Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak
Summary
Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.
Abstract
Kuş embriyosu, bir yüzyıldan fazla bir süredir model bir sistem olarak kullanılmış ve omurgalı gelişiminin temel olarak anlaşılmasına yol açmıştır. Bu model sisteminin güçlü yönlerinden biri, kimerik embriyolarda dokuların etkisinin ve dokular arasındaki etkileşimin doğrudan değerlendirilebilmesidir. Daha önce ön beyinden gelen sinyallerin, Frontonazal Ektodermal Bölgede (FEZ) Sonik kirpi (SHH) ekspresyon alanının şeklini düzenleyerek yüz morfogenezine katkıda bulunduğunu göstermiştik. Bu makalede, ön beyin kimeralarını üretme yöntemi ve bu deneylerin sonuçlarının illüstrasyonları açıklanmaktadır.
Introduction
Gelişim biyolojisindeki birçok çağdaş araştırma, embriyoların şekillendirilmesinde genlerin rolüne odaklanmaktadır. Gelişimsel mekanizmaları genetik bir perspektiften incelemek için iyi araçlar vardır. Bununla birlikte, embriyolar bir araya getirilir ve doku etkileşimlerine yanıt olarak morfogeneze tabi tutulur. Kuş sistemi, aşağıdaki nedenlerden dolayı gelişimi düzenleyen doku etkileşimlerinin çeşitliliğini değerlendirmek için kullanılan klasik bir araçtır: embriyoloji iyi anlaşılmıştır, embriyolara kolayca erişilebilir, kuş sistemlerinin analizi için araçlar iyi gelişmiştir ve embriyolar ucuzdur.
Kuş nakli sistemi, soy takibi ve gelişim sırasındaki doku etkileşimlerini değerlendirmek için neredeyse bir yüzyıl boyunca yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4. Bu sistem, üst çene5’in morfogenezini düzenleyen bir sinyal merkezi olan Frontonazal Ektodermal Zon’u (FEZ) araştırmak için kullanıldı ve daha önce bu tekniği tanımlayan bir video yayınlandı6. Bıldırcın-civcivlere ek olarak, doku etkileşimlerinin analizi için kimera üretmek için başka türler de kullanılmıştır. Örneğin, fare FEZ’si vahşi tip7 ve mutant fareler8’den nakledildi ve diğerleri, yüz iskeleti 9,10,11,12’nin modellenmesinde nöral tepenin rolünü değerlendirmek için bir ördek, bıldırcın ve civciv sistemleri kullandılar.
Bu çalışmada, bıldırcın, ördek ve civciv embriyoları arasında ventral ön beyni karşılıklı olarak naklederek FEZ’deki gen ekspresyonunun paternini düzenlemede ön beynin rolü değerlendirilmiştir, çünkü FEZ’de Sonic kirpi ekspresyonunu indüklemek için ön beyinden bir sinyal gereklidir. Ön beyin nakilleri bu alanda benzersiz değildir. Bu nakiller, bıldırcın ve ördek embriyolarında motilitenin gelişimini değerlendirmek için kullanıldı13, ancak bu deneylerde nöral olmayan türevlere katkıda bulunan dokular da nakledildi. Diğer çalışmalarda, kuşlardaki işitsel devreler ön beyin nakli14 ile değerlendirilmiştir, ancak bu nakiller, yüz şekli 9,10’a katkıda bulunan ve FEZ15’te SHH ekspresyonunun düzenlenmesine katılan varsayımsal nöral krest hücreleri içeriyordu. Bu nedenle, beynin yüz şeklindeki rolünü değerlendirmek için nöral tüpün kapanmasından önce sadece ventral ön beyni bir kuş türünden diğerine nakletmek için bir sistem geliştirilmiştir16 (Şekil 1A, B). Bu yöntemde greftin nöral krest kontaminasyonu yoktu. Bu makalede yöntem gösterilerek beklenen sonuçlar açıklanmış ve karşılaşılan zorluklar tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarif edilen yöntem, bazal ön beyin ile komşu ektoderm arasındaki doku etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Bu yaklaşım önceki ön beyin nakli yöntemlerinden farklıdır, çünkü donör dokusu ventral ön beyinle sınırlıydı. Bu, yüz morfolojisinin modellenmesine katıldığı gösterilen nöral krest hücrelerinin transplantasyonunu ortadan kaldırır 9,10. Bu nedenle, greftin bazal ön beyinle sınırlandırılması, planlanan deneysel sonu?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DE019648, R01DE018234 ve R01DE019638 ödül numaraları altında desteklenmiştir.
Materials
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35×10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
