Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY
Summary
Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.
Abstract
El método de delipidación de hidrogel tisular (CLARITY), desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth, ha sido modificado y ampliamente utilizado para la inmunotensación y la obtención de imágenes de muestras cerebrales gruesas. Sin embargo, esta tecnología avanzada aún no se ha utilizado para retinas de montaje completo. Aunque la retina es parcialmente transparente, su grosor de aproximadamente 200 μm (en ratones) todavía limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como la reducción de la penetración de la luz para imágenes de alta resolución. Aquí, adaptamos el método CLARITY para retinas de ratón de montaje completo polimerizándolas con un monómero de acrilamida para formar un hidrogel nanoporoso y luego despejandolas en sulfato de dodecil sódico para minimizar la pérdida de proteínas y evitar daños tisulares. las retinas CLARIDAD-procesadas immunostained con los anticuerpos para las neuronas retinianas, las células glial, y las proteínas sinápticas, montadas en una solución que emparejaba del índice de refracción, e imagendas. Nuestros datos demuestran que la CLARIDAD puede mejorar la calidad de la coloración e proyección de imagen immunohistochemical estándar para las neuronas retinianas y las células glial en la preparación del entero-montaje. Por ejemplo, la resolución 3D de las estructuras ariíticas y axones finos de las células dopaminérgicas de amacrina fueron mejoradas mucho por CLARITY. En comparación con las retinas de montaje completo no procesadas, CLARITY puede revelar inmunotensión de proteínas sinápticas como la proteína de densidad postsináptica 95. Nuestros resultados muestran que la CLARIDAD hace la retina más ópticamente transparente después de la eliminación de lípidos y preserva las estructuras finas de las neuronas de la retina y sus proteínas, que se pueden utilizar rutinariamente para la obtención de imágenes de alta resolución de las neuronas de la retina y sus estructuras subcelulares en la preparación de montaje completo.
Introduction
La retina de los vertebrados es quizás la parte más accesible del sistema nervioso central (SNC), y sirve como un excelente modelo para estudiar el desarrollo, la estructura y la función del cerebro. Cinco clases de neuronas en la retina se distribuyen en tres capas nucleares separadas por dos capas plexiformes. La capa nuclear externa (ONL) consiste en fotorreceptores clásicos (varillas y conos) que convierten la luz en señales eléctricas. Las señales eléctricas son procesadas por las neuronas en la capa nuclear interna (INL), incluyendo las células bipolares, horizontales y amacrinas, y luego transmitidas a las células ganglionares de la retina (CRG) en la capa de células ganglionares (GCL). Los CRG son las neuronas de salida de la retina, con los axones que se proyectan hacia el cerebro para contribuir a la función visual formadora y no formadora de imágenes. Además, tres tipos de células gliales (células de Muller, astroglia y microglía) proporcionan nutrientes a las neuronas y protegen a las neuronas de los cambios dañinos en su entorno extracelular.
Una subpoblación especializada de células amacrinas produce y libera dopamina, un importante neuromodulador en el SNC, reconfigurando los circuitos neuronales de la retina durante la adaptación a la luz1,2. Las células dopaminérgicas del amacrine (DAC) tienen una característica única de perfiles morfológicos. Sus somatas se localizan en el INL proximal con dendritas que se ramifican en la parte más distal de la capa plexiforme interna (IPL). Axón-como los procesos de DAC son unmyelinated, delgado y largo, escasamente ramificado, y varicosidades del oso (los sitios del lanzamiento de la dopamina). Forman un plexo denso con dendritas en el IPL, incluyendo estructuras en forma de anillo alrededor de la somata de las células amacrinas AII. Los axones también corren a través del INL hacia el OPL, formando una vía centrífuga a través de la retina3. Hemos demostrado que dac procesa receptores expresos en respuesta a la liberación de glutamato de las neuronas presinápticas, incluyendo las células bipolares y las células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs)4,5,6. Sin embargo, no está claro si los receptores de glutamato se expresan en los axones, dendritas o ambos, ya que están cortados en secciones verticales de la retina y no se pueden distinguir entre sí5,6. Immunostaining necesita ser realizado en retinas de montaje completo para revelar la ramificación tridimensional de DAC y la presencia de receptores del glutamato en compartimientos subcelulares. Aunque la retina es relativamente transparente, el grosor de una retina de montaje completo de ratón es de aproximadamente 200 μm, lo que limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como reduce la penetración de la luz para imágenes de alta resolución debido a la dispersión de la luz del tejido. Para superar estas limitaciones, adaptamos el método de delipidación de hidrogel tisular compatible con inmunosuficiente (CLARITY) desarrollado recientemente para secciones cerebrales gruesas a retinas de ratón de montaje completo7.
El método CLARITY fue desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth para inmunosupertenimiento e imágenes de muestras cerebrales gruesas7. Utiliza un detergente fuerte, sulfato de dodecil sódico (SDS) y electroforesis para eliminar los componentes lipídicos (que causan la dispersión de la luz del tejido), dejando las proteínas y los ácidos nucleicos en su lugar. Los lípidos eliminados se reemplazan con un andamio transparente compuesto de monómeros de hidrogel como la acrilamida para apoyar la estructura proteica restante. El tejido despejado se puede etiquetar a través de inmunohistoquímica y tomar imágenes con una profundidad de penetración de luz sustancialmente mayor a través del tejido (hasta varios milímetros por debajo de la superficie del tejido). Desde entonces, el método CLARITY ha sido optimizado y simplificado por varios grupos de investigación8,9,10. Un protocolo CLARITY modificado utiliza una técnica pasiva de limpieza para evitar el posible daño tisular producido por la electroforesis para limpiar todo el cerebro y otros órganos intactos11. Sin embargo, este método todavía no se ha aplicado a las retinas de montaje completo. Aquí, adaptamos la técnica pasiva de la CLARIDAD para las retinas del entero-montaje para hacerlas más transparentes para immunohistochemistry y la proyección de imagen. Encontramos que preservaron a una mayoría de las proteínas retinianas probadas durante este proceso para immunohistochemistry. Utilizando la solución de coincidencia de índice de refracción, pudimos obtener imágenes de neuronas de la retina a través de los aproximadamente 200 μm de espesor de la ONL a la GCL en retinas de montaje completo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificación del protocolo CLARITY para las retinas de montaje completo.
Hemos simplificado el protocolo CLARITY para lograr una polimerización adecuada sin necesidad de una cámara de evacuación o desecación al vacío, como se utiliza en la mayoría de los estudios previos7,9,11. El proceso de polimerización es inhibido por el oxígeno, requiriendo que la muestra sea aislada del aire durante la etapa de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Bing Ye, Nathan Spix y Hao Liu por su soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Becas de Salud EY022640 (D.-Q.Z.) y oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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