Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biofilms Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinliği Testi
Summary
Bu iş akışı, kistik fibrozisli bireylerin akciğerlerinde bakteriyel biyofilm için yerleşik bir ex vivo modeli kullanılarak antibiyotik duyarlılık testi yapmak için kullanılabilir. Bu modelin kullanımı MBEC (minimal biyofilm eradikasyon konsantrasyonu) testlerinin klinik geçerliliğini artırabilir.
Abstract
Kistik fibrozis (CF) olan bireylerin akciğerlerinde bulunan bakteriyel biyofilmler için etkili antibiyotik reçetesi, standart tanı yöntemleri (örneğin, et suyu mikrodilüsyonu, disk difüzyonu veya Etest) kullanılarak antibiyotik duyarlılık testi (AST) sonuçları ile antibiyotik tedavisinden sonraki klinik sonuçlar arasındaki zayıf bir korelasyon ile sınırlıdır. Hazır biyofilm büyüme platformları kullanılarak AST’yi iyileştirme girişimleri sonuçlarda çok az iyileşme göstermektedir. İn vitro biyofilm sistemlerinin CF akciğerinin fizikokimyasal ortamını taklit etme kabiliyetinin sınırlılığı ve dolayısıyla bakteriyel fizyoloji ve biyofilm mimarisi, CF enfeksiyonu için yeni tedavilerin keşfinde de bir fren görevi görür. Burada, domuz bronşiyolar doku ve sentetik CF balgamdan (ex vivo domuz akciğeri, EVPL) oluşan bir ex vivo CF akciğer modelinde olgun, in vivo benzeri biyofilmler olarak yetiştirilen CF patojenlerinin AST’lerini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz.
Mikroter plakalarda standart laboratuvar ortamı veya sentetik CF balgamının çeşitli formülasyonlarını kullanarak biyofilm duyarlılık testi için çeşitli in vitro tahliller mevcuttur. Hem büyüme ortamı hem de biyofilm substratı (polistiren plaka vs. bronş dokusu) biyofilm antibiyotik toleransı etkilemesi muhtemeldir. Ex vivo modelde klinik Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus izolatlarının toleransının artmış olduğunu gösteriyoruz; biyofilmlerin antibiyotik tedavisinin etkileri, standart mikrodilümasyon testlerinde minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) veya disk difüzyon tahlillerinde hassas/dirençli bir sınıflandırma ile ilişkili değildir.
Ex vivo platformu, hasta örneklerinin ısmarlama biyofilm AST’si için ve farmasötik araştırma ve geliştirme sırasında potansiyel antibiyofilm ajanları için geliştirilmiş bir test platformu olarak kullanılabilir. Daha fazla in vivo benzeri test platformları kullanılarak antibiyofilm ilaç keşfinin reçetesini veya ivmesini iyileştirmek, CF’li bireyler için sağlık sonuçlarını büyük ölçüde iyileştirebilir ve klinik tedavi ve keşif araştırmalarının maliyetlerini azaltabilir.
Introduction
Kronik biyofilm enfeksiyonları, normal bağışıklık savunması tehlikeye atılan bireyleri etkiler. Risk altındaki gruplar arasında genetik durumu kistik fibrozis (CF)1olanlar bulunur. Erken bebeklik döneminde solunum yollarındaki anormal kalın, yapışkan mukusların kolonizasyonu, bronşiollerin inatçı biyofilm enfeksiyonlarına yol açar2,3. Bakterilerin geniş matris kapsüllü biyofilmler olarak büyümesi, immün sistemi baskılanmış kişilerin kronik enfeksiyonlarını sağlıklı konakçıların akut enfeksiyonlarından ayıran bir faktördür ve biyofilm durumu hem bakterileri antibiyotik maruziyetinden korur (matris yoluyla difüzyonun azalması nedeniyle) hem de antibiyotik duyarlılıklarını azaltır (örneğin, quiescence indüksiyonu veya efflux pompalarının kabarması yoluyla)4,5. Bununla birlikte, konak doku fizyolojisi ve kimyasındaki hastalığa özgü değişiklikler, bakteriyel fizyolojiyi akut enfeksiyonlarda veya standart laboratuvar büyüme koşullarında gözlenenden daha da değiştirir. CF’deki önemli örnekler arasında akciğer yüzey aktif maddelerinden salınan ve musinin mikrobiyal bozulmasıyla üretilen yağ asitleri ve amino asitler gibi olağandışı karbon kaynaklarının kullanımı, hasarlı dokulardan demir gibi mikro besinlerin salınması ve mikroaerobiyoz6,7,8 sayılabilir.
Bu nedenle, belirli bir biyofilm enfeksiyonu bağlamındaki spesifik fizikokimyasal durumlar antibiyotiklere verilen yanıtları etkileyebilir. İlk olarak, hücre dışı matrisin yapısı ve derinliği, besin maddeleri veya kesme kuvvetleri gibi yerel çevresel koşullara bağlıdır. İkincisi, çevresel ipuçları spesifik antibiyotik direnci genlerinin ekspresyonini tetikleyebilir. Örneğin, CF patojeni Pseudomonas aeruginosa, CF balgamında beta-laktamazın artan ekspresyonunun ve in vitro9’akarşı porinlerin azaltılmış ekspresyonunun arttığını gösterirken, başka bir CF patojeni, Burkholderia cenocepacia, CF balgamında yetiştirildiğinde beta-laktamları ve efflux pompalarını yükseltir. Üçüncü olarak, konak içi durumlar, in vitro’yu yeniden kapsüllemek zor olan antibiyotiklere dirençli fenotiplere fizyolojik veya genetik bir geçişe işaret edebilir. Bunlar CF patojeni Staphylococcus aureus11,12’ninküçük koloni varyantlarını içerir.
Tüm bu veriler, tanı laboratuvarları tek tek klonları patojenik biyofilmden izole ettiğinde ve standart laboratuvar ortamlarında (et suyu mikrodilüsyon, disk difüzyonu veya Etest) planktonik veya agar plakalı yetiştirilen kültürlerde AST gerçekleştirdiğinde, sonuçların genellikle hangi antibiyotiklerin gerçekten vivo olarak çalışacağını tahmin etmediğini göstermektedir. İn vitro biyofilm tahlilleri kullanılsa bile, kullanılan ortam ve bağlanma yüzeyindeki farklılıklar nedeniyle in vivo benzeri bir biyofilm fenotipi işaret etmeyebilir, bu nedenle akış hücreleri veya yüksek verimli mikro plaka platformları kullanılarak yapılan tahliller antibiyotik hassasiyetini aşırı tahmin edebilir13. Aynı sorun, akademi ve endüstride yeni antibiyofilm ajanları geliştirmek isteyen araştırmacılar için de geçerlidir: akış hücreleri, mikrotiter plakalar veya Hastalık Kontrol Merkezi biyofilm reaktörleri gibi in vitro platformları kullanarak ilaç potansiyelini test etmek biyofilm etkinlik çubuğunu çok düşük ayarlayabilir ve araştırma, geliştirme boru hattında yanlış pozitifler üretebilir.
CF’de antibiyotik tedavisinden sonra AST sonuçları ile klinik sonuç arasındaki zayıf korelasyon iyi bilinmektedir. Birçok klinisyen, bu sonuçları yorumlamak için tek tip, CF’ye özgü yönergeler olmadığı için tanı laboratuvarı AST’yi görmezden gelir ve bunun yerine reçete yazmak için duruma göre kararlar verir. Standart AST ortamı (örneğin, katyon ayarlı Muller-Hinton suyu) içeren bir mikro plakanın kuyuları içinde ayarlanan plastik mandalların yüzeyinde yetişen biyofilmleri kullanan Calgary biyofilm cihazı kullanılarak CF AST’yi iyileştirme girişimleri yapılmıştır14,15. Bu tahlil, hangi antibiyotiklerin vivo olarak çalışacağını tahmin etmede standart planktonik AST16’dandaha iyi bir şey yapmaz. CF’li hastalar üzerindeki etkisi çok keskindir. Tekrarlanan antibiyotik tedavisine rağmen (düzenli inhale antibiyotikler ve Birleşik Krallık’ta CF’li bireyler için 27 gün / yıl intravenöz antibiyotik alan bir ortanca)17, akut pulmoner alevlenmenin sık ve öngörülemeyen atakları ilerleyici akciğer hasarına ve vakaların yaklaşık% 90’ında solunum yetmezliğinden ölüme yol açar. Yakın tarihli bir analizde, bakteriyel akciğer enfeksiyonu CF’deki ilaç maliyetlerinin en güçlü tahmincisiydi ve sağlık maliyetlerini yönlendirmek için ortalama 3.6K / hasta / yıl ekledi18,19.
Aksi takdirde sağlıklı bireylerin akut enfeksiyonları için, örneğin, bakım noktası genomik tahminine dayanan hızlı AST’ye odaklanan mevcut araştırma ve politika idealdir20. Ancak kronik CF enfeksiyonları durumunda, farklı bir yaklaşıma ihtiyaç duyulduğu açıktır: in vivo ortamı ve patojen metabolik durumu daha iyi rekapitüle eden ve gerçekçi biyofilm yapısının oluşumuna izin veren konak taklit modellerinde AST’nin uygulanması.
Daha önce sentetik CF balgamında inkübe edilmiş ve P. aeruginosa veya S. aureusile enfekte domuz bronşiol bölümlerini içeren bir CF biyofilm modeli geliştirdik. Enfekte olmayan EVPL normal histopatolojiyi 7 gün boyunca korur, ancak P. aeruginosa ve S. aureus’un laboratuvar veya klinik izolatları, cf enfeksiyonunun etiyolojisini taklit ederek doku etrafında tekrar vivo benzeri agregalar oluşturur21,22,23. Bu yüksek geçerlilikli, yüksek verimli modeli CF için özel bir biyofilm AST platformu olarak kullanmak için bir protokol sunuyoruz ve modelde yetiştirildiğinde patojen biyofilmlerin klinik olarak kullanılan antibiyotiklere yüksek toleransını gösteren örnek sonuçlar sunuyoruz. Model, biyofilm oluşumunun yönetimi veya önlenmesi için araştırma, geliştirme boru hatlarına ve potansiyel olarak tanısal AST’ye kolayca dahil edilebilir. Kullanılan ekipmanların çoğu (bkz. Malzeme Tablosu) tipik bir mikrobiyoloji laboratuvarında kolayca bulunabilir, ancak bir boncuk çırpıcı gereklidir ve işbirlikçilerle yaptığımız işten uygun bir ultraviyole mikrop öldürücü kabinin de temin edilmesi gerekebileceğini bulduk. Akciğerler ticari kasaplardan veya abattoirlerden kaynaklandığından, model etik kaygılar sunmaz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo akciğer modeli yüksek verim ve ucuzdur ve et endüstrisinden tüketici sonrası atık kullandığı için etik kaygılar sunmaz. Kronik olarak enfekte olmuş insan CF hava yollarını şu anda mevcut olandan daha iyi taklit etmek için tasarlanmıştır, in vitro AST platformları. Burada sunulan sonuçlar, bu koşullar altında antibiyotik duyarlılığının daha doğru tahmin edilebileceğini göstermektedir.
Protokolde güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayacak kritik adımlar şunlardır:
- Akciğer örneklerinin kesilmesi, toplanması ve işlenmesi arasında tutarlı zaman ve depolama yöntemleri kullanın. Kesimden sonra akciğerlerin mümkün olan en kısa sürede kullanılması ve bulaşma potansiyelinin minimumda tutulması önemlidir. Deneysel kültürlerin mümkün olduğunca taze olmadıkları takdirde akciğerlerde büyüme yeteneklerinde farklılıklar gözlenmiştir.
- SCFM üretiminde sterilitenin korunması ve akciğer parçalarının diseksiyonu esastır. Sağlıklı akciğerler steril değildir ve bu nedenle kommensal bakterilerin varlığı kronik enfeksiyon için ‘doğal’ bir ortamı yansıtabilir. Bununla birlikte, daha önce de belirtildiği gibi, çok türlü popülasyonlardaki bakteriyel etkileşimler sonuçları ve antibiyotiklere duyarlılığı değiştirebilir, bu nedenle kontaminasyondan kaçınılmalı ve akciğerler kullanımdan önce sterilize edilmelidir. UV sterilizasyonunun kullanılmasını savunuyoruz, çünkü teneke doku bütünlüğünde değişikliklere ve gerekirse ek antibiyotik yıkamalarına neden olduğu görünmüyor. Bununla birlikte, antibiyotikler dikkatli kullanılmalıdır, çünkü seçici basınçlar getirerek sonuçları etkileyebilir ve test bakteri popülasyonlarında gen ekspresyonunu değiştirebilir.
- Sterilizasyon sırasında çıkarılmamış kirletici veya kommensal bakterilerin büyümesini vurgulamak için seçici olmayan, zengin bir ortamda yetiştirilen sahte enfekte, negatif kontrol doku örneklerini ve hücre sayısı plakalarını kullanın. Bu, bu bakterilerin AST üzerindeki herhangi bir etkisini azaltmak için gereklidir. Yinelenen plakalar koloni tanımlamasını ve hücre numaralandırmasını hızlandırdtıkça, ilgi çekici organizmaya özgü yinelenen, seçici agar, hücre sayısı plakaları üretmek de yararlıdır.
- Modeli ilk kullanırken ve doku bölümleri arasındaki biyofilm CFU varyasyonlarını değerlendirmek için yeni suşlar veya bakteri genotipi ile kullanırken pilot deneyler yapın, güç hesaplamaları yoluyla optimal deneysel örnek boyutlarının (örneğin, kaç kopya akciğerden elde etmek için kaç kopya doku bölümü) seçilmesine izin verin.
- Test standart olmayan bir inoculum kullanır, çünkü bu, 48 saatlik inkübasyondan sonra hızlı aşılamaya ve nispeten tutarlı biyofilm yüklerinin oluşumuna izin verir (özellikle P. aeruginosaiçin). Erken biyofilm büyüme aşamalarında antibakteriyel etkinliği test etmek için, ASM’de askıya alınan koloni tarafından yetiştirilen bakterilerin standartlaştırılmış bir CFU’su ile aşılamayı düşünün. Planktonik bakterilerle aşılamayı önermiyoruz: erken pilot deneyler, bunun güvenilir biyofilm oluşumuna değil akut, invaziv büyümeye yol açtığını gösterdi.
Bu protokol P. aeruginosaile kullanım için sağlam bir prototip modeli üretir S. aureusile kullanım için büyük bir geliştirme potansiyeline sahip , ancak gelecekte belirli uygulamalar için ele alınması gereken bazı sınırlamalara sahiptir. Doku, klonal popülasyonların gelişmesine izin vermek için tek kolonilerden aşılandı. Sonuçlar, P. aeruginosaiçin bunun 48 saat hücre sayıları üzerinde çok az etkisi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, S. aureus için bakteri yükünde daha fazla değişkenlik gözlenmiştir ve model içinde farklı bakterilerin farklı büyüyebileceği göz önüne alındığında, standartlaştırılmış bir başlangıç inokülüsyumu ve aynı boyut ve ağırlıktaki doku örneklerinin titiz üretimi çalışma organizmasına bağlı olabilir. Hassas diseksiyon/ enfeksiyon tekniklerindeki veya yerel domuz ırkı / landrace’deki farklılıklar nedeniyle laboratuvarlar arasında farklılıklar da olabilir. Modelin bireysel uygulamaları için bakteri popülasyonlarının tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, sonuçların istatistiksel analizi25’in bir parçası olarak tekrarlanabilirlik hesaplamalarının kullanılmasını ve son deneylerde kullanımları için en uygun örnek boyutunu hesaplamak için pilot deneylere dayalı tekrarlanabilirlik / güç hesaplamalarının kullanılmasını öneriyoruz.
EVPL’nin geleneksel plaka testlerine göre en önemli avantajlarından biri, planktonik olarak veya abiyotik yüzeylerde büyüyen bakterileri test etmek yerine, bakteriyel biyofilmlerin konak bir ortamda ve hücre farklılaşmasıyla mekansal olarak yapılandırılmasına izin veriyor olmasıdır. Bunun, fizyolojik ve besin gradyanlarının antimikrobiyal ajanların aktivitesi üzerindeki etkisinin yanı sıra kronik bir enfeksiyon içindeki farklı mikroçevrimlerde aktif tedavilerin verilmesi ve mevcudiyeti ve bakteriler arasındaki hücre-hücre etkileşimi üzerinde önemli etkileri vardır. Bu son nokta özellikle önemlidir, çünkü çok türlü enfeksiyonlar CF’de rutin olarak gözlenir ve astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi diğer solunum yolu rahatsızlıklarıyla ilişkili enfeksiyonlar için giderek daha önemli hale gelmektedir. Klinik tanıda bireyselleştirilmiş hasta balgam örneklemesi için AST için bu modeli geliştirme potansiyeli vardır. Büyüme için yara taklit eden bir in vitro modeli ve kronik yaralardan kaynaklanan debrided biyofilm AST (Lubbock, Teksas’taki Güneybatı Bölgesel Yara Bakım Merkezi, Dr. R. Wolcott) kullanılarak benzer bir deneme zaten devam etmektedir.
Ayrıca, model post-mortem doku kullanır, bu nedenle konak immün yanıtın antibiyotik duyarlılığı üzerindeki etkisi sınırlıdır. Mevcut in vitro modeller de konak bağışıklık yanıtlarını hesaba katmamaktadır, bu nedenle bunu modelin AST uygulamalarında gelecekteki kullanımına bir engel olarak görmüyoruz. Ancak farmakokinetik ve farmakodinamik parametreler ve antibiyotik dozing kılavuzları belirlenirken immün yanıt dikkate alınır. Çalışmalarımız doku23 (ve S. Azimi, kişisel iletişim) içinde artık bağışıklık hücreleri ve yanıtları kanıtlamış olsa da, in vivo koşullarla daha büyük bir eşleşme isteniyorsa, bu modelin daha fazla optimizasyonu ve geliştirilmesi için birincil bir alandır.
CF için klinik olarak daha geçerli AST sağlamak, İngiltere Sağlık, Sosyal Bakım Yasası 2008’in “ihtiyatlı reçete yazma ve antimikrobiyal yönetim sağlamak için prosedürlerin uygulanmalıdır” yönündeki önemli bir tavsiyesini karşılamaya yardımcı olacaktır. EVPL’nin bu ihtiyacı karşılamaya yardımcı olmak için ideal bir aday modeli olduğuna inanıyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Örnek sonuçlar aldığımız orijinal makaleler için tüm ortak yazarlarımıza teşekkür ederiz. Çalışma, FH’a verilen bir MRC Yeni Araştırmacı Araştırma Hibesi (MR/R001898/1hibe numarası) tarafından finanse edildi; NEH ve IA’ya verilen BBSRC Midlands Bütünleştirici Biyobilimler Eğitim Ortaklığı’ndan (MIBTP) doktora öğrencileri tarafından; ve Warwick Üniversitesi Lisans Araştırma Destek Programı tarafından bir yaz tatili araştırma projesi yürütmek için FA’ya verildi. Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) ve John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) akciğer temini için teşekkür ederiz. Ayrıca, Warwick Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi’ndeki Medya Hazırlık Tesisi’nin, Cerith Harries ve Caroline Stewart’a özel teşekkür ve Warwick Antimikrobiyal Tarama Tesisi’ndeki Anita Catherwood’un yardımını da kabul etmek istiyoruz.
Materials
| 0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
| 24-well culture plates | |||
| 70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
| Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
| Agarose | |||
| Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
| Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
| Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
| Bunsen burner | |||
| Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
| Coolbox to transport lungs to lab | |||
| Dissection scissors in different sizes | |||
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
| Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
| Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
| Germicidal UV cabinet | |||
| Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
| Large pallet knife | |||
| LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
| Mounted razor blades | |||
| Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
| Petri dishes | |||
| Phosphate-buffered saline | |||
| Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
| SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
| Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
| Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
| Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |
References
- Elborn, J. S. Cystic fibrosis. The Lancet. 388 (10059), 2519-2531 (2016).
- Høiby, N., et al. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients. APMIS. 125, 339-343 (2017).
- Bjarnsholt, T., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatric Pulmonology. 44 (6), 547-558 (2009).
- Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Penesyan, A., Gillings, M., Paulsen, I. Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities. Molecules. 20 (4), 5286 (2015).
- Son, M. S., Matthews, W. J., Kang, Y., Nguyen, D. T., Hoang, T. T. In vivo evidence of Pseudomonas aeruginosa nutrient Acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients. Infection and Immunity. 75 (11), 5313-5324 (2007).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Stites, S. W., Plautz, M. W., Bailey, K., O’Brien-Ladner, A. R., Wesselius, L. J. Increased concentrations of iron and isoferritins in the lower respiratory tract of patients with stable cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (3), 796-801 (1999).
- Cornforth, D. M., et al. Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5125-5134 (2018).
- Drevinek, P., et al. Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum. BMC Infectious Diseases. 8, 121 (2008).
- Goerke, C., Wolz, C. Regulatory and genomic plasticity of Staphylococcus aureus during persistent colonization and infection. International Journal of Medical Microbiology. 294 (2-3), 195-202 (2004).
- Wolter, D. J., et al. Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis. Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).
- Roberts, A. E. L., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427, 3646-3661 (2015).
- Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology. 37 (6), 1771-1776 (1999).
- Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J., Burns, J. L. Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1915-1922 (2004).
- Smith, S., Waters, V., Jahnke, N., Ratjen, F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), (2020).
- Trust, C. F. . Annual Data Report 2019. , (2019).
- Angelis, A., et al. Social and economic costs and health-related quality of life in non-institutionalised patients with cystic fibrosis in the United Kingdom. BMC Health Services Research. 15 (1), 428 (2015).
- Eidt-Koch, D., Wagner, T. O. F., Mittendorf, T., von der Schulenburg, J. M. G. Outpatient medication costs of patients with cystic fibrosis in Germany. Applied Health Economics and Health Policy. 8 (2), 111-118 (2010).
- Harrington, N. E., Sweeney, E., Harrison, F. Building a better biofilm – Formation of in vivo-like biofilm structures by Pseudomonas aeruginosa in a porcine model of cystic fibrosis lung infection. Biofilm. 2, 100024 (2020).
- Harrison, F., Diggle, S. An ex vivo lung model to study bronchioles infected with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbiology. 162, 1755-1760 (2016).
- Sweeney, E., et al. An ex vivo cystic fibrosis model recapitulates key clinical aspects of chronic Staphylococcus aureus infection. Microbiology. , (2020).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: A practical guide for biologists. Biological Reviews. 85 (4), 935-956 (2010).
- Sweeney, E., Sabnis, A., Edwards, A. M., Harrison, F. Effect of host-mimicking medium and biofilm growth on the ability of colistin to kill Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 166 (12), 1171-1180 (2020).
- Stalker, D. J., Jungbluth, G. L., Hopkins, N. K., Batts, D. H. Pharmacokinetics and tolerance of single- and multiple-dose oral or intravenous linezolid, an oxazolidinone antibiotic, in healthy volunteers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (5), 1239-1246 (2003).
- Ager, S., Gould, K. Clinical update on linezolid in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Infection and Drug Resistance. 5, 87-102 (2012).
- Kirchner, S., et al. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
