Creazione di un sistema di coltura sferoide epidermica ad alto rendimento per modellare la plasticità delle cellule staminali dei cheratinociti
Summary
Qui descriviamo un protocollo per la coltivazione sistematica di sferoidi epidermici in coltura di sospensione 3D. Questo protocollo ha applicazioni ad ampio raggio per l’uso in una varietà di tipi di tessuto epiteliale e per la modellazione di diverse malattie e condizioni umane.
Abstract
La disregolazione epiteliale è un nodo per una varietà di condizioni e disturbi umani, tra cui ferite croniche, infiammazione e oltre l’80% di tutti i tumori umani. Come tessuto di rivestimento, l’epitelio cutaneo è spesso soggetto a lesioni e si è adattato evolutivamente acquisendo la plasticità cellulare necessaria per riparare il tessuto danneggiato. Nel corso degli anni, sono stati fatti diversi sforzi per studiare la plasticità epiteliale utilizzando modelli cellulari in vitro ed ex vivo. Tuttavia, questi sforzi sono stati limitati nella loro capacità di ricapitolare le varie fasi della plasticità cellulare epiteliale. Descriviamo qui un protocollo per la generazione di sferoidi epidermici 3D e cellule derivate da sferoidi epidermici da cheratinociti umani neonatali primari. Questo protocollo delinea la capacità delle colture sferoidi epidermiche di modellare funzionalmente stadi distinti della plasticità generativa dei cheratinociti e dimostra che la ri-placcatura sferoide epidermica può arricchire colture eterogenee normali di cheratinociti umani (NHKc) per sottopopolazioni di integrinaα6hi/ EGFRlo cheratinociti con caratteristiche staminali migliorate. Il nostro rapporto descrive lo sviluppo e il mantenimento di un sistema ad alto rendimento per lo studio della plasticità dei cheratinociti cutanei e della rigenerazione epidermica.
Introduction
L’epitelio stratificato dei mammiferi è l’architettura epiteliale più complessa in tutti i sistemi viventi ed è più spesso soggetto a danni e lesioni. Come tessuto protettivo, l’epitelio stratificato si è evoluto per generare una risposta complessa ed efficace al danno tissutale. In caso di lesione, queste cellule devono attivare programmi di plasticità di lignaggio, che consentono loro di migrare verso il sito ferito ed eseguire la riparazione1,2,3. Questa risposta sfaccettata si verifica in diversi passaggi sequenziali che rimangono poco compresi.
Uno dei principali ostacoli nello studio dell’intricato processo di rigenerazione epiteliale risiede nella scarsità di sistemi modello ad alto rendimento in grado di catturare attività cellulari dinamiche in fasi definite della rigenerazione cellulare. Mentre i modelli murini in vivo offrono informazioni rilevanti sulla guarigione delle ferite e ricapitolano più da vicino il processo rigenerativo umano, il loro sviluppo richiede sforzi laboriosi e costi significativi, limitando la loro capacità di produzione. Esiste, quindi, una necessità critica di stabilire sistemi che consentano l’indagine funzionale della rigenerazione del tessuto epiteliale umano ad alta scala di produttività.
Negli ultimi anni, sono stati fatti diversi tentativi per affrontare la sfida della scalabilità. Ciò è visto attraverso una grande espansione di modelli innovativi in vitro ed ex vivo basati su cellule che imitano da vicino il contesto rigenerativo in vivo. Ciò include i progressi in organ-on-chip4, sferoide5, organoide6e colture organotipiche7. Questi sistemi 3D basati su celle offrono vantaggi unici e presentano limiti sperimentali distinti. Ad oggi, la coltura sferoidale rimane il modello di coltura cellulare 3D più economico e ampiamente utilizzato. E mentre diversi rapporti hanno indicato che le colture sferoidi possono essere utilizzate per studiare le caratteristiche delle cellule staminali della pelle, questi studi sono stati in gran parte condotti con tessuto animale8,9o con fibroblastidermici 10, con praticamente nessun rapporto che caratterizzi a fondo le proprietà rigenerative delle colture sferoidi epidermiche umane. In questo protocollo descriviamo in dettaglio lo sviluppo funzionale, la coltura e il mantenimento di colture sferoidi epidermiche da cheratinociti umani normali (NHKc). Descriviamo anche l’utilità di questo sistema per modellare le fasi sequenziali della rigenerazione epidermica e la plasticità delle cellule staminali dei cheratinociti in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di sistemi di coltura sferoidale 3D ha avuto un’ampia utilità nella valutazione della staminalità delle cellule. Questi sistemi hanno dimostrato di migliorare l’arricchimento delle cellule staminali tissutali13, ma la loro utilità per lo studio delle cellule staminali epidermiche umane è stata esplorata in modo limitato. Qui, descriviamo una strategia per arricchire le cellule staminali dei cheratinociti umani utilizzando tecniche di coltura 3D. In questo sistema, gli NHKc sono coltivati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) ha fornito l’accesso alle apparecchiature di imaging e smistamento cellulare e all’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione 1R21CA201853. L’MCF e l’IRF ricevono un sostegno parziale dalla sovvenzione NIH P20GM103499, SC INBRE. L’MCF riceve anche il supporto della sovvenzione NIH P20GM109091. Yvon Woappi è stato supportato in parte dalle sovvenzioni NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) e R25GM076277 (IMSD) e da una borsa di studio del Grace Jordan McFadden Professors Program presso uofSC. Geraldine Ezeka e Justin Vercellino sono stati supportati dalle sovvenzioni NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) presso UofSC. Sean M. Bloos è stato supportato dal Magellan Scholar Award 2016 presso l’UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
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