Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.
Abstract
A desregulação epitelial é um nó para uma variedade de condições e doenças humanas, incluindo ferimentos crônicos, inflamação e mais de 80% de todos os cânceres humanos. Como tecido forro, o epitélio da pele é frequentemente sujeito a lesões e tem se adaptado evolutivamente adquirindo a plasticidade celular necessária para reparar tecido danificado. Ao longo dos anos, vários esforços foram feitos para estudar a plasticidade epitelial usando modelos in vitro e ex vivo baseados em células. No entanto, esses esforços têm sido limitados em sua capacidade de recapitular as várias fases da plasticidade celular epitelial. Descrevemos aqui um protocolo para a geração de esferoides epidérmicos 3D e células derivadas de esferoides epidérmicos de queratinócitos humanos neonatais. Este protocolo descreve a capacidade das culturas eferóides epidérmicas de modelar funcionalmente estágios distintos da plasticidade generativa de queratinócitos e demonstra que a re-platide epidérmica pode enriquecer culturas heterogênicas normais de queratinócitos (NHKc) para subpopulações intenα6hi/EGFRlo queraatinóte com características avançadas de tronco. Nosso relatório descreve o desenvolvimento e manutenção de um sistema de alto rendimento para o estudo da plasticidade da queratinócito da pele e da regeneração epidérmica.
Introduction
O epitélio estratificado dos mamíferos é a arquitetura epitelial mais complexa em todos os sistemas vivos e está frequentemente sujeito a danos e lesões. Como um tecido protetor, o epitélio estratificado evoluiu para gerar uma resposta complexa e eficaz de danos teciduais. Após a lesão, essas células devem ativar programas de plastifica de linhagem, que permitem migrar para o local lesionado e realizar o reparo1,2,3. Essa resposta multifacetada ocorre em várias etapas sequenciais que permanecem mal compreendidas.
Um grande obstáculo no estudo do intrincado processo de regeneração epitelial está na escassez de sistemas de modelos de alto rendimento que podem capturar atividades celulares dinâmicas em estágios definidos de regeneração celular. Enquanto os modelos de mouse in vivo oferecem uma visão relevante sobre a cicatrização de feridas e mais intimamente recapitulam o processo regenerativo humano, seu desenvolvimento exige esforços trabalhosos e custo significativo, limitando sua capacidade de rendimento. Existe, portanto, uma necessidade crítica de estabelecer sistemas que permitam a investigação funcional da regeneração do tecido epitelial humano em alta escala de rendimento.
Nos últimos anos, várias tentativas foram feitas para enfrentar o desafio de escalabilidade. Isso é visto através de uma grande expansão de modelos inovadores baseados em células in vitro e ex vivo que imitam de perto o contexto regenerativo in vivo. Isso inclui avanços nas culturas organ-on-chip4, esferoide5,organoide6e organotípica7. Esses sistemas baseados em células 3D oferecem vantagens únicas e apresentam limitações experimentais distintas. Até o momento, a cultura esferoide continua sendo o modelo de cultura celular 3D mais econômico e amplamente utilizado. E embora vários relatórios tenham indicado que culturas esferoides podem ser usadas para estudar características de células-tronco da pele, esses estudos têm sido conduzidos em grande parte com tecido animal8,9, ou com fibroblastos dérmicos10,sem praticamente nenhum relato caracterizando completamente as propriedades regenerativas das culturas esferoides epidérmicas humanas. Neste protocolo detalhamos o desenvolvimento funcional, a cultura e a manutenção das culturas eferóides epidérmicas de queratinócitos humanos normais (NHKc). Descrevemos igualmente a utilidade deste sistema para modelar as fases sequenciais da regeneração epidérmica e da plasticidade das células-tronco queratinócitos in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de sistemas de cultura esferoide 3D tem tido ampla utilidade na avaliação da haste celular. Esses sistemas têm sido demonstrados para melhorar o enriquecimento das células-tronco teciduais13, mas sua utilidade para o estudo de células-tronco epidérmicas humanas tem sido explorada limitadamente. Aqui, descrevemos uma estratégia para enriquecer células-tronco de queratinócitos humanos usando técnicas de cultura 3D. Neste sistema, o NHKc é cultivado como suspensões eferóides multic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) forneceu acesso a equipamentos de triagem de imagens e células e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão 1R21CA201853. O MCF e o IRF recebem apoio parcial da concessão do NIH P20GM103499, SC INBRE. O MCF também recebe apoio da concessão do NIH P20GM109091. Yvon Woappi foi apoiado em parte por bolsas nih 2R25GM066526-06A1 (PREP) e R25GM076277 (IMSD), e por uma Bolsa pelo Programa de Professores Grace Jordan McFadden da UofSC. Geraldine Ezeka e Justin Vercellino foram apoiados por bolsas NIH 2R25GM06526-10A1 (PREP) na UofSC. Sean M. Bloos foi apoiado pelo Prêmio Magellan Scholar 2016 na UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
