כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפוח שיטתי של כדורי אפידרמיס בתרבות השעיה תלת-ממדית. פרוטוקול זה כולל יישומים נרחבים לשימוש במגוון סוגי רקמות אפיתל ולדוגמנות של מספר מחלות ותנאים אנושיים.
דיסרגציה אפיתל היא צומת עבור מגוון רחב של מצבים אנושיים ומחלות, כולל פצעים כרוניים, דלקת, ומעל 80% של כל סוגי הסרטן האנושי. כרקמת בטנה, אפיתל העור נתון לעתים קרובות לפציעה והותאם אבולוציונית על ידי רכישת הפלסטיות התאית הדרושה לתיקון רקמות פגומות. במהלך השנים נעשו מספר מאמצים לחקור פלסטיות אפיתל באמצעות מודלים מבוססי תאי במבחנה ואקס ויוו. עם זאת, מאמצים אלה הוגבלו ביכולתם לשחזר את השלבים השונים של פלסטיות תאי האפיתל. אנו מתארים כאן פרוטוקול ליצירת כדורי אפידרמיס תלת-ממדיים ותאים שמקורם בספירואיד אפידרמלי מקריטינוציטים אנושיים יילודים ראשוניים. פרוטוקול זה מתאר את היכולת של תרביות ספרואיד אפידרמיס מודל פונקציונלי שלבים נפרדים של פלסטיות יוצרת קרטינוציטים ומדגים כי ציפוי מחדש של כדורי אפידרמלי יכול להעשיר תרביות קרטינוציטים אנושיים נורמליים הטרוגניים (NHKc) עבור integrinα6hi/ EGFRlo keratinocyte subpocyte עם מאפיינים דמויי גזע משופרים. הדו”ח שלנו מתאר את הפיתוח והתחזוקה של מערכת תפוקה גבוהה לחקר פלסטיות קרטינוציטים בעור והתחדשות אפידרמלית.
האפיתל המרובד של היונקים הוא הארכיטקטורה האפיתלית המורכבת ביותר בכל מערכות החיים, והוא נתון לרוב לנזק ופציעה. כרקמת הגנה, אפיתל רבדים התפתח כדי ליצור תגובת נזק לרקמות מורכבת ויעילה. עם הפגיעה, תאים אלה חייבים להפעיל תוכניות פלסטיות שושלת, המאפשרות להם לנדוד לאתר הפגוע ולבצעתיקון 1,2,3. תגובה רבת פנים זו מתרחשת במספר שלבים רציפים שנותרו מובנים היטב.
מכשול מרכזי בחקר התהליך המורכב של התחדשות אפיתל טמון במחסור במערכות מודל תפוקה גבוהה שיכולות ללכוד פעילויות תאיות דינמיות בשלבים מוגדרים של התחדשות תאים. בעוד שמודלים של עכברי vivo מציעים תובנה רלוונטית על ריפוי פצעים ומחדשים מקרוב את תהליך ההתחדשות האנושית, ההתפתחות שלהם דורשת מאמצים מייגעים ועלות משמעותית, ומגבילה את יכולת התפוקה שלהם. קיים, אם כן, צורך קריטי בהקמת מערכות המאפשרות חקירה תפקודית של התחדשות רקמת אפיתל אנושית בקנה מידה גבוה של תפוקה.
בשנים האחרונות נעשו מספר ניסיונות לעמוד באתגר המדרגיות. זה בא לידי ביטוי באמצעות התרחבות גדולה של דגמים חדשניים במבחנה ובאקס ויוו המבוססים על תאים המחקים מקרוב את ההקשר המתחדש של in vivo. זה כולל התקדמות איבר על שבב4,ספרואיד5,organoid6, ותרבויות אורגנוטיפיות7. מערכות תלת-ממדיות אלה מבוססות תא כל אחת מציעות יתרונות ייחודיים ומציגות מגבלות ניסיוניות ברורות. עד כה, תרבות כדורית נותרה המודל החסכוני ביותר של תרבית תאים תלת-ממדית בשימוש נרחב. ובעוד מספר דיווחים הצביעו על כך שניתן להשתמש בתרביות כדוריות כדי לחקור את מאפייני תאי הגזע של העור, מחקרים אלה נערכו במידה רבה עם רקמת בעלי חיים8,9, או עם פיברובלסטים עוריים10, עם כמעט שום דיווחים המאפיינים ביסודיות את המאפיינים המתחדשים של תרביות ספרואיד אפידרמיס אנושיות. בפרוטוקול זה אנו מפרטים את ההתפתחות התפקודית, התרבות והתחזוקה של תרביות כדוריות אפידרמיסיות מקרטינוציטים אנושיים רגילים (NHKc). אנו מתארים באותה מידה את התועלת של מערכת זו כדי לדגמן את השלבים הרציפים של התחדשות אפידרמלית ופלסטיות תאי גזע קרטינוציט במבחנה.
השימוש במערכות תרבית כדורית תלת-ממדית היה בעל תועלת רחבה בהערכת גזע התאים. מערכות אלה הוכחו כדי לשפר את העשרה של תאי גזערקמה 13, עדיין התועלת שלהם לחקר תאי גזע אפידרמיס אנושי נחקרה באופן מוגבל. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה להעשרת תאי גזע קרטינוציטים אנושיים בטכניקות תרבית תלת-ממדי?…
The authors have nothing to disclose.
בית הספר לרפואה UofSC מתקן משאבים מכשור (IRF) סיפק גישה ציוד הדמיה ומיון תאים וסיוע טכני. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק 1R21CA201853. ה- MCF וה- IRF מקבלים תמיכה חלקית ממענק NIH P20GM103499, SC INBRE. ה- MCF מקבל גם תמיכה ממענק NIH P20GM109091. איבון וופי נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) ו- R25GM076277 (IMSD), ועל ידי מלגה על ידי גרייס ג’ורדן מקפאדן פרופסורים תוכנית UofSC. ג’רלדין אזקה וג’סטין Vercellino נתמכו על ידי מענקי NIH 2R25GM0666526-10A1 (PREP) ב UofSC. שון מ. בלוס נתמך על ידי פרס מגלן מלומד לשנת 2016 באוניברסיטת UofSC.
Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |