Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.
Abstract
Epitheliale dysregulatie is een knooppunt voor een verscheidenheid aan menselijke aandoeningen en kwalen, waaronder chronische wondvorming, ontsteking en meer dan 80% van alle menselijke kankers. Als voeringsweefsel is het huidepitheel vaak onderhevig aan letsel en heeft het zich evolutionair aangepast door de cellulaire plasticiteit te verkrijgen die nodig is om beschadigd weefsel te herstellen. In de loop der jaren zijn verschillende inspanningen geleverd om epitheliale plasticiteit te bestuderen met behulp van in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen. Deze inspanningen zijn echter beperkt in hun vermogen om de verschillende fasen van epitheliale celplasticiteit samen te vatten. We beschrijven hier een protocol voor het genereren van 3D epidermale sferoïden en epidermale sferoïde-afgeleide cellen van primaire neonatale menselijke keratinocyten. Dit protocol schetst het vermogen van epidermale sferoïde culturen om functioneel verschillende stadia van keratinocyt generatieve plasticiteit te modelleren en toont aan dat epidermale sferoïde re-plating heterogene normale menselijke keratinocyten (NHKc) culturen kan verrijken voor integrinα6hi/EGFRlo keratinocyt subpopulaties met verbeterde stamachtige kenmerken. Ons rapport beschrijft de ontwikkeling en het onderhoud van een systeem met hoge doorvoer voor de studie van de plasticiteit van keratinocyt en epidermale regeneratie van de huid.
Introduction
Het zoogdier gelaagde epitheel is de meest complexe epitheelarchitectuur in alle levende systemen en is meestal onderhevig aan schade en letsel. Als beschermend weefsel is gelaagd epitheel geëvolueerd om een complexe en effectieve weefselschaderespons te genereren. Bij letsel moeten deze cellen afstammingsplasticiteitsprogramma’s activeren, waarmee ze naar de gewonde plaats kunnen migreren en reparatie1,2,3kunnen uitvoeren. Deze veelzijdige reactie vindt plaats in verschillende opeenvolgende stappen die slecht begrepen blijven.
Een belangrijk obstakel bij het bestuderen van het ingewikkelde proces van epitheliale regeneratie ligt in het gebrek aan modelsystemen met hoge doorvoer die dynamische cellulaire activiteiten kunnen vastleggen in gedefinieerde stadia van celregeneratie. Hoewel in vivo muismodellen relevant inzicht bieden in wondgenezing en het menselijk regeneratieve proces het meest nauwkeurig samenvatten, vereist hun ontwikkeling moeizame inspanningen en aanzienlijke kosten, waardoor hun doorvoercapaciteit wordt beperkt. Er bestaat daarom een kritieke behoefte aan het opzetten van systemen die functioneel onderzoek van menselijke epitheliale weefselregeneratie op hoge doorvoerschaal mogelijk maken.
In de afgelopen jaren zijn verschillende pogingen gedaan om de schaalbaarheidsuitdaging aan te gaan. Dit wordt gezien door een grote uitbreiding van innovatieve in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen die de in vivo regeneratieve context nauw nabootsen. Dit omvat vooruitgang in organ-on-chip4, sferoïde5, organoïde6en organotypische culturen7. Deze 3D-celgebaseerde systemen bieden elk unieke voordelen en bieden verschillende experimentele beperkingen. Tot op heden blijft sferoïde cultuur het meest kosteneffectieve en meest gebruikte 3D-celcultuurmodel. En hoewel verschillende rapporten hebben aangegeven dat sferoïde culturen kunnen worden gebruikt om huidstamcelkenmerken te bestuderen, zijn deze studies grotendeels uitgevoerd met dierlijk weefsel8,9, of met huidfibroblasten10, met vrijwel geen rapporten die de regeneratieve eigenschappen van menselijke epidermale sferoïdeculturen grondig karakteriseren. In dit protocol beschrijven we de functionele ontwikkeling, cultuur en het onderhoud van epidermale sferoïde culturen van normale menselijke keratinocyten (NHKc). We beschrijven ook het nut van dit systeem om de sequentiële fasen van epidermale regeneratie en keratinocytstamcelplasticiteit in vitro te modelleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van 3D-sferoïde kweeksystemen heeft een breed nut gehad bij het beoordelen van celstamheid. Het is aangetoond dat deze systemen de verrijking van weefselstamcellenverbeteren 13, maar hun nut voor de studie van menselijke epidermale stamcellen is beperkt onderzocht. Hier beschrijven we een strategie voor het verrijken van menselijke keratinocytstamcellen met behulp van 3D-cultuurtechnieken. In dit systeem worden NHKc gekweekt als zelfassemblage multicellulaire sferoïde suspensuspensen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bood toegang tot beeldvormings- en celsorteerapparatuur en technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door subsidie 1R21CA201853. De MCF en de IRF ontvangen gedeeltelijke steun van NIH-subsidie P20GM103499, SC INBRE. Het MCF ontvangt ook steun van NIH-subsidie P20GM109091. Yvon Woappi werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-06A1 (PREP) en R25GM076277 (IMSD), en door een Fellowship door het Grace Jordan McFadden Professors Program aan UofSC. Geraldine Ezeka en Justin Vercellino werden ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-10A1 (PREP) bij UofSC. Sean M. Bloos werd ondersteund door de Magellan Scholar Award 2016 bij UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
