクールします。サンプル追跡シートに関連するメモを取ります。 凍結保護ステップ(ターゲット結晶に必要な場合)。このような場合は、2.6 ではなくこの手順を実行します。 ウェルの左下レンズにクライオプロテクションを含む浸漬液を0.4μL置きます。 左上レンズの落下からゆっくりと左下レンズの溶液を通して、ループをループに入れてループを引き、次にLN2でフラッシュクールにします。この方法で2つの結晶を収穫します。注:手順2.6と2.7では、結晶がループ中で空気にさらされる時間が非常に短く保たれていることを確認してください。急落(すなわち、LN2-充填されたデュワーにおけるサンプルの垂直落下)は、できるだけ速く行われるべきである。これにより、データ内の高いサンプル品質と氷リングの防止が保証されます。サンプルを追跡し(すなわち、結晶に損傷がある場合は注意してください)、次のX線測定のために重複する方に優先順位を付けるために、そのテンプレートを使用します。水晶にひび割れ、染み込みによる「毛」などの欠陥があっても、使用することができ、常に収穫する必要があります。結晶がいくつかの部分に分割された場合は、最大/最高の見た目の作品の2つを収穫する必要があります。 図5 は、このような結晶がどのように見えるかの例を示しています。示されたすべての結晶は、それぞれのキャンペーン11でまだ有用なデータセットを与え、たとえ実質的な形態学的変化が起こったとしても、浸漬処理後に結晶を収穫する価値があることを強調した。 次の井戸に移動し、3つのパックがすべて満たされるまでステップ2.5 – 2.6./2.7を繰り返します。 LN2で事前に冷却した後、蓋の上にユニパック ベースを追加します。 ユニパックは、輸送用のデュワーまたはストレージデュワーのストレージラックに保管してください。 スクリーニングプレートのすべてのウェルが処理されるまで、上記の手順を繰り返します。 (オプション)模擬浸した結晶を調製した場合は、事前に説明したように同様の方法で収穫してください。注:スクリーニングプレートの96の条件のそれぞれに対して2つの結晶をフラッシュ冷却できる場合、32個の模擬アポ結晶のためのスペースがあり、14のユニパックを埋めることができます。 測定までLN2 でユニパックを保管してください。 3.データ収集 ユニパックをビームライン BL14.1 に転送します。SPINE パックがステップ 2 で使用されている場合は、ビームライン BL14.2 に転送します。 以下に示す特定の推奨事項を使用して、ビームライン上で標準測定を実行します。施設と実験制御プログラムMXCuBE2に関する詳細は、以前に15,16を提示されています。図4はビームラインBL14.1およびBL14.2の実験ハッチの内部およびビームラインBL14.1のMXCuBE2制御ソフトウェアの例のスクリーンショットを示す。 時間効率とスループットを最大化するには、テスト イメージのコレクションをスキップします。サンプルから検出器までの距離は、以前の実験で決定された結晶系の上限に適した値に固定されます。データ収集戦略が事前に最適化されていない場合は、1 枚の画像につき 0.1 秒の露出時間で、0.2 度の画像を収集します。 理想的には、モック浸しのアポ結晶を使用して、以前の実験でデータ収集戦略をテストします。より高い対称空間グループの場合、1200個の画像または900画像(それぞれ240°または180°)は、データ収集の開始角度に関係なく、良好な統計量を持つ完全なデータセットをすでに提供します。注:高い冗長性と細かいスライスは、優れたデータ品質17を得ることができます。しかし、ここで提案されたこの「十分だがそれ以上ではない」戦略を使用することは、品質、データ収集時間、および後で分析するための計算要件の間の優れたトレードオフです。説明方法では、ビームラインBL14.1およびBL14.2では24時間で200のデータ収集が可能です。それにもかかわらず、サンプルは優先順位付けされるべきです。 まず、ステップ 2.6./2.7 の優先順位付けに基づいて、フラグメント条件ごとに 1 つのサンプルの回折データセットを収集します (つまり、優先順位が高い重複のデータを収集します)。 3.2.3でデータ収集が失敗した実験では、回折が失われたか、または激しい氷輪が発生し、それぞれのフラグメント条件の2番目の重複サンプルのデータを収集する。 アポ結晶の回折データセットを収集します(ステップ1.24と2.12に従って準備されている場合)。 各フラグメント条件の残りの重複の回折データセットを収集します。 MXCuBE2プログラムでは、CFSキャンペーンのデータセット識別子を次のパターンに一致させます: –[abcDEFGH][0123456789][ab](例えば、MyProtein-F2XEntry-B05a、例えば、「B05」は井戸を表します(すなわち、画面内のフラグメント条件) 4.データ処理 CFSキャンペーンのデータ分析には、ウェブベースのソリューションであるFragMAXappを使用して、CFSデータ18の自動精製およびPanDDAヒット評価(Lima et al. FragMAXapp、未公開データ)のマルチプレックス分析を制御します。HZB で展開されている FragMAXapp バージョンでは、次のプログラム/パイプラインが利用可能です: XDSAPP19、Xia2-DIALS と Xia2-XDS20、fspipeline7、DIMPLE21、フェニックス LigFit22、PanDDA13、23。自動精製の入力としてターゲットタンパク質の精製された入力モデルを使用します。それ以外の場合は、キャンペーン中に収集された1つの高解像度モック浸し結晶の細心の注意を払って洗練を行います。注: ヒット識別の重要な要素は PanDDA です。詳細は、それぞれの出版物13,23で説明されています。簡単に言うと、PanDDA は CFS キャンペーンでデータセットの電子密度マップを自動的に計算します。これらは、非結合フラグメント条件として想定され、いわゆる地上状態モデルを生成するために平均化される。次に、地盤状態モデルを使用して、ボクセル関連の Z スコアを使用して、各電子密度マップと地表状態マップの間の局所的な不一致を導き出します。そして、高いZスコアの領域に対して、いわゆるPanDDAマップは、それぞれのマップからの地表状態密度の微調整された減算によって作成される。これにより、フラグメント バインディング イベントの可視性が大幅に向上します。 PanDDA の結果を最大化するには、2 段階のアプローチを使用します。まず、PanDDA 実行(pandda.analyse)を標準設定で実行します。たとえモック浸した結晶が収集されたとしても、PanDDAによる地上状態モデルの偏りのない生成を可能にするために、そのアイデンティティはパラメータとして含まれません( それにもかかわらず可能です)、すべての利用可能なデータから得られます。その後、出力データは、ユーザがクート24のいわゆるPanDDA検査を介して評価される。ここでは、比較的高い信頼度を持つヒットが注目されるべきであり、最初のステップを締結する。 次に、-exclude_from_characterisation=