Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos
Summary
Aquí describimos un protocolo para el cultivo sistemático de esferoides epidérmicos en cultivo de suspensión 3D. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en una variedad de tipos de tejidos epiteliales y para el modelado de varias enfermedades y afecciones humanas.
Abstract
La desregulación epitelial es un nodo para una variedad de afecciones y dolencias humanas, incluidas heridas crónicas, inflamación y más del 80% de todos los cánceres humanos. Como tejido de revestimiento, el epitelio de la piel a menudo está sujeto a lesiones y se ha adaptado evolutivamente al adquirir la plasticidad celular necesaria para reparar el tejido dañado. A lo largo de los años, se han realizado varios esfuerzos para estudiar la plasticidad epitelial utilizando modelos in vitro y ex vivo basados en células. Sin embargo, estos esfuerzos han sido limitados en su capacidad para recapitular las diversas fases de la plasticidad de las células epiteliales. Describimos aquí un protocolo para generar esferoides epidérmicos 3D y células derivadas de esferoides epidérmicos a partir de queratinocitos humanos neonatales primarios. Este protocolo describe la capacidad de los cultivos de esferoides epidérmicos para modelar funcionalmente distintas etapas de la plasticidad generativa de queratinocitos y demuestra que el rechapado de esferoides epidérmicos puede enriquecer cultivos heterogéneos de queratinocitos humanos normales (NHKc) para integrinaα6hi/ EGFRlo queratinocitos subpoblaciones de queratinocitos con características mejoradas similares a los tallos. Nuestro informe describe el desarrollo y mantenimiento de un sistema de alto rendimiento para el estudio de la plasticidad de los queratinocitos cutáneos y la regeneración epidérmica.
Introduction
El epitelio estratificado de mamíferos es la arquitectura epitelial más compleja en todos los sistemas vivos y con mayor frecuencia está sujeto a daños y lesiones. Como tejido protector, el epitelio estratificado ha evolucionado para generar una respuesta compleja y efectiva al daño tisular. Tras la lesión, estas células deben activar programas de plasticidad de linaje, que les permitan migrar al sitio lesionado y llevar a cabo la reparación1,2,3. Esta respuesta multifacética ocurre en varios pasos secuenciales que siguen siendo poco conocidos.
Un obstáculo importante en el estudio del intrincado proceso de regeneración epitelial radica en la escasez de sistemas modelo de alto rendimiento que puedan capturar actividades celulares dinámicas en etapas definidas de regeneración celular. Si bien los modelos de ratones in vivo ofrecen información relevante sobre la cicatrización de heridas y recapitulan más de cerca el proceso regenerativo humano, su desarrollo requiere esfuerzos laboriosos y un costo significativo, lo que limita su capacidad de rendimiento. Existe, por lo tanto, una necesidad crítica de establecer sistemas que permitan la investigación funcional de la regeneración del tejido epitelial humano a una escala de alto rendimiento.
En los últimos años, se han hecho varios intentos para enfrentar el desafío de la escalabilidad. Esto se ve a través de una gran expansión de modelos innovadores basados en células in vitro y ex vivo que imitan de cerca el contexto regenerativo in vivo. Esto incluye avances en organ-on-chip4,esferoide5,organoide6y cultivos organotípicos7. Estos sistemas basados en células 3D ofrecen ventajas únicas y presentan distintas limitaciones experimentales. Hasta la fecha, el cultivo de esferoides sigue siendo el modelo de cultivo celular 3D más rentable y ampliamente utilizado. Y aunque varios informes han indicado que los cultivos de esferoides se pueden utilizar para estudiar las características de las células madre de la piel, estos estudios se han realizado en gran medida con tejido animal8,9o con fibroblastos dérmicos10,sin prácticamente informes que caractericen a fondo las propiedades regenerativas de los cultivos de esferoides epidérmicos humanos. En este protocolo detallamos el desarrollo funcional, el cultivo y el mantenimiento de cultivos de esferoides epidérmicos a partir de queratinocitos humanos normales (NHKc). Igualmente describimos la utilidad de este sistema para modelar las fases secuenciales de la regeneración epidérmica y la plasticidad de las células madre queratinocitos in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de sistemas de cultivo de esferoides 3D ha tenido una amplia utilidad en la evaluación de la madre celular. Se ha demostrado que estos sistemas mejoran el enriquecimiento de las células madre tisulares13, sin embargo, su utilidad para el estudio de las células madre epidérmicas humanas se ha explorado de manera limitada. Aquí, describimos una estrategia para enriquecer las células madre de queratinocitos humanos utilizando técnicas de cultivo 3D. En este sistema, los NHKc se cultivan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) proporcionó acceso a equipos de clasificación de imágenes y células y asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1R21CA201853. El MCF y el IRF reciben apoyo parcial de la subvención P20GM103499 de los NIH, SC INBRE. El MCF también recibe apoyo de la subvención P20GM109091 de los NIH. Yvon Woappi fue apoyado en parte por las subvenciones de los NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) y R25GM076277 (IMSD), y por una beca del Programa de Profesores Grace Jordan McFadden en UofSC. Geraldine Ezeka y Justin Vercellino fueron apoyados por las subvenciones de los NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) en UofSC. Sean M. Bloos fue apoyado por el Magellan Scholar Award 2016 en la UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
