إنشاء نظام ثقافة البشرة عالية الإنتاجية لنمذجة اللدونة الخلايا الجذعية Keratinocyte
Summary
هنا نحن نصف بروتوكول للزراعة المنهجية للشفرات البشرة في ثقافة التعليق ثلاثي الأبعاد. هذا البروتوكول له تطبيقات واسعة النطاق للاستخدام في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة الظهارية ولنمذجة العديد من الأمراض والحالات البشرية.
Abstract
dysregulation الظهارية هي عقدة لمجموعة متنوعة من الحالات والأمراض البشرية، بما في ذلك الجرح المزمن، والالتهاب، وأكثر من 80٪ من جميع أنواع السرطان البشري. كما بطانة الأنسجة، وظهارة الجلد غالبا ما تكون عرضة للإصابة وتكييفها تطوريا عن طريق الحصول على اللدونة الخلوية اللازمة لإصلاح الأنسجة التالفة. على مر السنين، بذلت عدة جهود لدراسة اللدونة الظهارية باستخدام نماذج في المختبر وخلايا الجسم الحي السابق. ومع ذلك، كانت هذه الجهود محدودة في قدرتها على تلخيص المراحل المختلفة من اللدونة الخلية الظهارية. نحن نصف هنا بروتوكولا لتوليد كرويدات البشرة ثلاثية الأبعاد والخلايا المشتقة من البشرة المشتقة من خلايا القرنية البشرية الوليدية الأولية. يحدد هذا البروتوكول قدرة ثقافات كروية البشرة على نموذج مراحل متميزة وظيفيا من اللدونة التوليدية للكيراتينية ويوضح أن إعادة طلاء كروية البشرة يمكن أن تثري ثقافات الكيراتينيات البشرية غير المتجانسة (NHKc) ل integrinα6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations مع خصائص معززة تشبه الجذعية. يصف تقريرنا تطوير وصيانة نظام إنتاجية عالية لدراسة اللدونة الكيراتينية الجلدية وتجديد البشرة.
Introduction
الظهارة الطبقية الثديية هي البنية الظهارية الأكثر تعقيدا في جميع الأنظمة الحية وغالبا ما تكون عرضة للتلف والإصابة. كما النسيج الواقي، تطورت ظهارة طبقية لتوليد استجابة معقدة وفعالة تلف الأنسجة. عند الإصابة ، يجب على هذه الخلايا تنشيط برامج اللدونة النسب ، والتي تمكنها من الهجرة إلى الموقع المصاب وتنفيذ إصلاح1،2،3. تحدث هذه الاستجابة متعددة الأوجه في عدة خطوات متتابعة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.
وتكمن إحدى العقبات الرئيسية في دراسة العملية المعقدة للتجديد الظهاري في ندرة نظم نماذج الإنتاجية العالية التي يمكن أن تلتقط الأنشطة الخلوية الديناميكية في مراحل محددة من تجديد الخلايا. بينما في نماذج الماوس في الجسم الحي تقدم نظرة ثاقبة ذات الصلة في التئام الجروح وتلخيص عن كثب عملية تجديد الإنسان، وتطويرها تتطلب جهودا شاقة وتكلفة كبيرة، والحد من قدرتها الإنتاجية. ولذلك، هناك حاجة ماسة لإنشاء نظم تمكن من إجراء تحقيق وظيفي في تجديد الأنسجة الظهارية البشرية على نطاق عال من الإنتاجية.
وفي السنوات الأخيرة، بذلت عدة محاولات لمواجهة التحدي المتمثل في قابلية التوسع. وينظر إلى هذا من خلال التوسع الكبير في النماذج المبتكرة في المختبر وسابقا فيفو الخلية القائمة على أن تحاكي عن كثب في السياق التجديدي في الجسم الحي. وهذا يشمل التقدم في الجهاز على رقاقة4, كروية5, organoid6, والثقافات organotypic7. هذه الأنظمة القائمة على الخلايا ثلاثية الأبعاد تقدم كل مزايا فريدة من نوعها وتقدم قيودا تجريبية متميزة. حتى الآن، لا تزال ثقافة كروية النموذج الأكثر فعالية من حيث التكلفة واستخدامها على نطاق واسع ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. وبينما أشارت العديد من التقارير إلى أنه يمكن استخدام ثقافات كروية لدراسة خصائص الخلايا الجذعية للبشرة ، فقد أجريت هذه الدراسات إلى حد كبير مع الأنسجة الحيوانية8،9، أو مع الخلايا الليفية الجلدية10، مع عدم وجود تقارير تقريبا تميز بدقة الخصائص التجديدية للثقافات الكروية البشرة البشرية. في هذا البروتوكول نحن بالتفصيل التنمية الوظيفية، والثقافة، والحفاظ على الثقافات كروية البشرة من الخلايا القرنية البشرية العادية (NHKc). نحن نفس القدر من وصف فائدة هذا النظام لنموذج مراحل متتابعة من تجديد البشرة واللدونة الخلايا الجذعية keratinocyte في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان لاستخدام أنظمة زراعة كروية ثلاثية الأبعاد فائدة واسعة في تقييم جذع الخلايا. وقد ثبت هذه النظم لتعزيز إثراء الخلايا الجذعية الأنسجة13, ومع ذلك فقد تم استكشاف فائدتها لدراسة الخلايا الجذعية البشرة البشرية محدودة. هنا، ونحن نصف استراتيجية لإثراء الخلايا الجذعية الكيراتينية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
100- ووفر مرفق موارد كلية الطب التابعة لمدرسة UofSC إمكانية الوصول إلى معدات التصوير وفرز الخلايا والمساعدة التقنية. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنحة 1R21CA201853. يتلقى صندوق تحدي الألفية والمعهد دعما جزئيا من منحة المعاهد القومية للصحة P20GM103499، SC INBRE. كما يتلقى الصندوق الدعم من منحة المعاهد القومية للصحة P20GM109091. تم دعم إيفون وابي جزئيا من خلال منح المعاهد القومية للصحة 2R25GM066526-06A1 (PREP) وR25GM076277 (IMSD) ، وزمالة من قبل برنامج أساتذة غريس جوردان ماكفادن في UofSC. تم دعم جيرالدين حزيكا وجاستن فيرسيلينو من قبل المعاهد القومية للصحة منح 2R25GM066526-10A1 (PREP) في UofSC. حصل شون م. بلووس على دعم جائزة ماجلان للباحث لعام 2016 في جامعة أوفوس.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
